Summary
В этом случае мы представляем подробный протокол для скрининга небольших пептидов, которые связываются с FGFR2 с помощью фаговычного дисплея пептидной библиотеки. Мы также анализируем сродство выбранных пептидов к FGFR2 in vitro и его способность подавлять пролиферацию клеток.
Abstract
Человеческий рецептор фактора роста (FGFR) состоит из четырех членов, а именно, FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, которые участвуют в различных биологических деятельности, включая распространение клеток, выживание, миграцию и дифференциацию. Несколько аберраций в сигнальном пути FGFR, из-за мутаций или событий усиления генов, были выявлены в различных типах рака. Таким образом, последние исследования были сосредоточены на разработке стратегий, связанных с терапевтической ориентации FGFR. Текущие ингибиторы FGFR на различных стадиях доклинического и клинического развития включают либо небольшие молекулы ингибиторы тирозина киназы или моноклональных антител, с только несколько пептидных ингибиторов в трубопроводе. Здесь мы предоставляем протокол с использованием технологии фагового дисплея для проверки небольших пептидов в качестве антагонистов FGFR2. Короче говоря, библиотека фаговычных пептидов была инкубирована в тарелку, покрытую FGFR2. Впоследствии несвязанный фаг был смыт TBST (TBS - 0,1% "v/v" Tween-20), а связанный фаг был смыт с буфером 0,2 М глицин-HCl (pH 2.2). Элеттогенный фаг был дополнительно усилен и использован в качестве ввода для следующего раунда биопанирования. После трех раундов биопанирования пептидные последовательности отдельных фаговых клонов были идентифицированы по секвенированию ДНК. Наконец, экранированные пептиды были синтезированы и проанализированы на сродство и биологическую активность.
Introduction
Рецепторы фактора роста фибробластов (FGFRs) играют ключевую роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе in vivo1. Аномальная активация FGFR сигнализации наблюдается в различных опухолей2,3,4,5включает в себя усилениегенов, генные мутации, хромосомные аберрации, и чрезмерной лиганд секреции6 . Многие ингибиторы, нацеленные на FGFR, показали многообещающее терапевтическое воздействие в клинических испытаниях и в основном классифицируются на три типа: (1) малые ингибиторы киназы молекулы, которые связываются с внутриклеточной областью FGFR, (2) антагонисты ориентации внеклеточного сегмента, и (3) FGF лиганд ловушки6. Хотя некоторые из небольших ингибиторов киназы молекулы имеют хорошие терапевтические эффекты как in vitro, так и in vivo7,большинство из них имеют плохую целевую специфичность и показывают неблагоприятные эффекты, такие как гипертония8. Большинство антагонистов являются моноклональные антитела9,10 и полипептиды11. Пептиды имеют преимущества перед небольшими молекулами из-за их специфичности и более низких побочных эффектов. Они также сохраняют проницаемость клеток и не накапливаются в определенных органах по сравнению с белковыми препаратами12. Таким образом, целевые небольшие пептиды являются как эффективными, так и перспективными терапевтическими агентами.
Технология отображения фагов является простым, но мощным инструментом для выявления небольших пептидов, которые могут связываться с данной молекулой13,14,15. Мы использовали фаговык пептид библиотеки, которая основана на простой m13 фаг с более чем 109 различных пептидных последовательностей отображается на хвосте для связывания с целевой молекулы (см. Таблица материалов)16. Из-за высокой сродства фагов к данной молекуле, несвязанные фаги могут быть смыты, и сохраняются только плотно связанные фаги с желаемыми короткими пептидами. Данные молекулярные цели могут быть обездвижены белки17,18,углеводы, культивированные клетки, или даже неорганические материалы19,20. Захватывающий случай был зарегистрирован, где орган конкретных пептидов были выбраны in vivo с использованием технологии фагового дисплея21. Преимущества технологии фагового дисплея включают высокую пропускную плату, простоту работы, низкую стоимость и широкий спектр приложений22.
В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол скрининга малых пептидов, связывающихся с обездвиженным белком (FGFR2) с помощью библиотеки фагового дисплея. Эффективность технологии также изучена путем измерения сродства полученного пептида к FGFR2 по истермальной калорийности титрации (ITC), и биологической активности путем исследования пролиферации клеток. Метод может быть расширен для скрининга небольших пептидов, которые связываются с углеводами, культивированными клетками или даже неорганическими материалами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагента
- LB (лисогенный бульон) средний: Растворите 1 г триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта и 0,5 г NaCl в 100 мл H2O. Autoclave и храните при 4 градусах Цельсия.
- Тетрациклин запас: Подготовка 20 мг/мл в 1:1 этанол: H2O. Хранить при -20 градусов по Цельсию, и вихрь перед использованием.
- IPTG/X-gal решение: Смешайте 0,5 г IPTG (изопропил -D-1-thiogalactopyranoside) и 0,4 г X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-D-галактозид) в 10 мл DMF (диметилформамид). Раствор можно хранить при -20 градусов в течение одного года в темноте.
- Пластины Тетрациклина (Тет): Dissove 1 г бакто-триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl и 1,5 г агара в 100 мл H2O. Autoclave и охлаждается до йlt; 70 градусов по Цельсию. Добавьте 100 л тетрациклина и залить тарелками. Храните тарелки при 4 градусах по Цельсию в темноте.
- Пластины LB IPTG/X-gal: Растворите 1 г бакто-триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl и 1,5 г агара в 100 мл H2O. Autoclave и охладите до йlt; 70 градусов по Цельсию. Добавьте 100 кЛ раствора IPTG/X-gal и залить тарелками. Храните тарелки при 4 градусах по Цельсию в темноте.
- Glycine-HCI буфер (0,2 М): Растворить 1,5014 г глицина и 100 мг BSA (бычья сыворотка альбумина) в 100 мл H2O и настроить рН до 2,2 с HCl. Фильтр решение с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Буфер Tris-HCl (1 M): Растворите 12,11 г Триса (трис (гидроксиметил) аминометана в 100 мл H2O и отрегулируйте рН до 9,1 с HCl. Autoclave и храните при 4 градусах Цельсия.
- Буфер покрытия (0,1 М): Растворите 1,68 г NaHCO3 в 200 мл H2O и отрегулируйте рН до 8,6 с Помощью NaOH. Фильтр урешение с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Блокирующий буфер: Приготовьте 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) с 5 мг/мл BSA. Фильтр урешение с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
- TBS: Подготовка 50 мм Tris-HCl (pH 7.5) с 150 мМ NaCl. Автоклав и хранить при комнатной температуре.
- 0.05%, 0.1%, или 0.5% TBST: Подготовьте TBS с 0.05%, 0.1%, или 0.5% (v/v) Tween-20. Фильтр с помощью фильтра 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.
- PEG/NaCl: Подготовка 20% (w/v) полиэтилена гликоль-8000 с 2,5 M NaCl. Автоклав и хранить при комнатной температуре.
- TE решение: Смешайте 1 мл 1 М Tris-HCl (pH8.0) и 2 мл 50 мМ EDTA (pH 8.0) и отрегулируйте объем до 100 мл с H2O. Autoclave и хранить при комнатной температуре.
- Буфер Iodide: Растворите 30 г NaI в 50 мл TE, рН 8.0. Храните раствор при комнатной температуре в темноте.
- Верхний агар: Растворите 1 г триптона, 0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 г NaCl и 0,7 г агарина в 100 мл H2O. Autoclave и распределите в 15 мл аликотов. Хранить при комнатной температуре для использования.
2. Первый раунд биопанизации: Скрининг фаговых клонов, которые связываются с внеклеточной областью FGFR2
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте аэрозольо устойчивые пипетки советы и носить перчатки для всех протоколов для того, чтобы свести к минимуму загрязнение с экологическими бактериофагами.
- Подготовьте 10 мкг/мл FGFR2 (Чистота йgt; 97%; см. Таблица материалов) решение в буфере покрытия. Добавьте 1 мл приготовленного раствора в блюдо 35 см2 и несколько раз закружайте до полного промокли поверхности. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия с встряхиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать выбора приманки целевых связующих, целевой белок должен быть сильно очищен. - Прививать 5 мл lb и Тет среды с Escherichia coli (E. coli) ER2738 в течение 5-10 часов при 37 градусов по Цельсию с встряхиванием. Усиленные er2738 клетки будут использованы для титрования в шаге 3.3.
- Слейте слой покрытия из тарелки (избыток раствора необходимо удалить) и добавьте блокирующий раствор. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию не менее 1 ч.
- Откажитесь от блокирующего раствора и быстро промойте TBST (TBS 0,05% (v/v' Tween-20). Избегайте высыхания блюда.
- Восстановите оригинальную фаговую библиотеку в 1 мл TBST (окончательная концентрация 1011 единиц бляшки (PFU)», добавьте к покрытому блюду и аккуратно нарисуйте 2 ч на шейкере при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта и вымойте блюдо 10x с TBST (TBS 0.05% (v/v) Tween-20), как выполняется в шаге 2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несвязанные фаги должны быть удалены тщательно энергичной стирки. - Выясните связанный фаг, добавив 1 мл 0,2 м гличина-HCl буфера (pH 2.2) к блюду и качания мягко в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Перенесите элюат в стерилизованные микрофуговые трубки и нейтрализуем ее 100 злиц омичем, рН 9.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В шаге 2.6, удалить несвязанный фage как можно больше, стиря блюдо 10x энергично. Это важный шаг. Элеттый фаг можно хранить при 4 градусах Цельсия в течение одной недели. Тем не менее, лучше всего перейти к следующему шагу как можно скорее.
3. Титер определение элетированных фагов
- Предварительно разогретые пластины LB и IPTG/X-gal, по крайней мере, 1 ч при 37 градусах Цельсия перед использованием.
- Подготовка 100 зл и 10-кратных серийных разбавлений (т.е. 101,102,103 и 104)из eluate от шага 2.8 в LB. Используйте советы с фильтром картриджи, чтобы избежать загрязнения.
- Пусть культура со ступени 2.2 достигнет фазы среднего входа (OD600 и 0.5). Распределите 200 л культуры в стерилизованные микрофуговые трубки, по одному для каждого элюатного разбавления.
- Чтобы инициировать инфекцию, добавьте 10 кЛ каждого разбавления от шага 3.2 к отдельным микрофуговым трубкам, содержащим культуру E. coli ER2738 со ступени 3.3. Вихрь быстро и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Пальто 90 л смеси от шага 3.4 в lb 'IPTG/X-gal пластины с покрытием палочки.
- Дополнительно растопите верхний агар в микроволновой печи, распределите 3 мл в стерильные тюбики культуры, по одному для каждого разбавления eluate, и поддерживать трубки при температуре 45 градусов по Цельсию. Перенесите смесь со ступени 3.4 в культурные трубки, содержащие верхний агар 45 градусов по Цельсию. Смешайте быстро и сразу же вылейте культуру на предварительно разогретую пластину LB/IPTG/X-gal. Аккуратно наклоните и поверните пластину, чтобы равномерно распределить верхний агар.
- После 5 мин, инвертировать и инкубировать пластины на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Подсчитайте таблички на плитах примерно с 100 бляшками. Умножьте каждое число на коэффициент разбавления для этой пластины, чтобы получить фаговый титр в PFU на 10 Л.
- Прививать еще 5 мл lb и Tet среды с E. coli ER2738 на 37 градусов по Цельсию ночь с встряхиванием для фагового усиления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуру ER2738 в середине этапа журнала (OD600 и 0.5) для фагового титра. Если большинство бляшек белые на пластинах X-gal/IPTG, это означает, что бассейн фага был загрязнен дикими бактериофагами. При загрязнении необходимо начать заново с панорамирования шагов из незагрязненного фагового стока.
4. Усиление фагов
- Разбавить (1:100) ночную культуру от шага 3.8 в 20 мл LB в колбе Erlenmeyer 250 мл. Добавить неусиленный eluate и инкубировать с энергичной встряхивания для 4,5 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Перенесите культуру в центрифугу и центрифугу в течение 10 мин при 12 000 х г при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в свежую трубку, центрифуге снова, и отбросить гранулы.
- Перенесите верхние 80% супернатанта в свежую трубку и добавьте к нему 1/6 тома 20% PEG/2.5 M NaCl. Разрешить фаг осаждать на 4 градуса Цельсия в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте культуру supernatant с PEG/2.5 M NaCl хорошо. - Центрифуги осажденный фаг на 12000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта, центрифуги снова, и удалить остаточный супернатант с пипеткой.
- Приостановите гранулы в 1 мл TBS и перенесите супернатант в микрофугую трубку. Центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Перенесите супернатант в свежую микрофугую трубку и снова осажесли, добавив 1/6 объема 20% PEG/2.5 M NaCl. Инкубировать на льду в течение 15-60 мин. Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта, повторно спина, и удалить остаточный супернатант с пипеткой.
- Приостановите гранулы в 200 Л ТБС и центрифугу на дополнительную минуту для удаления примесей. Перенесите супернатант в свежую микрофугую трубку, чтобы получить усиленный элюат.
- Титер усиленный фаг, как описано в разделе 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление усиленного элюата выше по сравнению с неусиленным eluate; серийные разбавления 108-1011, как правило, предлагается.
5. Второй раунд биопанирования
- Повторите разделы от 2 до 4.
- Титер второй раунд усиленного eluate на LB iPTG /X-гал пластин, как описано в разделе 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение концентрации покрытия белка FGFR2 до 5 мкг/мл. Используйте усиленный фаг со ступени 4.7 в качестве ввода и держите титр таким же, как и в первом раунде (1011 PFU). Сократите время инкубации фага и блюда с покрытием FGFR2 до 1 ч и увеличьте концентрацию Tween до 0,1% (v/v) в стирке.
6. Третий раунд биопанирования
- Повторите шаги 2.1-2.6.
- Выясните связанный фаг, добавив 1 мл раствора bFGF (лиганд для FGFR2) к блюду и осторожно раскачиваясь в течение 60 минут при комнатной температуре.
- Повторите шаги 3.1-3.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение концентрации покрытия белка FGFR2 до 2,5 мкг/мл. Используйте второй раунд усиленного фага из раздела 5 в качестве ввода и держите титр таким же, как и в первом раунде (1011 PFU). Сократите время инкубации фага и блюда с покрытием FGFR2 до 30 мин и увеличьте концентрацию Tween до 0,5% (v/v) в стирке.
7. Приобретение ДНК бляшек для секвенирования
- Усиление бляшек
- Разбавить (1:100) ночная культура ER2738 в LB. Распределите 1 мл разбавленной культуры в трубку 2 мл, по одному для каждого клона, который будет охарактеризован.
- Используйте наконечник пипетки, чтобы выбрать один хорошо разделенный синий цветной налет из титр пластины из раздела 6 и передачи в трубку, содержащую разбавленной культуры. Выберите в общей сложности 15 табличек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны быть злт; 1-3 дней, хранится при 4 кС, и имеют злот; 100 бляшек. - Инкубировать трубки с энергичной встряхивания в течение 4,5 ч при 37 градусах Цельсия.
- Перенесите культуры в центрифуги и центрифуги на 12000 х г в течение 30 с. Перенесите супернатант в свежую трубку и центрифугу снова.
- Используя пипетку, перенесите верхние 80% супернатанта на свежую трубку. Пометьте это как усиленный фагный запас.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить усиленный фаг с равным объемом 100% стерильный глицерол и хранить при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
- Извлечение ДНК бляшек
- Перенесите 500 л усиленного фага в свежую микрофугую трубку и добавьте объем 1/6 20% PEG/2.5 M NaCl. Перевернуть, чтобы перемешать и дать ему стоять в течение 10-20 минут при комнатной температуре.
- Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию, а затем слить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаг гранулы не могут быть видны. - Центрифуга снова. Аккуратно удалите все оставшиеся супернатанты.
- Тщательно отрежь гранулы в 100 злику буфера йода, энергично нажав трубку.
- Добавьте 250 л 100% этанола и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах по Цельсию и удалите супернатант. Вымойте гранулы с 0,5 мл 70% этанола, быстро центрифуги снова, удалить супернатант, и кратко высушить гранулы.
- Приостановите действие гранулы в 30 кЛ буфера TE и используйте его для секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладить 70% этанола при -20 градусов по Цельсию до шага 7.2.6. Фаггра пнулон должен быть тщательно resuspended в буфере йода до добавления этанола.
8. Определение пептидной последовательности
- Используйте -96 gIII секвенирования грунтовки (5 -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG - 3 ") для секвенирования.
- Проанализируйте пептидные последовательности, отображаемые на фаге на основе результатов секвенирования ДНК.
- Синтезируйте небольшие пептиды и анализируйте высокопроизводительную жидкую хроматографию (HPLC) и масс-спектрометрию, чтобы подтвердить их чистоту (98%).
9. Обнаружение сродства полученного мелкого пептида и внеклеточного белка FGFR2 ЦМТ
- Дега стерильной воды с помощью ультразвукового инструмента. Растворите небольшой пептид и внеклеточный белок FGFR2 в стерильной воде. Центрифуг эти образцы для удаления остаточного осадок.
- Выполните эксперименты по титроции ЦМТ при 25 градусах Цельсия. Титрат 40 мКм небольшого пептида в клетке с 1,5 мкм белка FGFR2 из шприца, с перемешиванием 750 об/мин. Добавьте белок FGFR2 в 2 аликоты (в общей сложности 19 инъекций) с интервалом в 5 минут.
- Проанализируйте данные ЦМТ с помощью модели связывания одного сайта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная вода должна быть дегазирована, и все образцы должны быть центрифугированы для удаления пузырьков воздуха и остаточных примесей. Эксперимент должен проводиться при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию.
10. Проверка биологической активности полученного небольшого пептида с использованием пролиферации клеток
- Семена BALB/c 3T3 клетки (3.0 и 103 клетки/ну, 100 qL) в 96-колодец пластины с Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) с 10% плода бычьей сыворотки (FBS) на ночь при 37 кС и 5% CO2.
- Замените супернатант свежим DMEM на 0,5% FBS и голодайте клетки в течение 12 ч.
- Сделать серийные разбавления небольшого пептида (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 и 100 мкм) со свежим ИДМ, дополненным 0,5% FBS (6 дублирующих скважин/концентрации). Снимите супернатант с 96-хорошей пластины и добавьте 100 л небольшого пептидного раствора на скважину. Инкубировать 48 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
- Замените супернатант свежим DMEM, содержащий 10% сотовый набор (CCK)-8 и инкубировать на 2 ч.
- Измерьте абсорбцию каждой скважины на уровне 450 нм с помощью микроплитного считывателя и проанализируйте жизнеспособность клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Получение высокого сродства небольшой пептид ориентации FGFR2.
Для проверки фагов, ориентированных на FGFR2, в этом исследовании была использована библиотека Ph.D.-7. Схематическое представление рабочего процесса показано на рисунке 1. При этом количество фагов (ПФУ) оставалось неизменным, в то время как концентрация покрытия белка FGFR2 постепенно уменьшалась. Результаты фагов оговорпоказал, что количество восстановленных фагов постепенно увеличивалось, и после 3 раундов, было 65-кратное увеличение по сравнению с первым туром(таблица 1).
Затем мы выбрали фаговые клоны случайным образом после третьего раунда и извлекли фage DNA для секвенирования. Один представительный пептид (WRARVPL), полученный путем скрининга, получил название SP1. Впоследствии он был синтезирован, и его молекулярный вес измерялся масс-спектрометрией.
Пептид SP1 показал высокую связывающую близость к FGFR2.
Был проведен эксперимент ЦМТ для измерения сродства небольшого пептида к FGFR2. Результат показал, что пептид SP1 имеет высокое сродство к FGFR2 (Kd - 1,4 мкм; Рисунок 2). Эта дата продемонстрировала эффективность протокола отбора.
Пептид SP1 ингибировал рост фибробластов.
Для исследования биологической активности пептида SP1 был проведен асссс пролиферации фибробластов с использованием комплекта CCK-8. Клетки BALB/c 3T3 были инкубированы пептидом SP1 в разных концентрациях (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 и 100 мкм). Результат показал, что пептид SP1 подавлял рост BALB/c 3T3 клеток(рисунок 3).
Рисунок 1. Биопанирование для небольшого пептида, ориентированного на FGFR2 с помощью библиотеки фагового дисплея.
(A) Схематическое представление малого пептидного скрининга с использованием библиотеки фагового дисплея. Инкубировать библиотеку, содержащую 1011 ПФУ в блюде с покрытием FGFR2. Откажитесь от несвязанных фагов путем мытья и elute связанных фагов. Усиль элютированные фаги и использовать их в качестве ввода для следующего раунда биопанирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Измерение сродства взаимодействия между пептидом SP1 и FGFR2 цМТ.
Белок FGFR2 1,5 мкм был тистрирован с 40 мкм пептида SP1. Данные ЦМТ были дополнительно проанализированы с помощью программного обеспечения Origin 7.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Влияние пептида SP1 на рост фибробластов.
Клетки BALB/c 3T3 лечились пептидом SP1 в разных концентрациях (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 и 100 мкм). Результаты выражаются в виде среднего значения sD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Круглый | FGFR2 (мг) | Фаг ввода (PFU) | Фаг выходного производства (PFU) | Восстановление (%) | Обогащения |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3.98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Таблица 1. Обогащение фагов, ориентированных на FGFR2 по отношению к раунду 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Комбинаторная фагная библиотека является мощным и эффективным инструментом для высокой пропускной связи скрининга новых пептидов, которые могут связывать молекулы мишени и регулировать их функцию13. В настоящее время, фаговык пептид библиотеки имеют широкий спектр применений. Например, они могут быть использованы для выбора биологически активных пептидов, связанных с рецепторными белками23,небелковые цели24,25, болезни конкретных антигена имитирует13, клеточные пептиды26, 27, или ткани / орган-специфических пептидов21,28,29 и развитие пептид-опосредовано систем доставки лекарств19,30. Короче говоря, фage дисплей пептид библиотеки полезны и эффективные системы для выявления конкретных пептидов в фундаментальных исследований и разработок трансляционной медицины. В исследовании, библиотека была использована для скрининга малых пептидов ориентации FGFR2 для ингибирования роста клеток.
Ниже приводятся критические шаги протокола. На этапе панорамирования следует избегать загрязнения фаги дикого типа. Несвязанные фаги должны быть удалены тщательно энергичной стирки. Пластины LB iPTG/X-gal для фагового титра должны быть предварительно разогреты до 37 градусов по Цельсию. Для фагового титра, E. coli ER2738 должны быть выращены до середины фазы журнала (OD600 и 0,5). В шаге 4.3, фаг должен быть осаждано ночь на 4 градуса Цельсия. Хорошо разделенные синие бляшки должны быть собраны с плато, содержащей менее 100 бляшек для секвенирования ДНК. В шаге 7.2.6, 70% этанола раствор должен быть предварительно охлажден при 20 градусах Цельсия заранее. Наконец, для эксперимента ЦМТ стерильная вода должна быть дегазирована, и все образцы должны быть центрифугированы для удаления пузырьков воздуха и остаточных примесей. Эксперимент должен проводиться при постоянной температуре 25 градусов по Цельсию.
Некоторые факторы, которые могут повлиять на качество хитов, полученных22, таковы: 1) В первом раунде скрининга, количество фагов должен быть 1011 PFU. Однако в следующем раунде скрининга ввод может быть ниже. 2) Чистая окружающая среда должна быть сохранена для того чтобы во избежание загрязнение фага дикого типа. 3) 3 или 4 раунда скрининга, как правило, достаточно. Избегайте чрезмерного панорамирования пептидной библиотеки. 4) В каждом раунде количество целевого белка постепенно уменьшается, в то время как содержание Tween постепенно увеличивается в стирке. Кроме того, постепенно сокращается инкубационное время фага и блюда с покрытием FGFR2. Если большинство элетированных фаговых бляшек белые на пластинах X-gal/IPTG, это говорит о загрязнении фаги дикого типа. Для того, чтобы избежать низкого титра усиленного фага в процессе панорамирования, культуры должны быть хорошо газированы и инфицированы в начале фазы роста (OD600 qlt; 0.05).
В этом исследовании пептид SP1 показал высокое сродство к FGFR2 (Kd 1,4 мкм; Рисунок 2) и хорошая биологическая активность(рисунок 3). Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что протокол был эффективен в выборе пептидов против внеклеточной области белка FGFR2, хотя отмечают, что из-за высокой последовательности членов семьи FGFR, пептид SP1 может иметь некоторую связующую близость с FGFR членов семьи, кроме FGFR2, которые могут нести ответственность за биологической деятельности видел. Кроме того, в процессе панорамирования, фаг ELISA является альтернативой для качественного выявления положительных фагов. Тем не менее, в нашей лаборатории, мы всегда получаем пептиды путем секвенирования и оценки их сродства по Анализ УМТ количественно и не было проблем с оценкой и выбором кандидата пептидов.
Фаго-дисплей библиотека имеет несколько преимуществ22. Библиотеки имеют высокую емкость (до 1011 PFU) и могут быть использованы в пробирке, in vivo и exvivo. Библиотеки являются высокоэффективными, простыми в обращении, недорогими и коммерчески доступными. Тем не менее, существуют определенные ограничения технологии. Библиотеки содержат только белоподобные аминокислоты и поддаются только линейным и простым циклическим пептидам без сложных структур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Научно-технической программой Гуанчжоу (No 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
