Summary
在此，我们提出了使用噬菌体显示肽库筛选与 FGFR2 结合的小肽的详细方案。我们进一步分析了所选肽在体外对FGFR2的亲和力及其抑制细胞增殖的能力。
Abstract
人类纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族由四个成员组成，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，它们参与各种生物活动，包括细胞增殖、存活、迁移和分化。由于突变或基因扩增事件，FGFR信号通路中的几个畸变在不同类型的癌症中被识别出来。因此，最近的研究侧重于开发涉及FGFRs治疗靶向的策略。 目前在临床前和临床开发的不同阶段，目前的FGFR抑制剂包括酪氨酸激酶的小分子抑制剂或单克隆抗体，管道中只有几种肽抑制剂。在这里，我们提供了一个协议，使用噬菌体显示技术来筛选小肽作为FGFR2的拮抗剂。简单地说，在涂有FGFR2的板中孵育出一个噬菌体显示肽库。随后，未结合的噬菌体被TBST（TBS = 0.1%[v/v]补间-20）洗掉，并结合噬菌体用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.2）洗净。洗脱的噬菌体被进一步放大，并用作下一轮生物泛化的输入。经过三轮生物盘分，通过DNA测序确定了单个噬菌体克隆的肽序列。最后，对筛选的肽进行合成，分析亲和力和生物活性。
Introduction
纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在细胞增殖、伤口愈合和体内血管生成中起着关键作用。在各种肿瘤2、3、4、5中观察到的FGFR信号异常激活包括基因扩增、基因突变、染色体畸变和过量配体分泌6.许多针对FGFRs的抑制剂在临床试验中显示出有希望的治疗效果，主要分为三类：（1）小分子激酶抑制剂，它与FGFR的细胞内域结合，（2）针对细胞外段和（3）FGF配体陷阱6。虽然几种小分子激酶抑制剂在体外和体内均具有良好的治疗效果，但大部分靶点特异性较差，并表现出高血压8等不良反应。大多数拮抗剂是单克隆抗体9、10和多肽11。肽具有比小分子的优势，由于其特异性和较低的副作用。与蛋白质药物12相比，它们还保留了细胞渗透性，不会在特定器官中积累。因此，靶向小肽是有效和前瞻性的治疗剂。
噬菌体显示技术是一个简单但强大的工具，用于识别小肽，它可以结合到给定的分子13，14，15。我们使用一个噬菌体显示肽库，它基于一个简单的M13噬菌体，在尾部显示超过109个不同的肽序列，以便与目标分子结合（见材料表）16。由于噬菌体对给定分子的亲和力高，未结合的噬菌体可以被冲走，并且只保留与所需短肽紧密结合的噬菌体。给定的分子靶点可以固定蛋白质17，18，碳水化合物，培养细胞，甚至无机材料19，20。一个令人兴奋的案例是，使用噬菌体显示技术21在体内选择器官特异性肽。噬菌体显示技术的优点包括高通量、易操作性、低成本和广泛的应用22。
在这项研究中，我们使用噬菌体显示库提供了筛选与固定蛋白（FGFR2）结合的小肽的详细方案。通过测量通过同质滴度测定仪（ITC）获得的肽对FGFR2的亲和力，以及通过细胞增殖测定的生物活性，也检查了该技术的疗效。该方法可以扩展用于筛选与碳水化合物、培养细胞甚至无机材料结合的小肽。
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Protocol
1. 试剂制备
- LB（溶菌肉汤）介质：在H2O高压灭菌剂100 mL中溶解1克胰腺酮、0.5克酵母提取物和0.5克NaCl，并储存在4°C处。
- 四环素库存：在1：1乙醇中制备20mg/mL：H2O.在-20°C储存，并在使用前涡流。
- IPTG/X-gal 溶液：将 0.5 g 的 IPTG（二丙基 β-D-1-硫丙酮）和 0.4 g X-gal（5-溴-4-氯-3-indolyl β-D-角质苷）混合在 10 mL 的 DMF（二甲基甲酰胺）中。溶液可在黑暗中在-20°C下储存一年。
- LB = 四环素 （Tet） 板：分离 1 克细菌-锥酮、0.5 g 酵母提取物、0.5 g NaCl 和 1.5 g Agar，在 100 mL H2O. 高压灭菌中冷却至 <70°C。加入100 μL的四环素股票和倒板。在黑暗中将盘子储存在4°C下。
- LB = IPTG/X-gal 板：在 H2O 高压灭菌剂 100 mL 中溶解 1 克细菌-锥酮、0.5 g 酵母提取物、0.5 g NaCl 和 1.5 g 琼脂，冷却至 < 70°C。加入 100 μL 的 IPTG/X-gal 溶液并倒板。在黑暗中将盘子储存在4°C下。
- 甘氨酸-HCI缓冲液（0.2M）：在H2O的100 mL中溶解1.5014克甘氨酸和100毫克BSA（牛血清白蛋白），并使用HCl过滤溶液，用0.22 μm过滤器将溶液调节至2.2，并储存在4°C。
- Tris-HCl缓冲液（1M）：将12.11克三联（三苯甲酸）甲烷溶解在H2O的100 mL中，用HCl高压灭菌器将pHH值调整至9.1，并储存在4°C处。
- 涂层缓冲液（0.1 M）：在H2O的200 mL中溶解1.68克NaHCO3，使用NaOH将pHH调整为8.6。使用 0.22 μm 过滤器过滤溶液，并储存在 4°C。
- 阻断缓冲液：用5毫克/mL BSA制备0.1M NaHCO 3（pH 8.6）。使用 0.22 μm 过滤器过滤溶液，并储存在 4°C。
- TBS：使用 150 mM NaCl 准备 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）。高压灭菌器在室温下储存。
- 0.05%、0.1% 或 0.5% TBST：使用 0.05%、0.1% 或 0.5%（v/v）补间 20 的 TBS 制备 TBS。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤，并在室温下储存。
- PEG/NaCl：使用 2.5 M NaCl 制备 20% （w/v） 聚乙烯乙二醇=8000。高压灭菌器在室温下储存。
- TE 溶液：将 1 m L 的 1 M Tris-HCl （pH8.0） 和 2 mL 的 50 mM EDTA （pH 8.0） 混合，使用 H2O 高压灭菌器将音量调节到 100 mL，并在室温下储存。
- 碘化物缓冲液：将30克NaI溶解在50 mL的TE中，pH 8.0。在黑暗中将溶液储存在室温下。
- 顶Agar：在H2 O高压灭菌剂100 mL中溶解1克胰胶、0.5克酵母提取物、0.5克NaCl和0.7g琼脂素，并分配成15 mL阿利胶。储存在室温下使用。
2. 第一轮生物泛：筛选与FGFR2细胞外域结合的噬菌体克隆
注：使用耐气溶胶移液器吸头，并对所有方案戴上手套，以尽量减少对环境噬菌体的污染。
- 在涂层缓冲液中制备10μg/mL FGFR2（纯度>97%;参见材料表）溶液。将1 mL的制备溶液加入35cm2盘中，反复旋转，直到表面完全湿润。在4°C下孵育过夜，摇动。
注：为了避免选择诱饵靶粘结剂，目标蛋白必须高度纯化。 - 在37°C下用大肠杆菌（大肠杆菌）ER2738接种5 mL的LB+ Tet介质，在37°C下摇动5~10小时。在步骤3.3中，扩增的ER2738细胞将用于滴定。
- 从盘中倒出涂层溶液（必须去除多余的溶液），并加入堵塞溶液。在4°C孵育至少1小时。
- 丢弃阻塞溶液，使用 TBST 快速洗涤 6 次（TBS = 0.05%（v/v= 补间-20）。避免把盘子晾干。
- 在 1 mL 的 TBST 中重建原始噬菌体库 [最终浓度为10 11块状斑块形成单元 （PFU）]，加入涂层盘，并在室温下在摇摇器上轻轻摇动 2 小时。
- 丢弃上清液，用 TBST（TBS = 0.05% （v/v） 补间-20）洗涤 10 倍，如步骤 2.4 中执行的那样。
注：未经约束的噬菌体必须通过剧烈清洗彻底清除。 - 在盘中加入1 mL的0.2M甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.2），在室温下轻轻摇动10分钟，从而洗紧结合的噬菌体。
- 将洗液转移到灭菌的微熔管中，用 100 μL 的 1 M Tris-HCl、pH 9.1 中和。
注：在步骤2.6中，通过用力清洗10倍的盘子，尽可能去除未结合的噬菌体。这是关键的一步。洗脱的噬菌体可以在4°C下储存一周。但是，最好尽快进入下一步。
3. 洗脱噬菌体的蒂特测定
- 预加热 LB = IPTG/X-gal 板在 37°C 下至少 1 小时使用。
- 从 LB 步骤 2.8 中制备 100 μL 的 10 倍串行稀释液（即 101、102、103和 104）的洗脱液。
- 让步骤 2.2 中的区域性达到中日志阶段 （OD600 = 0.5）。将200 μL的培养液放入灭菌的微熔管中，每个洗脂液稀释一个。
- 要启动感染，从步骤 3.2 将每个稀释的 10 μL 添加到步骤 3.3 中含有大肠杆菌ER2738 培养的单个微熔管。涡旋快速，在室温下孵育5分钟。
- 将 90 μL 的混合物从步骤 3.4 涂入 LB +IPTG/X-gal 板，并涂有涂布棒。
- 可选择在微波炉中熔化顶部琼脂，将 3 mL 分配到无菌培养管中，每个渗出稀释管一个，并将管保持在 45°C。将混合物从步骤 3.4 转移到含有 45°C 顶部琼脂的培养管。快速混合并立即将培养层倒入预热的 LB/IPTG/X-gal 板。轻轻倾斜并旋转板，均匀地铺开顶部琼脂。
- 5分钟后，在37°C下倒置和孵育板过夜。
- 计算板上大约 100 块斑块的斑块。将每个数字乘以该板的稀释系数，以获得 PFU 中每 10 μL 中的噬菌体位。
- 在37°C处用大肠杆菌ER2738接种另一种5 mL的LB+ Tet介质，通过颤抖进行噬菌体扩增。
注：在中日志相（OD600 = 0.5）使用ER2738培养法进行噬菌体端炎。如果X-gal/IPTG板上的大部分斑块是白色的，这意味着噬菌体池已被野生噬菌体污染。如果发生污染，有必要从未受污染的噬菌体溶液中重新开始平移步骤。
4. 噬菌体扩增
- 在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中，在 20 mL 的 LB 中，从步骤 3.8 稀释 （1：100） 的隔夜培养。加入未放大的埃卢特，在37°C下剧烈摇动孵育4.5小时。
- 将培养层转移到离心管和离心机10分钟，在4°C下12，000 x g。将上清液转移到新鲜的管中，再次离心，然后丢弃颗粒。
- 将上半上清液的上半部分转移到新鲜管中，并加入 1/6 体积的 20% PEG/2.5 M NaCl。让噬菌体在4°C过夜沉淀。
注：将文化上清液与 PEG/2.5 M NaCl 良好混合。 - 在4°C下，在12，000 x g下将沉淀的噬菌体离心15分钟。丢弃上清液，再次离心，用移液器去除残留的上清液。
- 将颗粒悬浮在 TBS 的 1 mL 中，并将上清液转移到微熔管中。在 12，000 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
- 将上清液转移到新鲜的微熔管中，通过添加 1/6 体积 20% PEG/2.5 M NaCl 再次沉淀。在冰上孵育15-60分钟，在12，000 x g下在4°C下进行10分钟的离心机。丢弃上清液，重新旋转，用移液器去除残留的上清液。
- 在 200 μL TBS 和离心机中重新悬浮颗粒，再悬浮一分钟以去除杂质。将上清液转移到新鲜的微熔管中，以获得扩增的埃卢特。
- 如第 3 节所述，对扩增噬菌体进行分片。
注：与未扩增的增升升气剂相比，放大的升埃鲁脱酯的稀释度更高;通常建议进行 108+1011的连续稀释。
5. 第二轮生物泛性
- 重复第 2 节到第 4 节。
- 如第 3 节所述，在 LB + IPTG/X-gal 板上的第二轮放大升光的升光。
注：将FGFR2蛋白的涂层浓度降至5微克/mL。使用步骤 4.7 中的扩增噬菌体作为输入，并保持第一轮 （1011 PFU） 中的点音。将噬菌体和FGFR2涂层培养皿的孵育时间缩短至1小时，并将洗涤步骤中的补间浓度提高到0.1%（v/v）。
6. 第三轮生物泛性
- 重复步骤 2.1-2.6。
- 在盘中加入1mL的20μM bFGF溶液（FGFR2的配体），在室温下轻轻摇动60分钟，从而洗除了结合的噬菌体。
- 重复步骤 3.1-3.7。
注：将FGFR2蛋白的涂层浓度降至2.5微克/mL。使用第 5 节中的第二轮扩增噬菌体作为输入，并保持第一轮 （1011 PFU） 中的音位相同。将噬菌体和FGFR2涂层培养皿的孵育时间缩短至30分钟，并将洗涤步骤中的补间浓度提高到0.5%（v/v）。
7. 采集斑块DNA进行测序
- 斑块放大
- 稀释（1：100）在LB中稀释ER2738的过夜培养，将1mL的稀释培养剂放入2 mL管中，每个克隆一个进行特征化。
- 使用移液器尖端从第 6 节的点子板中挑选一个分离良好的蓝色斑块，并转移到包含稀释培养的管中。共挑选15块斑块。
注：板材应为<1~3天，储存在4°C，并具有<100斑块。 - 在37°C下，用剧烈摇动孵育管4.5小时。
- 将培养物转移到离心管和离心机，在12，000 x g下30s。将上清液转移到新鲜的管中，然后再次离心。
- 使用移液器，将上清液的上部 80% 转移到新管中。将其标记为扩增噬菌体。
注：用等于100%无菌甘油的体积稀释扩增的噬菌体，并储存在-80°C，供日后使用。
- 斑块DNA的提取
- 将500 μL的扩增噬菌体转移到新鲜的微电管中，并加入1/6体积的20%PEG/2.5 M NaCl。反转混合，让它在室温下站立10-20分钟。
- 在12，000 x g下在4°C下离心10分钟，然后倒出上清液。
注： 噬菌体颗粒可能不可见。 - 再次离心。小心地去除所有剩余的上清液。
- 通过大力敲击管，将颗粒彻底悬浮在碘化物缓冲液的100 μL中。
- 加入250μL100%乙醇，在室温下孵育15分钟。
- 在12，000 x g下在4°C下离心10分钟，并去除上清液。用 0.5 mL 的 70% 乙醇清洗颗粒，快速再次离心，去除上清液，并短暂干燥颗粒。
- 将颗粒重新悬浮在30μL的TE缓冲液中，并用它来进行测序。
注：在步骤 7.2.6 之前在 -20°C 下预冷却 70% 乙醇。在添加乙醇之前，噬菌体颗粒必须彻底重新悬浮在碘化物缓冲液中。
8. 肽序列的识别
- 使用-96 gIII测序引漆（5~CCC TCA TAG TGCG TAA CG +3+）进行测序。
- 根据DNA测序结果分析噬菌体上显示的肽序列。
- 通过高性能液相色谱（HPLC）和质谱法合成小肽并进行分析，确认其纯度（±98%）。
9. 检测ITC获得的小肽和细胞外蛋白FGFR2的亲和力
- 使用超声波仪器的脱气无菌水。在无菌水中溶解小肽和FGFR2细胞外蛋白。离心这些样品以去除残留沉淀物。
- 在 25°C 下执行 ITC 滴定实验。在细胞中用1.5μM的FGFR2蛋白从注射器中加入40μM的小肽，搅拌速度为750rpm。以5分钟为间隔以2μL等分（共19次注射）加入FGFR2蛋白。
- 使用单站点绑定模型分析 ITC 数据。
注：无菌水必须脱气，所有样品必须离心，以去除气泡和残留杂质。实验必须在25°C的恒温下进行。
10. 使用细胞增殖测定验证获得的小肽的生物活性
- 种子BALB/c 3T3细胞（3.0 × 103细胞/孔，100μL）在96孔板与Dulbeco的改性鹰介质（DMEM）与10%胎儿牛血清（FBS）过夜在37°C和5%CO2。
- 用 0.5% FBS 替换新的 DMEM 上清液，使细胞饿死 12 小时。
- 使小肽（0、0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20 和 100 μM）进行连续稀释，并辅以 0.5% FBS（6 个重复井/浓度）。从96孔板中取出上清液，每孔加入100μL的小肽溶液。在37°C下孵育48小时，孵化5%CO2。
- 用含有10%细胞计数试剂盒（CCK）-8溶液的新鲜DMEM替换上清液，孵育2小时。
- 使用微孔板读取器测量每口孔在 450 nm 处的吸光度，并分析细胞的生存能力。
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Representative Results
获得针对FGFR2的高亲和力小肽。
为了筛选针对FGFR2的噬菌体，本研究使用了一个Ph.D.-7库。工作流的原理图表示形式如图1所示。在此过程中，噬菌体输入（PFU）的数量保持不变，而FGFR2蛋白的涂层浓度逐渐降低。噬菌体命名结果表明，恢复的噬菌体数量逐渐增加，3轮后，与第一轮相比增加了65倍（表1）。
接下来，我们在第三轮后随机挑选噬菌体克隆，并提取噬菌体DNA进行测序。通过筛选获得的一种代表性肽（WRARVPL）被命名为SP1。随后合成了它，其分子量通过质谱测量。
SP1肽对FGFR2表现出高结合亲和力。
进行了一项ITC实验，以测量小肽与FGFR2的亲和力。结果表明，SP1肽对FGFR2（Kd = 1.4μM） 具有高亲和力;图 2.这个日期证明了筛选协议的效率。
SP1肽抑制成纤维细胞的生长。
为了研究SP1肽的生物活性，使用CCK-8试剂盒进行了成纤维细胞增殖测定。BALB/c 3T3细胞用不同浓度的SP1肽孵育（0，0.0064，0.032，0.16，0.8，4，20和100μM）。结果表明，SP1肽抑制了BALB/c 3T3细胞的生长（图3）。
图 1.使用噬菌体显示库对FGFR2进行小肽的生物泛性。
（A） 使用噬菌体显示库的小肽筛选的原理表示。在涂有 FGFR2 的培养皿中孵育包含 1011 PFU 的库。通过洗涤丢弃未结合的噬菌体，并洗脱带束的噬菌体。放大洗脱的噬菌体，并把它们用作下一轮生物泛化的输入。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.通过 ITC 测量 SP1 肽和 FGFR2 之间的相互作用的亲和力。
1.5 μM FGFR2蛋白与40μM的SP1肽进行分子。使用起源7.0软件进一步分析了国特克的数据。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.SP1肽对成纤维细胞生长的影响。
BALB/c 3T3细胞用不同浓度的SP1肽处理（0，0，0.0064，0.032，0.16，0.8，4，20和100μM）。结果以均值 = SD 表示。请点击此处查看此图的较大版本。
| 轮 | FGFR2 （μg） | 输入噬菌体 （PFU） | 输出噬菌体 （PFU） | 恢复（%） | 富 集 |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3.98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4.05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1.3 x 10-3 | 65 |
表 1.相对于第 1 轮，针对 FGFR2 的噬菌体富集。
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Discussion
组合噬菌体库是一种强大而有效的工具，用于高通量筛选新型肽，这种肽可以结合目标分子并调节其功能13。目前，噬菌体显示肽库有着广泛的应用。例如，它们可用于选择与受体蛋白23结合的生物活性肽23、非蛋白靶点24、25、疾病特异性抗原模仿13、细胞特异性肽26、27，或组织/器官特异性肽21，28，29和开发肽介导药物输送系统19，30。简而言之，噬菌体显示肽库是识别转化医学基础研究和开发中特定肽的有用而有效的系统。在这项研究中，一个库用于筛选针对FGFR2的细胞生长抑制的小肽。
协议的关键步骤如下所述。在平移步骤中，必须避免野生型噬菌体的污染。未经约束的噬菌体必须通过剧烈清洗彻底清除。用于噬菌体酸度仪的 LB + IPTG/X-gal 板必须预加热到 37°C。对于噬菌体定位剂，大肠杆菌ER2738 必须生长到中日志阶段 （OD600 = 0.5）。在步骤4.3中，噬菌体必须在4°C处过夜沉淀。必须从含有少于100个斑块的板片中挑选出分离良好的蓝色斑块，以便进行DNA测序。在步骤 7.2.6 中，70% 乙醇溶液必须在 20°C 前冷却。最后，对于国图实验，必须对无菌水进行脱气，并且所有样品都必须离心，以去除气泡和残留杂质。实验必须在25°C的恒温下进行。
影响22次命中质量的一些因素如下：1） 在第一轮筛查中，噬菌体输入数需要为1011 PFU。但是，在下一轮筛选中，输入可能较低。2） 必须保持纯净的环境，以避免野生型噬菌体污染。3） 3 或 4 轮筛查通常就足够了。避免过度平移肽库。4） 在每轮中，目标蛋白的含量逐渐减少，而补间的含量在洗涤步骤中逐渐增加。此外，噬菌体和FGFR2涂层培养的培养时间也逐渐缩短。如果X-gal/IPTG板上的大多数洗脱的噬菌体斑块是白色的，则表明野生型噬菌体会污染。为了避免在平移过程中低点子的扩增噬菌体，培养物必须在生长阶段早期良好加气和感染（OD600 < 0.05）。
在本研究中，SP1肽对FGFR2（Kd = 1.4μM;图 2）和良好的生物活性（图3）。因此，我们的结果表明，该方案在针对FGFR2蛋白的细胞外领域选择肽方面是有效的，尽管请注意，由于FGFR家族成员的序列相似性高，SP1肽可能与FGFR具有一定的结合亲和力家庭成员，除了FGFR2，这可能是对生物活动看到的负责。此外，在平移过程中，噬菌体 ELISA 是定性识别阳性噬菌体的替代物。然而，在我们的实验室中，我们总是通过ITC测定对肽进行测序和评估，并定量地评估其亲和力，在评估和选择候选肽时没有问题。
噬菌体显示库有几个优点22。图书馆容量大（最多10个11个PFU），可在体外、体内和外体使用。图书馆效率高，易于操作，价格低廉，而且具有商业性。但是，该技术存在某些限制。该库仅包含蛋白质氨基酸，仅适合线性和简单的循环肽，无需复杂的结构。
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Disclosures
提交人声明没有财务利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了广州市科技计划（第201620160403039号）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
