Summary
본 명세서에서, 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 사용하여 FGFR2에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 시험관내에서 FGFR2를 향한 선택된 펩티드의 친화도 및 세포 증식을 억제하는 능력을 추가로 분석한다.
Abstract
인간 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 패밀리는 세포 증식, 생존, 이동 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 활동에 관여하는 4개의 멤버, 즉 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4를 포함한다. 돌연변이 또는 유전자 증폭 사건으로 인해 FGFR 신호 통로에 있는 몇몇 수차는, 암의 각종 모형에서 확인되었습니다. 따라서, 최근 연구는 FGFRs의 치료 표적화와 관련된 전략 개발에 초점을 맞추고있다. 단클론 항체, 파이프 라인에 몇 펩티드 기반 억제제. 여기서, 우리는 FGFR2의 길항제로 작은 펩티드를 스크리밍하는 파지 디스플레이 기술을 이용한 프로토콜을 제공한다. 간략하게, 파지-디스플레이 펩티드라이브러리를 FGFR2로 코팅된 플레이트에 배양하였다. 이어서, 언바운드 파지를 TBST(TBS + 0.1% [v/v] 트웬-20)에 의해 세척하고, 결합된 파지를 0.2 M 글리신-HCl 완충액(pH 2.2)으로 용출하였다. 용출된 파지는 더욱 증폭되었고 다음 바이오패닝 라운드에 대한 입력으로서 사용되었다. 바이오패닝의 3라운드에 이어, 개별 파지 클론의 펩티드 서열은 DNA 염기서열 분석으로 확인되었다. 마지막으로, 스크리마한 펩티드를 합성하고 친화성 및 생물학적 활성을 분석하였다.
Introduction
섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFRs)는 생체 내 세포 증식, 상처 치유 및 혈관신생에 중요한 역할을한다. 다양한 종양에서 관찰되는 FGFR 신호의 비정상적인 활성화2,3,4,5는 유전자 증폭, 유전자 돌연변이, 염색체 수차 및 과도한 리간드 분비를 포함한다6 . FGFRs를 표적으로 하는 많은 억제제는 임상 시험에서 유망한 치료 효과를 보여주었으며 주로 세 가지 유형으로 분류됩니다: (1) FGFR의 세포내 도메인에 결합하는 소분자 키나아제 억제제, (2) 길항제를 표적으로 하는 길항제 세포 외 세그먼트, 및 (3) FGF 리간드 트랩6. 몇몇 소분자 키나아제 억제제는 시험관내 및 생체내 모두 좋은 치료 효과를 가지고 있지만7,그들 대부분은 표적 특이성이 좋지 않으며 고혈압8과같은 부작용을 나타낸다. 길항제의 대다수는 단일클론 항체9,10 및 폴리펩티드11이다. 펩티드는 특이성과 낮은 부작용으로 인해 작은 분자에 비해 장점이 있습니다. 그(것)들은 또한 세포 투과성을 유지하고 단백질 약12에비교된 특정 기관에 축적되지 않습니다. 따라서, 표적된 작은 펩티드는 모두 효과적이고 장래치료제이다.
파지 디스플레이 기술은 주어진 분자13,14,15에결합 할 수있는 작은 펩티드를 식별하기위한 쉽고 강력한 도구입니다. 표적 분자에 결합하기 위해 꼬리에 표시된 10개 이상의9개 상이한 펩타이드 서열을 가진 간단한 M13 파지를 기반으로 하는 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하였다(재료표 참조)16. 주어진 분자를 향한 파지의 높은 친화도 로 인해, 언바운드 파지는 멀리 세척 될 수 있으며, 원하는 짧은 펩티드와 단단히 결합 된 파지만 유지됩니다. 주어진 분자 표적은 단백질17,18,탄수화물, 배양 세포, 또는 무기 물질19,20을고정화시킬 수 있다. 파지 디스플레이기술(21)을이용하여 생체 내에서 장기 특이적 펩타이드가 선택된 곳에서 흥미로운 사례가 보고되었다. 파지 디스플레이 기술의 장점은 높은 처리량, 작동 용이성, 저렴한 비용 및 광범위한 응용 분야22를포함한다.
본 연구에서, 우리는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 고정화 단백질(FGFR2)에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 기술의 효능은 또한 등소말 적정 열량계(ITC)에 의해 FGFR2를 향하여 얻어진 펩티드의 친화도 및 세포 증식 분석에 의한 생물학적 활성을 측정함으로써 조사된다. 상기 방법은 탄수화물, 배양세포, 또는 무기물질에 결합하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위해 확장될 수 있다.
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Protocol
1. 시약 준비
- LB (리소제니 국물) 매체: 트립톤 1g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g을 H2O. 오토클레이브 100 mL에 녹여 4°C에서 보관합니다.
- 테트라 사이클린 재고: 1:1 에탄올:H2O. -20°C에 보관하고 사용하기 전에 소용돌이에 20 mg/mL을 준비하십시오.
- IPTG/X-gal 용액: 0.5 g의 IPTG(이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드)와 X-gal 0.4 g(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴라일 β-D-갈락토사이드)을 DMF 10 mL(디메틸 포마미드)에 섞는다. 용액은 어둠 속에서 1년 동안 -20°C에서 보관할 수 있다.
- LB + 테트라 사이클린 (Tet) 플레이트 : 바토 트립톤 1 g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g, 한천 100 mL에서 H2O. 오토 클레이브를 100 mL로 디스브하고 70 °C로 식힙니다. 테트라사이클린 스톡 100 μL을 넣고 접시를 붓습니다. 접시를 어둠 속에서 4 °C에서 보관하십시오.
- LB + IPTG /X-gal 플레이트: 바토 트립톤 1 g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g, 한천 100 mL에 H2O. 오토클레이브를 녹여 70°C까지 식힙니다. IPTG/X-gal 용액 100 μL을 추가하고 플레이트를 붓습니다. 접시를 어둠 속에서 4 °C에서 보관하십시오.
- 글리신-HCI 완충액(0.2M):H2O의 100 mL에서 글리신 1.5014 g과 BSA(소 혈청 알부민) 100 mg을 용해시키고 HCl로 pH를 2.2로 조정하고 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 4°C에서 저장합니다.
- Tris-HCl 버퍼 (1 M): 100 mL의 H2O에서 트리스 (트리스 (하이드록시메틸)아미노 메탄) 12.11 g을 용해하고 HCl. 오토클레이브로 pH를 9.1로 조정하고 4 °C에서 저장하십시오.
- 코팅 버퍼(0.1 M):H2O의 200 mL에서 NaHCO3의 1.68 g을 용해하고 NaOH를 사용하여 pH를 8.6으로 조정합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 걸과 4°C에 보관하십시오.
- 블로킹 버퍼: 5 mg/mL BSA로 0.1 M NaHCO3(pH 8.6)을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 걸과 4°C에 보관하십시오.
- TBS : 150 mM NaCl로 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)을 준비하십시오. 오토클레이브를 하고 실온에서 보관하십시오.
- 0.05%, 0.1%, 0.5% TBST: 0.05%, 0.1%, 0.5%(v/v) Tween-20으로 TBS를 준비합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터를 사용하여 실온에서 보관하십시오.
- PEG/NaCl: 2.5 M NaCl으로 폴리에틸렌 글리콜-8000을 20% 준비합니다. 오토클레이브를 하고 실온에서 보관하십시오.
- TE 용액: 1 mM Tris-HCl(pH8.0) 및 50 mM EDTA(pH 8.0)의 2mL 의 1mL를 혼합하고 H2O. 오토클레이브로 100 mL로 볼륨을 조정하고 실온에서 보관하십시오.
- 요오드화 버퍼: TE, pH 8.0의 50 mL에 NaI 30 g을 용해시다. 용액을 실온에서 어두운 온도에 보관하십시오.
- 탑 한천: 트립톤 1g, 효모 추출물 0.5 g, NaCl 0.5 g, 아가린 0.7 g을 H2O. 오토클레이브 100 mL에 녹여 15 mL 의 양현종으로 분배합니다. 사용하기 위해 실온에서 보관하십시오.
2. 바이오 패닝의 첫 번째 라운드 : FGFR2의 세포 외 도메인에 결합 파지 클론을 선별
참고: 에어로졸 내성 파이펫 팁을 사용하고 모든 프로토콜에 장갑을 착용하여 환경 박테리오파지의 오염을 최소화하십시오.
- 코팅 버퍼에서 10 μg/mL FGFR2(순도 > 97%, 재료 표참조) 용액을 준비합니다. 준비된 용액 1mL를 35cm2 접시에 넣고 표면이 완전히 젖을 때까지 반복적으로 소용돌이치세요. 4°C에서 밤새 배양하고 흔들어.
참고: 미끼 표적 바인더의 선택을 피하려면 표적 단백질을 고도로 정제해야 합니다. - 대장균(E. coli) ER2738을 37°C에서 5-10시간 동안 흔들어 LB+ 테트 배지 5 mL을 접종합니다. 증폭된 ER2738 셀은 3.3단계에서 적정에 사용될 것이다.
- 접시에서 코팅 용액을 붓고 (여분의 용액을 제거해야합니다) 차단 용액을 추가하십시오. 적어도 1 시간 동안 4 °C에서 배양하십시오.
- 차단 용액을 버리고 TBST (TBS + 0.05 % (v / v] 트위엔-20)로 6 번 빨리 씻으십시오. 접시를 말리지 마십시오.
- TBST의 1 mL [최종 농도 1011 플라크 형성 단위 (PFU)]에서 원래파지 라이브러리를 재구성하고, 코팅 된 접시에 추가하고 실온에서 셰이커에 2 시간 동안 부드럽게 바위.
- 상급제를 버리고 2.4 단계에서 수행 된 대로 TBST (TBS + 0.05 % ( v / v) 트위엔-20)로 접시를 10 배 씻으십시오.
참고 : 언 바운드 파지는 격렬한 세척으로 철저히 제거해야합니다. - 접시에 0.2 M 글리신-HCl 완충제(pH 2.2)의 1 mL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들어 결합된 파지를 용해시다.
- 용출액을 멸균 된 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 1M Tris-HCl, pH 9.1의 100 μL로 중화하십시오.
참고: 2.6단계에서는 접시를 10배 씩 힘차게 세척하여 언바운드 파지를 최대한 제거합니다. 이것은 중요한 단계입니다. 용출된 파지는 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 그러나 가능한 한 빨리 다음 단계로 진행하는 것이 가장 좋습니다.
3. 용출 된 파지의 역가 결정
- 사용하기 전에 37 °C에서 적어도 1 시간 동안 미리 따뜻한 LB + IPTG / X-gal 플레이트.
- 10배 직렬 희석제 100 μL(예: 101,102,102, 10 3 및 104)을LB의 2.8단계에서 용루액의 100 μL을 준비하십시오.
- 2.2 단계로부터배양액이 중간 로그 단계(OD600 □ 0.5)에 도달하게 한다. 배양의 200 μL을 멸균 된 마이크로 퍼지 튜브에 분배하고 각 용루활원 희석에 대해 하나씩 분배합니다.
- 감염을 개시하기 위하여는, 단계 3.3에서 대장균 ER2738 배양을 포함하는 개별적인 microfuge 관에 단계 3.2에서 각 희석의 10 μL를 추가합니다. 소용돌이를 빠르게 하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 코팅 스틱으로 LB + IPTG / X-gal 플레이트에 3.4 단계에서 혼합물의 90 μL을 코팅합니다.
- 선택적으로, 전자레인지에서 상부 한천을 녹이고, 멸균 배양 튜브에 3 mL을 분배하고, 각 용루액 희석에 대해 하나씩 분배하고, 45°C에서 튜브를 유지합니다. 혼합물을 3.4단계에서 45°C 상부 한천을 함유하는 배양 튜브로 옮니다. 빠르게 섞어서 미리 데운 LB/IPTG/X-gal 플레이트에 즉시 배양을 붓습니다. 부드럽게 기울이고 접시를 회전하여 상단 한천을 고르게 펴십시오.
- 5분 후, 37°C에서 밤새 플레이트를 반전 및 배양한다.
- 약 100 개의 플라크로 접시에 플라크를 세습니다. 10 μL당 PFU에서 파지 역가를 얻기 위해 해당 플레이트에 대한 희석 인자에 각 숫자를 곱합니다.
- 37°C에서 대장균 ER2738로 LB+ Tet 배지의 또 다른 5 mL을 밤새 파지 증폭을 위해 흔들어 서 접종합니다.
참고: 파지 역가의 경우 중간 로그 단계(OD600 0.5)에서 ER2738의 배양을 사용합니다. 대부분의 플라크가 X-gal/IPTG 플레이트에 흰색인 경우, 파지 풀이 야생 박테리오파지에 오염되었음을 의미합니다. 오염이 발생하면 오염되지 않은 파지 스톡 용액의 패닝 단계로 다시 시작해야 합니다.
4. 파지 증폭
- 희석(1:100)을 250 mL 에를렌마이어 플라스크에서 LB의 20 mL에서 3.8단계에서 하룻밤 배양한다. 증폭되지 않은 용루를 첨가하고 37°C에서 4.5시간 동안 격렬한 흔들림으로 배양한다.
- 배양을 원심분리기 관 및 원심분리기로 10분 동안 4°C에서 12,000 x g로 옮긴다. 상급을 신선한 튜브로 옮기고 원심 분리기를 다시 옮기고 펠릿을 버립니다.
- 상급의 상부 80%를 신선한 튜브로 옮기고 20% PEG/2.5 M NaCl의 1/6 부피를 추가합니다. 파지를 밤새 4°C에서 침전시키도록 합니다.
참고 : PEG / 2.5 M NaCl과 배양 장식품을 잘 섞습니다. - 침전된 파지를 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리한다. 상급, 원심 분리기를 다시 버리고 파이펫으로 잔류 상한을 제거하십시오.
- 1 mL의 결핵에서 펠릿을 다시 일시 중단하고 상급체를 마이크로 퍼지 튜브로 옮김. 4 °C에서 5 분 동안 12,000 x g의 원심 분리기.
- 상급체를 신선한 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 20% PEG/2.5 M NaCl의 1/6 부피를 추가하여 다시 침전시냅니다. 얼음에 15-60 분 동안 배양. 원심 분리기 에서 12,000 x g 에 대 한 10 분 4 °C에서. 상급을 버리고 다시 회전하고 파이펫으로 잔류 상한을 제거합니다.
- 불순물을 제거하기 위해 추가로 1 분 동안 TBS및 원심 분리기의 200 μL에 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 상급액을 신선한 마이크로퍼지 튜브로 이송하여 증폭된 용출액을 얻었다.
- 섹션 3에 기재된 바와 같이 증폭된 파지를 역가.
참고: 증폭된 용출물의 희석은 증폭되지 않은 용출액에 비해 더 높다; 108-1011의 연속 희석은 일반적으로 제안됩니다.
5. 바이오 패닝의 두 번째 라운드
- 섹션 2에서 4를 반복합니다.
- 섹션 3에 설명된 바와 같이 LB + IPTG/X-gal 플레이트상에서 증폭된 용출물의 2라운드를 적시한다.
참고: FGFR2 단백질의 코팅 농도를 5 μg/mL로 줄입니다. 4.7 단계에서 증폭된 파지를 입력으로 사용하고 역가를 1라운드(1011 PFU)와 동일하게 유지한다. 파지 및 FGFR2 코팅 접시의 인큐베이션 시간을 1 시간으로 단축하고 세척 단계에서 트웬 농도를 0.1 %(v / v)로 증가시다.
6. 바이오 패닝의 세 번째 라운드
- 2.1-2.6단계를 반복합니다.
- 접시에 20 μM bFGF 용액 (FGFR2용 리간드)의 1 mL을 추가하고 실온에서 60 분 동안 부드럽게 흔들어 결합 된 파지를 용출합니다.
- 3.1-3.7단계를 반복합니다.
참고: FGFR2 단백질의 코팅 농도를 2.5 μg/mL로 줄입니다. 섹션 5에서 증폭된 파지의 두 번째 라운드를 입력으로 사용하고 역가를 첫 번째 라운드(1011 PFU)와 동일하게 유지합니다. 파지 와 FGFR2 코팅 접시의 인큐베이션 시간을 30 분으로 단축하고 세척 단계에서 트웬 농도를 0.5 %(v / v)로 증가시다.
7. 시퀀싱을 위한 플라크 DNA 획득
- 플라크 증폭
- 희석(1:100)을 LB. 디스펜스 1 mL의 LB. 분배 배양액을 2 mL 튜브로 분배하고, 각 클론에 대해 하나씩 특징지어진다.
- 피펫 팁을 사용하여 섹션 6에서 역가 플레이트에서 잘 분리 된 파란색 플라크 하나를 선택하고 희석 된 배양을 포함하는 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 사용하십시오. 총 15개의 플라크를 선택합니다.
참고 : 플레이트는 4 °C에 보관하고 100 개의 플라크를 가지고 있어야합니다. - 37 °C에서 4.5 시간 동안 활발한 흔들림으로 튜브를 배양합니다.
- 30초 동안 12,000 x g에서 원심분리기와 원심분리기로 배양을 옮긴다.
- 파이펫을 사용하여 상층의 상부 80 %를 신선한 튜브로 옮김. 이를 증폭된 파지 스톡으로 표시합니다.
참고: 증폭된 파지를 100% 멸균 글리세롤과 동일한 부피로 희석하고 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하십시오.
- 플라크 DNA 추출
- 증폭된 파지의 500 μL을 신선한 마이크로퍼지튜브로 옮기고 20% PEG/2.5 M NaCl의 1/6 부피를 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10-20 분 동안 방치.
- 12,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 부은 다음 상류물을 부습니다.
참고: 파지 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다. - 다시 원심분리기. 남은 상급물질은 조심스럽게 제거하십시오.
- 튜브를 힘차게 탭하여 요오드화 완충제의 100 μL에서 펠릿을 철저히 재중단시다.
- 100% 에탄올 250 μL을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 12,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 제거하고 상위를 제거한다. 펠릿을 70% 에탄올 0.5 mL로 세척하고, 신속하게 원심분리기를 다시 제거하고, 상류를 제거하고, 펠릿을 짧게 건조시십시오.
- TE 버퍼의 30 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단하고 시퀀싱에 사용합니다.
참고: 7.2.6단계 전에 -20°C에서 70% 에탄올을 미리 식힙니다. 파지 펠릿은 에탄올을 첨가하기 전에 요오드화 완충액에서 철저히 재중단되어야 합니다.
8. 펩티드 서열의 식별
- 시퀀싱을 위해 -96 gIII 시퀀싱 프라이머(5 ́ CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG -3 ́ ́́)를 사용하십시오.
- DNA 염기서열 분석 결과에 기초하여 파지에 표시된 펩티드 서열을 분석한다.
- 작은 펩타이드를 합성하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량 분석법으로 분석하여 순도를 확인합니다(≥98%).
9. ITC에 의해 FGFR2의 얻어진 작은 펩티드 및 세포외 단백질의 친화도 검출
- 초음파 기기를 사용하여 멸균 수를 탈기하십시오. 작은 펩타이드와 FGFR2 세포외 단백질을 멸균수에 녹입니다. 이러한 샘플을 원심분리하여 잔류 침전물 제거.
- 25°C에서 ITC 적정 실험을 수행합니다. 주사기로부터 FGFR2 단백질의 1.5 μM을 가진 세포내의 작은 펩티드의 40 μM을 적정하고, 교반 속도는 750 rpm이다. FGFR2 단백질을 2 μL aliquots(총 19회 주사)에 5분 간격으로 추가합니다.
- 단일 사이트 바인딩 모델을 사용하여 ITC 데이터를 분석합니다.
참고: 멸균수는 탈기해야 하며, 모든 시료는 기포와 잔류 불순물을 제거하기 위해 원심분리되어야 합니다. 실험은 25°C의 일정한 온도에서 수행되어야 한다.
10. 세포 증식 분석서를 사용하여 수득된 작은 펩타이드의 생물학적 활성을 검증
- 종자 BALB/c 3T3 세포 (3.0 × 103 세포 / 잘, 100 μL)는 37 °C및 5 %CO2에서하룻밤 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 덜베코의 변형 독수리 배지 (DMEM)와 96 웰 플레이트.
- 상급체를 신선한 DMEM으로 0.5 % FBS로 교체하고 12 시간 동안 세포를 굶어.
- 0.5% FBS(6개의 중복 유정/농도)로 보충된 신선한 DMEM으로 작은 펩타이드(0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 및 100 μM)의 직렬 희석을 만듭니다. 96 웰 플레이트에서 상판을 제거하고 웰 당 작은 펩티드 용액의 100 μL을 추가합니다. 37 °C및 5%CO2에서48시간 동안 배양합니다.
- 상급물질을 10% 셀 카운팅 키트(CCK)-8 용액이 함유된 신선한 DMEM으로 교체하고 2시간 동안 배양합니다.
- 마이크로 플레이트 판독기를 통해 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하고 세포 생존 가능성을 분석합니다.
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Representative Results
FGFR2표적화하는 고친화성 소형 펩티드를 획득한다.
FGFR2를 대상으로 하는 파지를 스크리플하기 위해 이 연구에서 박사-7 라이브러리를 사용했습니다. 워크플로의 개략적 표현은 그림 1에나와 있습니다. 이 과정에서, 파지 입력(PFU)의 수는 변하지 않은 반면, FGFR2 단백질의 코팅 농도는 점차 감소하였다. 파지 역가의 결과는 회수된 파지의 수가 점차 증가하고, 3라운드 후, 1라운드와 비교하여 65배 증가하였다(표1).
다음으로, 3라운드 후 파지 클론을 무작위로 골라 시퀀싱을 위해 파지 DNA를 추출했습니다. 스크리닝에 의해 수득된 대표적인 펩티드(WRARVPL)를 SP1로 명명하였다. 이어서 합성되었고, 그 분자량은 질량 분석법으로 측정되었다.
SP1 펩티드는 FGFR2에 대한 높은 결합 친화도를 보였다.
FGFR2에 대한 작은 펩티드의 친화성을 측정하기 위해 ITC 실험을 수행하였다. 결과는 SP1 펩티드가 FGFR2에 대한 높은 친화력을 가지고 있음을 나타냈다 (Kd □ 1.4 μM; 그림 2). 이 날짜는 스크리닝 프로토콜의 효율성을 입증했다.
SP1 펩티드는 섬유아세포의 성장을 억제했다.
SP1 펩티드의 생물학적 활성을 조사하기 위해, 섬유아세포 증식 분석기를 CCK-8 키트를 사용하여 수행하였다. BALB/c 3T3 세포를 상이한 농도(0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, 및 100 μM)에서 SP1 펩티드로 배양하였다. 결과는 SP1 펩티드가 BALB/c 3T3 세포의 성장을 억제한다는 것을시사한다(도 3).
그림 1. 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 FGFR2를 표적화하는 소형 펩타이드를 위한 바이오패닝.
(a)파지 디스플레이 라이브러리를 이용한 작은 펩타이드 스크리닝의 개략적 표현. FGFR2로 코팅된 접시에 1011 PFU를 함유하는 라이브러리를 인큐베이션합니다. 세탁하여 언바운드 파지를 버리고 바운드 파지를 용해시다. 용출 된 파지를 증폭하고 바이오 패닝의 다음 라운드에 대한 입력으로 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. ITC에 의한 SP1 펩타이드와 FGFR2 사이의 상호작용의 친화성을 측정한다.
1.5 μM FGFR2 단백질을 SP1 펩티드의 40 μM으로 적정시켰다. ITC 데이터는 Origin 7.0 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 섬유 아세포의 성장에 SP1 펩티드의 효과.
BALB/c 3T3 세포를 상이한 농도(0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 및 100 μM)에서 SP1 펩티드로 처리하였다. 결과는 평균 ± SD로 표시됩니다.
| 라운드 | FGFR2 (μg) | 입력 파지(PFU) | 출력 파지(PFU) | 복구 (%) | 농축 |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3.98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4.05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1.3 x 10-3 | 65 |
표 1. 1라운드에 상대적인 FGFR2를 타겟팅하는 파지의 농축.
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Discussion
조합 파지 라이브러리는 표적 분자를 결합하고 그들의 기능을 조절할 수 있는 새로운 펩티드의 높은 처리량 스크리닝을 위한 강력하고 효과적인 공구입니다13. 현재 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 광범위한 응용 을 가지고 있다. 예를 들어, 수용체단백질(23)및 비단백질 표적24,25,질병 특이적 항원 모방13,세포 특이적 펩타이드26, 27,또는 조직/장기 특이적 펩타이드21,28,29 및펩티드 매개 약물 전달 시스템의 개발19,30. 간단히 말해서, 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리는 번역 의학의 기초 연구 및 개발에서 특정 펩티드를 식별하는 데 유용하고 효율적인 시스템입니다. 연구에서, 세포 성장 억제를 위한 FGFR2를 표적으로 하는 작은 펩티드를 스크리닝하기 위해 라이브러리를 사용했습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 아래에 설명되어 있습니다. 패닝 단계에서는 야생 형 파지의 오염을 피해야합니다. 언바운드 파지는 격렬한 세척으로 철저히 제거되어야 합니다. 파지 역가용 LB + IPTG/X-gal 플레이트는 37°C로 미리 데워야 합니다. 파지 역가의 경우, 대장균 ER2738은 중간 로그 단계(OD600 0.5)까지 성장해야 합니다. 단계 4.3에서, 파지는 4°C에서 하룻밤 동안 침전되어야 한다. 잘 분리 된 파란색 플라크는 DNA 염기서열 분석에 대한 100 개 미만의 플라크를 포함하는 고원에서 선택해야합니다. 단계 7.2.6에서, 70% 에탄올 용액은 사전에 20°C에서 냉각되어야 한다. 마지막으로, ITC 실험의 경우 멸균수를 탈기해야 하며, 모든 시료를 원심분리하여 기포와 잔류 불순물을 제거해야 합니다. 실험은 25°C의 일정한 온도에서 수행되어야 한다.
22를 얻은 안타의 품질에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인은 다음과 같습니다: 1) 제1 회 선별에서 파지 입력의 수는 1011 PFU여야 합니다. 그러나, 다음 스크리닝에서, 입력은 더 낮을 수 있다. 2) 야생형 파지 오염을 방지하기 위해 순수한 환경을 유지해야 합니다. 3) 3 또는 4 라운드의 심사는 일반적으로 충분합니다. 펩티드 라이브러리를 과도하게 패닝하지 마십시오. 4) 각 라운드에서, 대상 단백질의 양은 점차 감소하는 반면, 트웬의 함량은 세척 단계에서 점차적으로 증가한다. 또한 파지 및 FGFR2 코팅 접시의 배양 시간도 점차 단축됩니다. 용출 파지 플라크의 대부분이 X-gal/IPTG 플레이트에 흰색인 경우, 이것은 야생 형 파지에 의한 오염을 시사합니다. 패닝 과정에서 증폭 된 파지의 낮은 역가를 피하기 위해, 배양은 잘 통기하고 그들의 성장 단계 (OD600 < 0.05)에서 초기에 감염되어야합니다.
본 연구에서, SP1 펩타이드는 FGFR2에 대한 높은 친화력을 보였다(Kd □ 1.4 μM; 그림 2) 좋은 생물학적 활성(그림 3). 따라서, 우리의 결과는 프로토콜이 FGFR2 단백질의 세포외 도메인에 대하여 펩티드를 선택하는 데 효과적이었다는 것을 시사합니다, 비록 FGFR 가족 구성원의 높은 서열 유사성 때문에, SP1 펩티드는 FGFR와 약간의 결합 친화도를 가질 수 있다는 것을 주의하십시오 FGFR2 외에 가족 구성원, 이는 본 생물학적 활동에 대한 책임이있을 수 있습니다. 또한 패닝 과정에서 파지 ELISA는 양성 파지를 질적으로 식별하는 대안입니다. 그러나, 우리의 실험실에서는, 우리는 항상 ITC 분석에 의해 그들의 선호도를 정량적으로 염기서열화하고 평가해서 펩티드를 얻고 후보 펩티드를 평가하고 선택하는 데 문제가 없었습니다.
파지 디스플레이 라이브러리에는 몇 가지 장점이있습니다 22. 라이브러리는 고용량(최대 1011 PFU)이며 시험관내, 생체내, 및 생체내에서 사용될 수있다. 라이브러리는 매우 효율적이고 다루기 쉽고 저렴하며 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나 이 기술에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 라이브러리는 단백질 성 아미노산을 포함하고 복잡한 구조없이 선형 및 간단한 순환 펩티드에 만 의무가있다.
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Disclosures
저자는 재정적 이익의 충돌을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 광저우의 과학 기술 프로그램 (No. 2016201604030039)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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