Summary
En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.
Abstract
La familia humana Detensíto de Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) está compuesta por cuatro miembros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que participan en diversas actividades biológicas, incluyendo la proliferación celular, supervivencia, migración y diferenciación. Se han identificado varias aberraciones en la vía de señalización FGFR, debido a mutaciones o eventos de amplificación de genes, en varios tipos de cáncer. Por lo tanto, investigaciones recientes se han centrado en el desarrollo de estrategias que implican la focalización terapéutica de FFRRs. Inhibidores actuales de FGFR en varias etapas del desarrollo preclínico y clínico incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de tirosina quinasas o anticuerpos monoclonales, con sólo unos pocos inhibidores a base de péptidos en la tubería. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza la tecnología de visualización de fagos para detectar pequeños péptidos como antagonistas de FGFR2. Brevemente, se incubaba una biblioteca de péptidos expuestos con fago sin fago en una placa recubierta de FGFR2. Posteriormente, TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20 se laupagó el fago no unido y eluyó con un tampón de 0,2 M de glicina-HCl (pH 2.2). El fago eludado se amplificabó aún más y se utilizó como entrada para la siguiente ronda de biopanning. Después de tres rondas de bioparlante, las secuencias de péptidos de clones individuales de fago fueron identificadas por secuenciación del ADN. Finalmente, los péptidos examinados fueron sintetizados y analizados para la afinidad y la actividad biológica.
Introduction
Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) desempeñan un papel clave en la proliferación celular, la cicatrización de heridas y la angiogénesis in vivo1. Activación aberrante de señalización FGFR observada en una variedad de tumores2,3,4,5 incluye amplificación de genes, mutaciones genéticas, aberraciones cromosómicas, y secreción excesiva de ligando6 . Muchos inhibidores dirigidos a los FFRBR han demostrado efectos terapéuticos prometedores en ensayos clínicos y se clasifican principalmente en tres tipos: (1) inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas, que se unen al dominio intracelular de FGFR, (2) antagonistas dirigidos a los segmento extracelular, y (3) ligando según el FGF6. Aunque varios de los inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas tienen buenos efectos terapéuticos tanto in vitro como in vivo7, la mayoría de ellos tienen mala especificidad objetivo y muestran efectos adversos como la hipertensión8. La mayoría de los antagonistas son anticuerpos monoclonales9,10 y polipéptidos11. Los péptidos tienen ventajas sobre moléculas pequeñas debido a su especificidad y efectos secundarios más bajos. También conservan la permeabilidad celular y no se acumulan en órganos específicos en comparación con los fármacos proteicos12. Por lo tanto, los péptidos pequeños dirigidos son agentes terapéuticos eficaces y prospectivos.
La tecnología de visualización Phage es una herramienta fácil pero poderosa para identificar pequeños péptidos que pueden unirse a una moléculadada 13,14,15. Utilizamos una biblioteca de péptidos de exhibición de fago que se basa en un simple fago M13 con más de 109 secuencias de péptidos diferentes que se muestran en la cola para la unión a la molécula objetivo (ver Tabla de Materiales)16. Debido a la alta afinidad de los fagos hacia la molécula dada, los fagos no unidos se pueden lavar, y sólo se conservan los fagos estrechamente unidos con los péptidos cortos deseados. Las dianas moleculares dadas pueden ser proteínas inmovilizadas17,18, carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos19,20. Se informó de un caso emocionante en el que se seleccionaron péptidos específicos de órganos in vivo utilizando la tecnología de visualización defagos 21. Las ventajas de la tecnología de visualización de fago sin embargo incluyen alto rendimiento, facilidad de operación, bajo costo y una amplia gama de aplicaciones22.
En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado de cribado de pequeños péptidos que se unen a la proteína inmovilizada (FGFR2) utilizando una biblioteca de visualización de fagos. La eficacia de la tecnología también se examina midiendo la afinidad del péptido obtenido hacia FGFR2 por Calorimetría de valoración isotérmica (ITC), y la actividad biológica mediante un ensayo de proliferación celular. El método puede extenderse para el cribado de pequeños péptidos que se unen a carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de reactivos
- LB (caldo de lisogenia) medio: Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura y 0,5 g de NaCl en 100 ml de H2O. Autoclave y almacenar a 4 oC.
- Material de tetraciclina: Preparar 20 mg/ml en 1:1 etanol:H2O. Almacenar a -20 oC, y vórtice antes de usar.
- Solución IPTG/X-gal: Mezcla 0,5 g de IPTG (isopropilo-D-1-tiogalactopyranoside) y 0,4 g de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-D-galactoside) en 10 mL de DMF (dimetil formamida). La solución se puede almacenar a -20 oC durante un año en la oscuridad.
- Placas LB + Tetraciclina (Tet): Dissuve 1 g de bacto-triptolona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 1,5 g de agar en 100 ml de H2O. Autoclave y enfriar a < 70 oC. Añadir 100 l de la culatina y verter las placas. Almacene las placas a 4 oC en la oscuridad.
- Placas LB + IPTG/X-gal: Disolver 1 g de bacto-triptolona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 1,5 g de agar en 100 ml de H2O. Autoclave y enfriar a < 70oC. Añadir 100 l de la solución IPTG/X-gal y verter las placas. Almacene las placas a 4 oC en la oscuridad.
- Tampón de glicina-HCI (0,2 M): Disolver 1,5014 g de glicina y 100 mg de BSA (albúmina sérica bovina) en 100 ml de H2O y ajustar el pH a 2,2 con HCl. Filtrar la solución utilizando un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
- Tampón Tris-HCl (1 M): Disolver 12,11 g de Tris (tris(hidroximetil)aminometano) en 100 ml de H2O y ajustar el pH a 9,1 con HCl. Autoclave y almacenar a 4 oC.
- Tampón de recubrimiento (0,1 M): Disolver 1,68 g de NaHCO3 en 200 ml de H2O y ajustar el pH a 8,6 con NaOH. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
- Buffer de bloqueo: Prepare 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) con 5 mg/ml de BSA. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
- TBS: Preparar 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) con 150 mM NaCl. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
- 0,05%, 0,1% o 0,5% TBST: Preparar TBS con 0,05%, 0,1% o 0,5% (v/v) Tween-20. Filtrar con un filtro de 0,22 m y almacenar a temperatura ambiente.
- PEG/NaCl: Preparar 20% (p/v) polietilenglicol-8000 con 2,5 M NaCl. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
- Solución TE: Mezclar 1 mL de 1 M Tris-HCl (pH8.0) y 2 mL de 50 mM EDTA (pH 8.0) y ajustar el volumen a 100 mL con H2O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
- Tampón de yoduro: Disolver 30 g de NaI en 50 ml de TE, pH 8.0. Almacene la solución a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Agar superior: Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 0,7 g de agarina en 100 ml de H2O. Autoclave y dispensar en alícuotas de 15 ml. Conservar a temperatura ambiente para su uso.
2. Primera ronda de bioparpanning: Cribado de clones de fagos que se unen al dominio extracelular de FGFR2
NOTA: Utilice puntas de pipeta resistentes a aerosoles y guantes de uso para todos los protocolos con el fin de minimizar la contaminación con bacteriófagos ambientales.
- Preparar una solución FGFR2 de 10 g/mL (Pureza > 97%; ver Tabla de materiales)en tampón de recubrimiento. Añadir 1 ml de la solución preparada a un plato de 35 cm2 y agitar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda. Incubar durante la noche a 4oC con agitación.
NOTA: Para evitar la selección de aglutinantes objetivo de señuelo, la proteína diana debe estar altamente purificada. - Inocular 5 ml de LB + Tet medio con Escherichia coli (E. coli) ER2738 durante 5-10 horas a 37oC con temblor. Las células ER2738 amplificadas se utilizarán para la valoración en el paso 3.3.
- Vierta la solución de recubrimiento del plato (el exceso de solución debe ser eliminado) y agregue la solución de bloqueo. Incubar a 4oC durante al menos 1 h.
- Deseche la solución de bloqueo y lave 6 veces rápidamente con TBST (TBS + 0,05% (v/v] Tween-20). Evite secar el plato.
- Reconstituir la biblioteca de fagos originales en 1 mL de TBST [concentración final de 1011 unidades formadoras de placas (PFU)], añadir al plato recubierto, y mecer suavemente durante 2 h en una coctelera a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y lave el plato 10x con TBST (TBS + 0.05% (v/v) Tween-20), como se realiza en el paso 2.4.
NOTA: Los fagos no unidos deben retirarse a fondo mediante un lavado vigoroso. - Eluir el fago atado añadiendo 1 ml de tampón de glicina-HCl de 0,2 M (pH 2.2) al plato y meciéndose suavemente durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Transfiera el eluido en un tubo de microfúgelo esterilizado y neutralícelo con 100 ml de Tris-HCl de 1 M, pH 9.1.
NOTA: En el paso 2.6, retire el fago no unido tanto como sea posible lavando el plato 10 veces vigorosamente. Este es un paso crucial. El fago eludado se puede almacenar a 4 oC durante una semana. Sin embargo, es mejor seguir adelante con el siguiente paso tan pronto como sea posible.
3. Determinación de los fagos eludados
- Placas precalentadas LB + IPTG/X-gal durante al menos 1 h a 37 oC antes de su uso.
- Preparar 100 l de diluciones en serie de 10 veces (es decir, 101, 102, 103 y 104) del eluido del paso 2.8 en LB. Use puntas con cartuchos de filtro para evitar la contaminación.
- Deje que la referencia cultural del paso 2.2 alcance la fase de registro medio (OD600 a 0,5). Dispensar 200 ml del cultivo en tubos de microfúge esterilizados, uno para cada dilución de eluido.
- Para iniciar la infección, añada 10 ml de cada dilución desde el paso 3.2 a los tubos de microfuga individuales que contengan el cultivo de E. coli ER2738 del paso 3.3. Vórtice rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Recubrir 90 l de la mezcla a partir del paso 3.4 en las placas LB +IPTG/X-gal con varillas de recubrimiento.
- Opcionalmente, derretir el agar superior en un microondas, dispensar 3 ml en tubos de cultivo estériles, uno para cada dilución eluido, y mantener los tubos a 45 oC. Transfiera la mezcla del paso 3.4 a tubos de cultivo que contengan agar superior a 45 oC. Mezcle rápidamente e inmediatamente vierta el cultivo en una placa LB/IPTG/X-gal precalentada. Incline y gire suavemente la placa para extender el agar superior uniformemente.
- Después de 5 min, invierta e incubar las placas durante la noche a 37oC.
- Cuente las placas en placas con aproximadamente 100 placas. Multiplique cada número por el factor de dilución de esa placa para obtener el plato de fago en PFU por 10 oL.
- Inocular otros 5 ml de lb + tet medio con E. coli ER2738 a 37 oC durante la noche con temblor para amplificación de fagos.
NOTA: Utilice el cultivo de ER2738 en la fase de registro medio (OD600 a 0,5) para el rumbo del fago. Si la mayoría de las placas son blancas en placas X-gal/IPTG, significa que la piscina de fago sin ha sido contaminada con bacteriófagos silvestres. Si se produce contaminación, es necesario comenzar de nuevo con los pasos de panoramización de la solución de phage stock no contaminada.
4. Amplificación del fago
- Diluir (1:100) el cultivo nocturno del paso 3.8 en 20 ml de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Añadir el eluido no amplificado e incubar con agitación vigorosa durante 4,5 h a 37oC.
- Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y centrífuga durante 10 min a 12.000 x g a 4 oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, vuelva a centrifugar y deseche el pellet.
- Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo nuevo y agréguelo 1/6 volumen de 20% PEG/2.5 M NaCl. Deje que el fago se precipite a 4oC durante la noche.
NOTA: Mezcle bien el sobrenadante de cultivo con PEG/2.5 M NaCl. - Centrifugar el fago precipitado a 12.000 x g durante 15 min a 4oC. Deseche el sobrenadante, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante residual con una pipeta.
- Resuspenda el pellet en 1 ml de TBS y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo. Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min a 4oC.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6 de volumen de 20% PEG/2.5 M NaCl. Incubar sobre hielo durante 15-60 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante, vuelva a girar y retire el sobrenadante residual con una pipeta.
- Resuspenda el pellet en 200 ml de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo fresco para obtener el eluido amplificado.
- Ayune el fago amplificado como se describe en la sección 3.
NOTA: La dilución del eluido amplificado es mayor en comparación con el eluido no amplificado; por lo general se sugieren diluciones en serie de 108–1011.
5. Segunda ronda de bioparpanning
- Repita las secciones 2 a 4.
- Titer la segunda ronda del eluido amplificado en placas LB + IPTG/X-gal como se describe en la sección 3.
NOTA: Reduzca la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 a 5 g/ml. Utilice el fago amplificado del paso 4.7 como entrada y mantenga el rumbo igual que en la primera ronda (1011 PFU). Acortar el tiempo de incubación del fago y el plato recubierto de FGFR2 a 1 h y aumentar la concentración de tween a 0,1% (v/v) en los pasos de lavado.
6. Tercera ronda de bioparpanning
- Repita los pasos 2.1-2.6.
- Eluir el fago atado añadiendo 1 mL de solución de bFGF de 20 M (un ligando para FGFR2) al plato y meciéndose suavemente durante 60 minutos a temperatura ambiente.
- Repita los pasos 3.1-3.7.
NOTA: Reduzca la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 a 2,5 g/ml. Utilice la segunda ronda de fago amplificado de la sección 5 como entrada y mantenga el rumbo igual que en la primera ronda (1011 PFU). Acortar el tiempo de incubación del fago y el plato recubierto de FGFR2 a 30 min y aumentar la concentración de Tween a 0.5% (v/v) en los pasos de lavado.
7. Adquisición de ADN de placa para secuenciación
- Amplificación de la placa
- Diluir (1:100) un cultivo nocturno de ER2738 en LB. Dispensar 1 ml de cultivo diluido en un tubo de 2 ml, uno para cada clon a caracterizar.
- Utilice una punta de pipeta para elegir una placa de color azul bien separada de una placa de titer de la sección 6 y transferir la transferencia al tubo que contiene el cultivo diluido. Escoge un total de 15 placas.
NOTA: Las placas deben tener < 1-3 días de edad, almacenarse a 4 oC y tener < 100 placas. - Incubar los tubos con agitación vigorosa durante 4,5 h a 37oC.
- Transfiera los cultivos a tubos centrífugos y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y la centrífuga de nuevo.
- Con una pipeta, transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo nuevo. Etiquete esto como el material de fago amplificado.
NOTA: Diluir el fago amplificado con un volumen igual de glicerol 100% estéril y almacenar a -80 oC para su uso posterior.
- Extracción de ADN de placa
- Transfiera 500 l del fago amplificado a un tubo de microfúctil fresco y agregue un volumen de 1/6 de 20% PEG/2.5 M NaCl. Invertir para mezclar y dejar reposar durante 10-20 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y luego verter el sobrenadante.
NOTA: Es posible que el pellet de phage no sea visible. - Centrífuga otra vez. Retire con cuidado cualquier sobrenadante restante.
- Resuspenda el pellet a fondo en 100 ml del tampón de yoduro tocando vigorosamente el tubo.
- Añadir 250 s de 100% de etanol e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y retirar el sobrenadante. Lavar el pellet con 0,5 ml de etanol al 70%, centrifugar rápidamente de nuevo, eliminar el sobrenadante y secar brevemente el pellet.
- Resuspenda el pellet en 30 s de tampón TE y utilícelo para la secuenciación.
NOTA: Enfriar previamente el 70% de etanol a -20 oC antes del paso 7.2.6. El pellet de fago debe ser completamente resuspendido en el tampón de yoduro antes de la adición de etanol.
8. Identificación de la secuencia de péptidos
- Utilice la imprimación de secuenciación -96 gIII (5o-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3o) para la secuenciación.
- Analizar las secuencias de péptidos que se muestran en el fago en función de los resultados de secuenciación del ADN.
- Sintetizar pequeños péptidos y analizar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas para confirmar su pureza (98%).
9. Detectar la afinidad del pequeño péptido obtenido y la proteína extracelular de FGFR2 por ITC
- Desgasa agua estéril usando un instrumento ultrasónico. Disuelva el pequeño péptido y la proteína extracelular FGFR2 en agua estéril. Centrifugar estas muestras para eliminar el precipitado residual.
- Realice los experimentos de valoración de ITC a 25 oC. Valorar 40 m de péptido pequeño en la célula con 1,5 m de proteína FGFR2 de la jeringa, con una velocidad de agitación de 750 rpm. Añadir la proteína FGFR2 en alícuotas de 2 l (para un total de 19 inyecciones) a intervalos de 5 minutos.
- Analice los datos de ITC mediante un modelo de enlace de un solo sitio.
NOTA: El agua estéril debe desgasificarse y todas las muestras deben ser centrifugadas para eliminar las burbujas de aire y las impurezas residuales. El experimento debe llevarse a cabo a una temperatura constante de 25 oC.
10. Verificar la actividad biológica del pequeño péptido obtenido utilizando un ensayo de proliferación celular
- Células de semilla BALB/c 3T3 (3,0 x 103 células/pozo, 100 ol) en una placa de 96 pocillos con medio de águila modificado (DMM) de Dulbecco con suero bovino fetal (FBS) del 10% durante la noche a 37 oC y 5% de CO2.
- Sustituya el sobrenadante por DMEM fresco por un 0,5% de FBS y moce de hambre las células durante 12 h.
- Hacer diluciones en serie del péptido pequeño (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, y 100 m) con DMEM fresco complementado con 0.5% FBS (6 pozos duplicados / concentración). Retire el sobrenadante de la placa de 96 pocillos y agregue 100 ml de la solución de péptido pequeño por poca. Incubar durante 48 h a 37oC y 5% CO2.
- Reemplace el sobrenadante por una solución de DMEM fresca que contenga una solución de 10% Cell Counting Kit (CCK)-8 e incubar durante 2 h.
- Mida la absorbancia de cada pocal a 450 nm con un lector de microplacas y analice la viabilidad celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Obtención de un pequeño péptido de alta afinidad dirigido a FGFR2.
Para detectar fagos dirigidos a FGFR2, se utilizó una biblioteca Ph.D.-7 en este estudio. En la Figura 1se muestra una representación esquemática del flujo de trabajo. En este proceso, el número de entrada de fago (PFU) se mantuvo sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se redujo gradualmente. Los resultados del phage titer sugirieron que el número de fagos recuperados aumentó gradualmente, y después de 3 rondas, hubo un aumento de 65 veces en comparación con el de la primera ronda(Tabla 1).
A continuación, seleccionamos clones de fagos al azar después de la tercera ronda y extrajimos el ADN del fago para la secuenciación. Un péptido representativo (WRARVPL) obtenido por cribado se llamó SP1. Posteriormente fue sintetizado, y su peso molecular fue medido por espectrometría de masas.
El péptido SP1 mostró una alta afinidad de unión hacia FGFR2.
Se llevó a cabo un experimento del ITC para medir la afinidad del pequeño péptido con FGFR2. El resultado indica que el péptido SP1 tiene una alta afinidad con FGFR2 (Kd a 1,4 m; Figura 2). Esta fecha demostró la eficacia del protocolo de cribado.
El péptido SP1 inhibió el crecimiento de fibroblastos.
Para investigar la actividad biológica del péptido SP1, se realizó un ensayo de proliferación de fibroblastos utilizando un kit CCK-8. Las células BALB/c 3T3 se incubaron con el péptido SP1 a diferentes concentraciones (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 y 100 m). El resultado sugirió que el péptido SP1 suprimió el crecimiento de las células BALB/c 3T3(Figura 3).
Figura 1. Biopanto para péptidos pequeños dirigidos a FGFR2 mediante la biblioteca de visualización de fagos.
(A) Representación esquemática del cribado de péptidos pequeños mediante la biblioteca de visualización de fagos. Incubar la biblioteca que contiene 1011 PFU en un plato recubierto con FGFR2. Deseche los fagos no unidos lavando y eluda los fagos enlazados. Amplificar los fagos eluyed y utilizarlos como entrada para la siguiente ronda de biopanación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Medición de la afinidad de interacción entre el péptido SP1 y FGFR2 por ITC.
La proteína FGFR2 de 1,5 M fue valorada con 40 m del péptido SP1. Los datos de ITC se analizaron más a fondo utilizando el software Origin 7.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Efecto del péptido SP1 en el crecimiento de fibroblastos.
Las células BALB/c 3T3 fueron tratadas con el péptido SP1 a diferentes concentraciones (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 y 100 m). Los resultados se expresan como la media de SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Redondo | FGFR2 (g) | Fago de entrada (PFU) | Fago de salida (PFU) | Recuperación (%) | Enriquecimiento |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4.05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1.3 x 10-3 | 65 |
Tabla 1. Enriquecimiento de fagodirigido dirigido a FGFR2 en relación con la ronda 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Una biblioteca combinatorial de fagos es una herramienta poderosa y eficaz para el cribado de alto rendimiento de péptidos novedosos que pueden unir moléculas diana y regular su función13. Actualmente, las bibliotecas de péptidos de pantalla de fago tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar para seleccionar péptidos bioactivos unidos a proteínas receptoras23, objetivos no proteicos24,25, antígeno específico de la enfermedad imita13, péptidos específicos de la célula26, 27, o péptidos específicos de tejidos/órganos21,28,29 y el desarrollo de sistemas de administración de medicamentos mediados por péptidos19,30. En resumen, las bibliotecas de péptidos de visualización de fagos son sistemas útiles y eficientes para identificar péptidos específicos en la investigación básica y el desarrollo de la medicina traslacional. En el estudio, se utilizó una biblioteca para la detección de pequeños péptidos dirigidos a FGFR2 para la inhibición del crecimiento celular.
Los pasos críticos del protocolo se mencionan a continuación. En el paso de panoramización, debe evitarse la contaminación por fagos de tipo salvaje. Los fagos no unidos deben retirarse a fondo mediante un lavado vigoroso. Las placas LB + IPTG/X-gal para el curso del fago deben precalentarse a 37 oC. Para el curso de fago, E. coli ER2738 debe cultivarse hasta la fase de mitad del registro (OD600 a 0,5). En el paso 4.3, el fago debe precipitarse durante la noche a 4oC. Las placas azules bien separadas deben recogerse de platea que contengan menos de 100 placas para la secuenciación del ADN. En el paso 7.2.6, la solución de etanol del 70% debe enfriarse previamente a 20 oC de antelación. Por último, para el experimento ITC, el agua estéril debe ser desgasificada, y todas las muestras deben ser centrifugadas para eliminar las burbujas de aire y las impurezas residuales. El experimento debe llevarse a cabo a una temperatura constante de 25 oC.
Algunos factores que pueden afectar la calidad de los golpes obtenidos22 son los siguientes: 1) En la primera ronda de cribado, el número de entradas de fago debe ser de 1011 PFU. Sin embargo, en la siguiente ronda de cribado, la entrada puede ser menor. 2) Se debe mantener un entorno puro para evitar la contaminación por fagos de tipo salvaje. 3) 3 o 4 rondas de cribado suelen ser suficientes. Evite sobre-panning la biblioteca de péptidos. 4) En cada ronda, la cantidad de proteína diana se reduce gradualmente, mientras que el contenido de Tween se incrementa gradualmente en el paso de lavado. Además, el tiempo de incubación del fago y el plato recubierto de FGFR2 también se acorta gradualmente. Si la mayoría de las placas de fago eludado son blancas en placas X-gal/IPTG, esto sugiere contaminación por fagos de tipo salvaje. Con el fin de evitar un poco de fago amplificado en el proceso de panorámica, los cultivos deben estar bien aireados e infectados al principio de su fase de crecimiento (OD600 < 0.05).
En este estudio, el péptido SP1 mostró una alta afinidad hacia FGFR2 (Kd 1,4 m; Figura 2) y buena actividad biológica(Figura 3). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el protocolo fue eficaz en la selección de péptidos contra el dominio extracelular de la proteína FGFR2, aunque tenga en cuenta que debido a la alta similitud de secuencia de los miembros de la familia FGFR, el péptido SP1 puede tener cierta afinidad de unión con FGFR familiares además de FGFR2, que podría ser responsable de la actividad biológica vista. Además, en el proceso de panoramización, el FAage ELISA es una alternativa para identificar los fagos positivos cualitativamente. Sin embargo, en nuestro laboratorio, siempre obtenemos los péptidos mediante la secuenciación y evaluación cuantitativa de su afinidad por el ensayo ITC y no hemos tenido problemas para evaluar y seleccionar los péptidos candidatos.
La biblioteca de visualización de fagos tiene varias ventajas22. Las bibliotecas son de alta capacidad (hasta 1011 PFU) y se pueden utilizar in vitro, in vivo y exvivo. Las bibliotecas son altamente eficientes, fáciles de manejar, baratas y disponibles comercialmente. Sin embargo, hay ciertas limitaciones de la tecnología. Las bibliotecas sólo contienen aminoácidos proteinogénicos y sólo son susceptibles a péptidos lineales y simples cíclicos sin estructuras complicadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (No. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
