Summary
Heri præsenterer vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til FGFR2 ved hjælp af et fagtypning-display peptid-bibliotek. Vi analyserer yderligere affiniteten af de valgte peptider mod FGFR2 in vitro og dets evne til at undertrykke celle proliferation.
Abstract
Den humane fibroblast vækstfaktor receptor (FGFR) familie består af fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4, der er involveret i forskellige biologiske aktiviteter, herunder celle spredning, overlevelse, migration og differentiering. Flere afvigelser i FGFR signalering pathway, på grund af mutationer eller genamplifikation hændelser, er blevet identificeret i forskellige typer af kræft. Nyere forskning har derfor fokuseret på at udvikle strategier, der involverer terapeutisk målretning af FGFRs. nuværende FGFR-hæmmere på forskellige stadier af præklinisk og klinisk udvikling omfatter enten små molekyle hæmmere af tyrosinkinaser eller monoklonalt antistoffer, med kun få peptidbaserede hæmmere i rørledningen. Her giver vi en protokol ved hjælp af fagtypning display teknologi til at screene små peptider som antagonister af FGFR2. Kort, et bibliotek af Phage-viste peptider blev inkuberet i en plade belagt med FGFR2. Efterfølgende blev ubundet fagtypning vasket af tbst (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), og bundet fagtypning blev elueret med 0,2 M Glycin-HCL buffer (pH 2,2). Den elueret fagtypning blev yderligere forstærket og anvendt som input til den næste runde af biopanning. Efter tre runder af biopanning blev peptidsekvenserne af individuelle fagtypning kloner identificeret ved DNA-sekvensering. Endelig blev de screenede peptider syntetiseret og analyseret for affinitet og biologisk aktivitet.
Introduction
Fibroblast vækstfaktor receptorer (FGFRs) spille nøgleroller i celle proliferation, sårheling, og angiogenese i vivo1. Afvigende aktivering af fgfr signalering observeret i en række tumorer2,3,4,5 omfatter genforstærkning, genmutationer, kromosomale aberrationer, og overdreven ligand sekretion6 . Mange hæmmere rettet mod FGFRs har vist lovende terapeutiske virkninger i kliniske forsøg og er hovedsagelig klassificeret i tre typer: (1) små molekyle kinasehæmmere, som binder til det intracellulære domæne af FGFR, (2) antagonister, der er rettet mod ekstracellulært segment, og (3) FGF ligand fælder6. Selv om flere af de små molekyle kinasehæmmere har gode terapeutiske virkninger både in vitro og in vivo7, de fleste af dem har dårlig målspecificitet og viser bivirkninger såsom hypertension8. Flertallet af antagonister er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordele i forhold til små molekyler på grund af deres specificitet og lavere bivirkninger. De bevarer også cellernes permeabilitet og ophobes ikke i specifikke organer sammenlignet med proteinstoffer12. Derfor, målrettede små peptider er både effektive og potentielle terapeutiske agenter.
Phage display teknologi er et nemt, men kraftfuldt værktøj til at identificere små peptider, som kan binde sig til et givet molekyle13,14,15. Vi brugte et fagtypning display peptid bibliotek, der er baseret på en simpel M13 fagtypning med over 109 forskellige peptidsekvenser vises i halen for binding til målet molekyle (Se tabel over materialer)16. På grund af den høje affinitet af fager mod det givne molekyle, ubundne fager kan vaskes væk, og kun stramt bundet fager med de ønskede korte peptider bevares. De givne molekylære mål kan være immobiliseret proteiner17,18, kulhydrater, dyrkede celler, eller endda uorganiske materialer19,20. En spændende sag blev rapporteret, hvor orgel-specifikke peptider blev valgt in vivo ved hjælp af fagtypning Display Technology21. Fordelene ved fagtypning display teknologi omfatter høj gennemløb, nem betjening, lave omkostninger og en bred vifte af applikationer22.
I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til screening af små peptider, der binder sig til det immobiliserede protein (FGFR2) ved hjælp af et fagtypning-skærm bibliotek. Teknologiens effektivitet undersøges også ved at måle affiniteten af det opnåede peptid mod FGFR2 ved isotermisk titrering Calorimetri (ITC) og den biologiske aktivitet ved en celle sprednings analyse. Metoden kan udvides til screening af små peptider, der binder til kulhydrater, dyrkede celler eller endda uorganiske materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af reagens
- LB (lysogeny bouillon) medium: Opløs 1 g tryptone, 0,5 g gærekstrakt og 0,5 g NaCl i 100 mL H2O. autoklave og opbevares ved 4 °c.
- Tetracyclin bestand: Forbered 20 mg/mL i 1:1 ethanol: H2O. opbevares ved-20 °c, og vortex før brug.
- IPTG/X-gal opløsning: Bland 0,5 g IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) og 0,4 g af X-gal (5-brom-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosid) i 10 mL DMF (dimethylformamid). Opløsningen kan opbevares ved-20 °C i et år i mørke.
- LB + tetracyclin (tet) plader: Dissove 1 g Bacto-trypton, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl og 1,5 g agar i 100 mL H2O. autoklave og afkøles til ≪ 70 °c. Tilsæt 100 μL af tetracyclin bestanden og hæld pladerne. Opbevar pladerne ved 4 °C i mørke.
- LB + IPTG/X-gal-plader: 1 g Bacto-trypton opløses, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl og 1,5 g agar i 100 mL H2O. autoklave og afkøles til ≪ 70 °c. Tilsæt 100 μL IPTG/X-gal-opløsningen og hæld pladerne. Opbevar pladerne ved 4 °C i mørke.
- Glycin-HCI buffer (0,2 M): Opløs 1,5014 g glycin og 100 mg BSA (bovint serumalbumin) i 100 mL H2O og justér pH til 2,2 med HCL. Filtrer opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °c.
- Tris-HCl buffer (1 M): Opløs 12,11 g tris (tris (hydroxymethyl) aminmethan) i 100 mL H2O og justér pH til 9,1 med HCL. autoklave og opbevar ved 4 °c.
- Belægning buffer (0,1 M): opløses 1,68 g NaHCO3 i 200 ml H2O og justere pH til 8,6 med NaOH. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
- Blokerende buffer: Forbered 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) med 5 mg/ml BSA. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
- TBS: Forbered 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) med 150 mM NaCl. Autoklave og opbevares ved stuetemperatur.
- 0,05%, 0,1% eller 0,5% TBST: Forbered TBS med 0,05%, 0,1% eller 0,5% (v/v) Tween-20. Filter ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved stuetemperatur.
- PEG/NaCl: Forbered 20% (w/v) polyethylenglycol – 8000 med 2,5 M NaCl. Autoklave og opbevares ved stuetemperatur.
- TE opløsning: Bland 1 mL af 1 M Tris-HCl (pH 8.0) og 2 mL 50 mM EDTA (pH 8,0) og Justér lydstyrken til 100 mL med H2O. autoklave og opbevar ved stuetemperatur.
- Iodide buffer: 30 g NaI opløses i 50 mL TE, pH 8,0. Opløsningen opbevares ved stuetemperatur i mørke.
- Top agar: 1 g tryptone, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g NaCl og 0,7 g agarin i 100 mL H2O. autoklave og dispenserer i 15 ml aliquoter. Opbevares ved stuetemperatur til brug.
2. første runde af biopanning: screening fagtypning kloner, der binder sig til det ekstracellulære domæne af FGFR2
Bemærk: Brug aerosol-resistente pipettespidser og bær handsker til alle protokoller for at minimere kontaminering med miljømæssige Bakteriofager.
- Forbered en 10 μg/mL FGFR2 (renhed > 97%; Se tabel over materialer) opløsning i belægnings buffer. Der tilsættes 1 mL af den tilberedte opløsning til en 35 cm2 skål, og der hvirvles flere gange, indtil overfladen er helt våd. Inkuber natten over ved 4 °C med omrystning.
Bemærk: for at undgå valg af lokke målbindere skal målproteinet være meget renset. - 5 mL LB + tet-medium med Escherichia coli (E. coli) ER2738 i 5 – 10 timer ved 37 °c ved omrystning. De forstærkede ER2738 celler vil blive anvendt til titrering i trin 3,3.
- Hæld overfladebehandlings opløsningen af skålen (den overskydende opløsning skal fjernes), og tilsæt blokerings opløsningen. Inkuber ved 4 °C i mindst 1 time.
- Fjern blokerings opløsningen, og vask 6 gange hurtigt med TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20). Undgå at udtørre skålen.
- Rekonstruere det oprindelige fagtypning-bibliotek i 1 ml tbst [endelig koncentration på 1011 plak dannende enheder (PFU)], tilsæt den coatede skål, og klippe forsigtigt i 2 timer på en shaker ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og skålen 10x vaskes med TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20) som udført i trin 2,4.
Bemærk: de ubundne fager skal fjernes grundigt ved kraftig vask. - Elute den bundne fagtypning ved at tilsætte 1 ml 0,2 M Glycin-HCL buffer (pH 2,2) til skålen og rokke forsigtigt i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Eluatet overføres til et steriliseret mikrofuge rør, og det neutraliseres med 100 μL 1 M Tris-HCl, pH 9,1.
Bemærk: i trin 2,6 fjernes den ubundne fagtypning så meget som muligt ved at vaske skålen 10x kraftigt. Det er et afgørende skridt. Det elueret fagtypning kan opbevares ved 4 °c i en uge. Men det er bedst at gå videre til næste skridt så hurtigt som muligt.
3. titer bestemmelse af de eluede fager
- Pre-Warm LB + IPTG/X-gal plader i mindst 1 h ved 37 °C før brug.
- Forbered 100 μL af 10-dobbelte serielle fortyndinger (dvs. 101, 102, 103 og 104) af eluatet fra trin 2,8 i lb. Brug spidser med filterpatroner for at undgå kontaminering.
- Lad kulturen fra trin 2,2 nå Mid-log fase (OD600 ≈ 0,5). 200 μL af kulturen fortyndes til steriliserede mikrofuge slanger, én for hver eluatfortynding.
- For at initiere infektionen tilsættes 10 μL af hver fortynding fra trin 3,2 til individuelle mikrofuge rør, der indeholder E. coli ER2738 kulturen fra trin 3,3. Vortex hurtigt og inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
- Coat 90 μL af blandingen fra trin 3,4 til LB + IPTG/X-gal plader med belægning pinde.
- Eventuelt smelte top agar i en mikrobølgeovn, dispensere 3 mL i sterile kulturrør, en for hver eluat fortynding, og vedligeholde rør ved 45 °C. Blandingen overføres fra trin 3,4 til kulturrør, der indeholder 45 °C top agar. Bland hurtigt og hæld straks kulturen på en præ-opvarmet LB/IPTG/X-gal plade. VIP og drej pladen forsigtigt for at sprede den øverste agar jævnt.
- Efter 5 min, inverter og inkubatplader natten over ved 37 °C.
- Tæl plaques på plader med ca. 100 plaques. Hvert tal multipliceres med fortyndingsfaktoren for pladen for at få fagtypning titer i PFU pr. 10 μl.
- En anden 5 ml lb + tet medium inokuleres med E. coli ER2738 ved 37 °c natten over ved omrystning for fagtypning amplifikation.
Bemærk: Brug kulturen af ER2738 i Mid-log fase (OD600 ≈ 0,5) for fagtypning titer. Hvis de fleste af plaques er hvide på X-gal/iptg plader, betyder det, at puljen af fagtypning er blevet forurenet med vilde Bakteriofager. Hvis der opstår kontaminering, er det nødvendigt at starte forfra med panorerings trinene fra den uforurenede fagtypning-stamopløsning.
4. forstærkning af Phage
- Fortyndet (1:100) overnight kultur fra trin 3,8 i 20 mL LB i en 250 mL Erlenmeyer kolbe. Tilsæt unamplificeret eluat og Inkuber med kraftig rystning for 4,5 h ved 37 °C.
- Kulturen overføres til et centrifugeglas, og der centrifugeres i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 °c. Supernatanten overføres til et friskt rør, centrifugeres igen og kassér pellet.
- Oversæt den øvre 80% af supernatanten til et friskt rør og tilsæt 1/6 volumen på 20% PIND/2,5 M NaCl. Lad fagtypning udfælde ved 4 °c natten over.
Bemærk: Bland kulturen supernatanten med PEG/2.5 M NaCl godt. - Det udfældede fagtypning centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, centrifugeres igen, og den resterende supernatanten fjernes med en pipette.
- Resuspension af pellet i 1 mL TBS og overføre supernatanten til en Micro fuge tube. Centrifugeres ved 12.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten overføres til en frisk mikrofuge slange og frem fældning igen ved tilsætning af 1/6 volumen på 20% PEG/2,5 M NaCl. Inkuber på is i 15 – 60 min. centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten, re-spin, og fjern den resterende supernatanten med en pipette.
- Resuspension af pellet i 200 μL TBS og centrifugeres i et ekstra minut for at fjerne urenheder. Supernatanten overføres til en frisk mikrofuge slange for at opnå det forstærkede eluat.
- Den forstærkede fagtypning som beskrevet i punkt 3.
Bemærk: fortyndingen af det forstærkede eluat er højere sammenlignet med det ikke-amplificerede eluat; der foreslås typisk seriefortyndinger på 108– 1011 .
5. anden runde af biopanning
- Gentag afsnit 2 til 4.
- Anden runde af det forstærkede eluat på LB + IPTG/X-gal-plader som beskrevet i punkt 3.
Bemærk: Reducer belægnings koncentrationen af FGFR2 protein til 5 μg/mL. Brug det forstærkede fagtypning fra trin 4,7 som input, og hold titeren samme som i første runde (1011 PFU). Inkubationstiden for fagtypning og FGFR2-coated skål forkortes til 1 time, og mellem koncentrationen øges til 0,1% (v/v) i vaske trinene.
6. tredje runde af biopanning
- Gentag trin 2.1-2.6.
- Elute det bundne fagtypning ved at tilsætte 1 ml 20 μM bfgf opløsning (en ligand for FGFR2) til skålen og rokke forsigtigt i 60 min ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.1-3.7.
Bemærk: Reducer belægnings koncentrationen af FGFR2-proteinet til 2,5 μg/mL. Brug den anden runde af forstærket fagtypning fra afsnit 5 som input og hold titer samme som i første runde (1011 PFU). Inkubationstiden for fagtypning og FGFR2-coated skål forkortes til 30 min, og mellem koncentrationen øges til 0,5% (v/v) i vaske trinene.
7. erhvervelse af plaque DNA til sekvensering
- Plaque forstærkning
- Fortyndet (1:100) en overnight kultur af ER2738 i LB. dispensere 1 mL fortyndet kultur i et 2 mL rør, en for hver klon, der skal karakteriseres.
- Brug en pipettespids til at vælge en velsepareret blå plak fra en titer plade fra punkt 6 og Overfør til røret, der indeholder den fortyndede kultur. Vælg i alt 15 plaques.
Bemærk: pladerne skal være < 1 – 3 dage gamle, opbevaret ved 4 °C og have < 100 plaques. - Rørene inkuberes med kraftig rystning for 4,5 h ved 37 °C.
- Overfør kulturerne til centrifuge rørene, og centrifugeres ved 12.000 x g i 30 s. Overfør supernatanten til et friskt rør, og centrifuger igen.
- Ved hjælp af en pipette overføres de øvre 80% af supernatanten til et friskt rør. Mærk dette som den forstærkede fagtypning-bestand.
Bemærk: fortynd det forstærkede fagtypning med et tilsvarende volumen på 100% sterilt glycerol og opbevares ved-80 °c til senere brug.
- Ekstraktion af plaque DNA
- Overfør 500 μl af det forstærkede fagtypning til en frisk mikrofuge slange, og tilsæt en 1/6 volumen på 20% peg/2,5 M NaCl. Vend for at blande og lad den stå i 10 – 20 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c og hæld derefter supernatanten af.
Bemærk: Phage pellet er muligvis ikke synlig. - Centrifugeres igen. Fjern forsigtigt eventuelle resterende supernatant.
- Resuspension af pellet grundigt i 100 μl af kaliumiodid buffer ved kraftigt at tappe røret.
- Tilsæt 250 μL 100% ethanol og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
- Centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes. Du vasker pellet med 0,5 mL 70% ethanol, centrifugeres hurtigt igen, fjerner supernatanten og tørrer kortvarigt.
- Resuspension af pellet i 30 μL TE buffer og bruge dette til sekvensering.
Bemærk: pre-cool 70% ethanol ved-20 °C forud for trin 7.2.6. Fagtypning pellet skal være grundigt resuspenderet i kaliumiodid buffer før tilsætning af ethanol.
8. identifikation af peptidsekvensen
- Brug-96 GIII sekventering primer (5 ́-CCC TCA tag TTA GCG TAA CG-3 ́) til sekvensering.
- Analysér peptidsekvenserne, som vises på fagtypning, baseret på resultaterne af DNA-sekvensering.
- Syntetisere små peptider og analysere ved højtydende væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri for at bekræfte deres renhed (≥ 98%).
9. påvisning af affiniteten af det opnåede lille peptid og ekstracellulært protein af FGFR2 af ITC
- Degas sterilt vand ved hjælp af et ultralyds instrument. Det lille peptid og det FGFR2 ekstracellulære protein opløses i sterilt vand. Disse prøver centrifugeres for at fjerne det resterende bundfald.
- Udfør ITC-titrerings forsøgene ved 25 °C. 40 μM af lille peptid titreret i cellen med 1,5 μM FGFR2 protein fra sprøjten med en omrøringshastighed på 750 rpm. Tilsæt FGFR2 protein i 2 μL aliquoter (i alt 19 injektioner) med 5 minutters intervaller.
- Analysér ITC-dataene ved hjælp af en bindings model med ét websted.
Bemærk: steril vand skal afgasses, og alle prøver skal centrifugeres for at fjerne luftbobler og resterende urenheder. Forsøget skal udføres ved en konstant temperatur på 25 °C.
10. kontrol af den biologiske aktivitet af det opnåede lille peptid ved hjælp af en celle sprednings analyse
- Frøbalb/c 3T3 celler (3,0 × 103 celler/brønd, 100 μl) i en 96-brønd plade med Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) natten over ved 37 °c og 5% Co2.
- Udskift supernatanten med Fresh DMEM med 0,5% FBS og udsulter cellerne i 12 timer.
- Foretag serielle fortyndinger af det lille peptid (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 og 100 μM) med frisk DMEM suppleret med 0,5% FBS (6 duplikerede brønde/koncentration). Fjern supernatanten fra 96-brønd pladen og tilsæt 100 μL af den lille peptidopløsning pr. brønd. Inkuber i 48 h ved 37 °C og 5% CO2.
- Supernatanten udskiftes med frisk DMEM, der indeholder 10% celle optællings Kit (CCK)-8-opløsning og inkuberer i 2 timer.
- Mål Absorbansen for hver brønd ved 450 Nm med en mikroplade læser og analysér cellernes levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opnåelse af en høj affinitet lille peptid målretning FGFR2.
Til skærm fager målretning FGFR2, en ph.D.-7 bibliotek blev brugt i denne undersøgelse. En skematisk gengivelse af arbejdsprocessen vises i figur 1. I denne proces, antallet af fagtypning input (PFU) blev holdt uændret, mens belægningen koncentrationen af FGFR2 protein blev reduceret gradvist. Resultaterne af fagtypning titer tydede på, at antallet af genvundne fager steg gradvist, og efter 3 runder var der en stigning på 65 gange i forhold til den første runde (tabel 1).
Derefter plukkede vi fagtypning kloner tilfældigt efter den tredje runde og ekstraherede fagtypning-DNA til sekvensering. Et repræsentativt peptid (WRARVPL), der blev opnået ved screening, blev udpeget som SP1. Det blev efterfølgende syntetiseret, og dens molekylvægt blev målt ved massespektrometri.
SP1 peptid viste høj binding affinitet mod FGFR2.
Et ITC eksperiment blev udført for at måle affiniteten af det lille peptid til FGFR2. Resultatet viste, at SP1 peptid har høj affinitet mod FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2). Denne dato viste Screenings protokollens effektivitet.
Den SP1 peptid inhiberet væksten af fibroblaster.
For at undersøge den biologiske aktivitet af SP1 peptid, en fibroblast proliferation analyse blev udført ved hjælp af en CCK-8 kit. BALB/c 3T3-celler blev inkuberet med SP1 peptid ved forskellige koncentrationer (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 og 100 μM). Resultatet foreslog, at SP1 peptid undertrykt væksten af BALB/c 3T3 celler (figur 3).
Figur 1. Biopanning for lille peptid målretning FGFR2 ved hjælp af fagtypning display Library.
(A) skematisk gengivelse af lille peptidscreening ved hjælp af fagtypning display Library. Inkubatér biblioteket med 1011 PFU i en skål belagt med FGFR2. Kassér ubundne fager ved at vaske og eluere bundne fager. Amplificere de elueret fager og bruge dem som input til den næste runde af biopanning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Måling af affiniteten af interaktion mellem SP1 peptid og FGFR2 af ITC.
1,5 μM FGFR2 protein blev titreret med 40 μM af SP1 peptid. ITC-dataene blev yderligere analyseret ved hjælp af Origin 7,0-softwaren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Effekt af SP1 peptid på væksten af fibroblaster.
BALB/c 3T3-celler blev behandlet med SP1 peptid ved forskellige koncentrationer (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 og 100 μM). Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± SD. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
| Runde | FGFR2 (μg) | Indgang fagtypning (PFU) | Udgang fagtypning (PFU) | Genopretning (%) | Berigelse |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2,5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabel 1. Berigelse af fagtypning målretning FGFR2 i forhold til runde 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kombinatorisk fagtypning bibliotek er et kraftfuldt og effektivt værktøj til høj gennemløbs screening af nye peptider, der kan binde målmolekyler og regulere deres funktion13. I øjeblikket, fagtypning display peptid biblioteker har en bred vifte af applikationer. For eksempel kan de bruges til at vælge bioaktive peptider bundet til receptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sygdoms-specifikke antigen efterligner13, celle-specifikke peptider26, 27, eller vævs/organ-specifikke peptider21,28,29 og udvikling af peptid-medierede Drug leveringssystemer19,30. Kort sagt, fagtypning display peptid biblioteker er nyttige og effektive systemer til at identificere specifikke peptider i grundforskning og udvikling af translationel medicin. I undersøgelsen blev der anvendt et bibliotek til screening af små peptider rettet mod FGFR2 for cellevækst hæmning.
De kritiske trin i protokollen er nævnt nedenfor. I panorerings trinnet skal kontaminering med vildtype-fager undgås. De ubundne fager skal fjernes grundigt ved kraftig vask. LB + iptg/X-gal-pladerne for fagtypning titer skal forvarmes til 37 °c. For fagtypning titer skal E. coli ER2738 dyrkes indtil Mid-log fase (OD600 ≈ 0,5). I trin 4,3 skal fagtypning udfældede natten over ved 4 °c. Veladskilte blå plaques skal plukkes fra Platea, der indeholder mindre end 100 plaques til DNA-sekvensering. I trin 7.2.6 skal den 70% ethanol opløsning forkøles ved 20 °C i forvejen. Endelig skal der for ITC-eksperimentet afgasses steril vand, og alle prøver skal centrifugeres for at fjerne luftbobler og resterende urenheder. Forsøget skal udføres ved en konstant temperatur på 25 °C.
Nogle faktorer, der kan påvirke kvaliteten af hits opnået22 er som følger: 1) i den første screening runde skal antallet af fagtypning-indgange være 1011 PFU. Men i den næste runde af screening, kan input være lavere. 2) et rent miljø skal opretholdes for at undgå vildtype fagtypning kontaminering. 3) 3 eller 4 Screenings runder er normalt tilstrækkelige. Undgå at over panorering af peptidbiblioteket. 4) i hver runde reduceres mængden af målprotein gradvist, mens indholdet af Tween gradvist øges i vaske trinnet. Desuden er inkubationstiden for fagtypning og FGFR2-coated skål også gradvist forkortet. Hvis de fleste af de elueret fagtypning plaques er hvide på X-gal/iptg plader, dette tyder på forurening af vild-type fager. For at undgå en lav titer af forstærket fagtypning i panorerings processen, skal kulturer være godt tilsat kulsyreholdige og inficeret tidligt i deres vækstfase (OD600 < 0,05).
I denne undersøgelse viste SP1 peptid høj affinitet mod FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2) og god biologisk aktivitet (figur 3). Således, vores resultater tyder på, at protokollen var effektiv til at vælge peptider mod det ekstracellulære domæne af FGFR2 protein, selv om Bemærk, at på grund af den høje sekvens lighed af FGFR familiemedlemmer, SP1 peptid kan have nogle binding affinitet med FGFR familiemedlemmer udover FGFR2, som kunne være ansvarlig for den biologiske aktivitet set. I panorerings processen er fagtypning Elisa også et alternativ til at identificere de positive fager kvalitativt. Men i vores laboratorium, vi altid få peptider ved sekvensering og evaluere deres affinitet ved ITC assay kvantitativt og har ikke haft problemer med at evaluere og vælge den kandidat peptider.
Biblioteket Phage-display har flere fordele22. Bibliotekerne er af høj kapacitet (op til 1011 PFU) og kan anvendes in vitro, in vivo og ex vivo. Biblioteker er yderst effektive, nemme at håndtere, billige og kommercielt tilgængelige. Men, der er visse begrænsninger af teknologien. Bibliotekerne indeholder kun proteinogeniske aminosyrer og er kun modtagelig for lineære og enkle cykliske peptider uden komplicerede strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen modstridende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det videnskabelige og teknologiske program i Guangzhou (nr. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
