Summary
Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a seleção de peptídeos pequenos que se ligam a FGFR2 usando uma biblioteca de peptídeo de exibição de fago. Nós analisamos mais a afinidade dos peptídeos selecionados em direção a FGFR2 in vitro e sua capacidade de suprimir a proliferação celular.
Abstract
A família humana do receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR) compreende quatro membros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3, e FGFR4, que são involvidos em várias atividades biológicas que incluem a proliferação, a sobrevivência, a migração e a diferenciação da pilha. Várias aberrações na via de sinalização FGFR, devido a mutações ou eventos de amplificação genética, foram identificadas em vários tipos de cânceres. Assim, pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de estratégias envolvendo direcionamento terapêutico de FGFRs. os inibidores atuais de FGFR em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico incluem inibidores da molécula pequena de tirosina cinases ou anticorpos monoclonais, com apenas alguns inibidores à base de peptídeos no gasoduto. Aqui, fornecemos um protocolo usando a tecnologia de exibição de fago para triagem de pequenos peptídeos como antagonistas de FGFR2. Resumidamente, uma biblioteca de peptídeos exibidos com fago foi incubada em uma placa revestida com FGFR2. Subseqüentemente, o fago não acoplado foi lavado fora por TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), e o fago encadernado foi eluída com tampão de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2). O fago eluída foi amplificado mais e usado como a entrada para a próxima rodada de biopanning. Depois de três círculos de biopanning, as seqüências do peptide de clones individuais do fago foram identificadas pelo sequenciamento do ADN. Finalmente, os peptídeos selecionados foram sintetizados e analisados quanto à afinidade e atividade biológica.
Introduction
Os receptores do fator de crescimento de fibroblastos (FGFRs) desempenham papéis-chave na proliferação celular, cicatrização de feridas e angiogênese in vivo1. A ativação aberrante da sinalização de FGFR observada em uma variedade de tumores2,3,4,5 inclui amplificação genética, mutações genéticas, aberrações cromossômicas e secreção excessiva de ligante6 . Muitos inibidores que visam o FGFRs mostraram efeitos terapêuticos promissores em ensaios clínicos e são principalmente classificados em três tipos: (1) inibidores da pequena molécula quinase, que se ligam ao domínio intracelular de FGFR, (2) antagonistas que visam a segmento extracelular e (3) armadilhas de ligantes FGF6. Embora diversos dos inibidores pequenos da quinase da molécula tenham bons efeitos terapêuticos in vitro e in vivo7, a maioria deles têm a especificidade pobre do alvo e mostram efeitos adversos tais como a hipertensão8. A maioria dos antagonistas são anticorpos monoclonais9,10 e polipeptídeos11. Peptídeos têm vantagens sobre pequenas moléculas devido à sua especificidade e efeitos colaterais inferiores. Eles também mantêm a permeabilidade celular e não se acumulam em órgãos específicos, em comparação com as drogas proteicas12. Assim, os pequenos peptídeos direcionados são agentes terapêuticos efetivos e prospectivos.
A tecnologia de display phage é uma ferramenta fácil, mas poderosa,para identificar pequenos peptídeos que podem se vincular a uma determinada molécula13,14,15. Nós usamos uma biblioteca do peptide da exposição do fago que seja baseada em um fago simples de M13 com sobre 109 seqüências diferentes do peptide indicadas na cauda para ligar à molécula do alvo (veja a tabela dos materiais)16. Devido à afinidade elevada dos fagos para a molécula dada, os fagos desligados podem ser lavados afastado, e somente os fagos firmemente limitados com os peptídeos curtos desejados são retidos. As metas moleculares dadas podem ser imobilizadas proteínas17,18, carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos19,20. Um caso emocionante foi relatado onde os peptídeos órgão-específicos foram selecionados in vivo usando a tecnologia da exposição do fago21. As vantagens da tecnologia da exposição do fago incluem a taxa de transferência elevada, a facilidade de operação, o baixo custo e uma escala larga das aplicações22.
Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado de triagem de peptídeos pequenos que ligam a proteína imobilizada (FGFR2) usando uma biblioteca de exibição de fago. A eficácia da tecnologia é examinada igualmente medindo a afinidade do peptide obtido para FGFR2 pela calorimetria de titulação isothermal (ITC), e pela atividade biológica por um ensaio da proliferação de pilha. O método pode ser estendido para a triagem de pequenos peptídeos que se ligam a carboidratos, células cultivadas, ou até mesmo materiais inorgânicos.
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Protocol
1. preparação do reagente
- LB (caldo lysogeny) médio: dissolver 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, e 0,5 g de NaCl em 100 mL de H2O. autoclave e armazenar a 4 ° c.
- Estoque de tetraciclina: Prepare 20 mg/mL em 1:1 etanol: H2O. Armazene em-20 ° c, e Vortex antes de usar.
- Solução de IPTG/X-GAL: misture 0,5 g de IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalactopyranoside) e 0,4 g de X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) em 10 mL de DMF (dimetil formamida). A solução pode ser armazenada a-20 ° c durante um ano no escuro.
- LB + tetraciclina (Tet) placas: Dissove 1 g de Bacto-triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl, e 1,5 g de agar em 100 mL de H2O. autoclave e arrefecer a ≪ 70 ° c. Adicionar 100 μL do estoque de tetraciclina e despeje as placas. Armazene as placas a 4 ° c no escuro.
- LB + IPTG/X-GAL placas: dissolver 1 g de Bacto-triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl, e 1,5 g de agar em 100 mL de H2O. autoclave e arrefecer a ≪ 70 ° c. Adicione 100 μL da solução de IPTG/X-GAL e despeje as placas. Armazene as placas a 4 ° c no escuro.
- Tampão glicina-HCI (0,2 M): dissolver 1,5014 g de glicina e 100 mg de BSA (albumina sérica bovina) em 100 mL de H2o e ajustar o pH para 2,2 com HCl. filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.
- Tampão Tris-HCl (1 M): dissolver 12,11 g de tris (Tris (hidroximetil) aminometano) em 100 mL de H2o e ajustar o pH para 9,1 com HCl. autoclave e armazenar a 4 ° c.
- Tampão de revestimento (0,1 M): dissolva 1,68 g de NaHCO3 em 200 ml de H2o e ajuste o pH a 8,6 com NaOH. Filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.
- Tampão de bloqueio: Prepare 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) com 5 mg/ml de BSA. Filtre a solução utilizando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° c.
- TBS: Prepare 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) com 150 mM NaCl. Autoclave e loja à temperatura ambiente.
- 0, 5%, 0,1%, ou 0,5% TBST: Prepare TBS com 0, 5%, 0,1%, ou 0,5% (v/v) Tween-20. Filtre usando um filtro de 0,22 μm e armazene à temperatura ambiente.
- PEG/NaCl: Prepare 20% (w/v) polietileno glicol – 8000 com 2,5 M NaCl. Autoclave e loja à temperatura ambiente.
- Solução TE: misture 1 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8.0) e 2 mL de EDTA 50 mM (pH 8,0) e ajuste o volume para 100 mL com H2O. autoclave e loja à temperatura ambiente.
- Tampão de iodeto: dissolva 30 g de NaI em 50 mL de TE, pH 8,0. Guarde a solução à temperatura ambiente no escuro.
- Ágar superior: dissolver 1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de NaCl e 0,7 g de agarina em 100 mL de H2O. autoclave e dispensar 15 ml de alíquotas. Armazene à temperatura ambiente para o uso.
2. primeira rodada de biopanning: triagem clones de fago que se ligam ao domínio extracelular de FGFR2
Nota: Use pontas de pipeta resistentes ao aerossol e luvas de desgaste para todos os protocolos, a fim de minimizar a contaminação com bacteriófagos ambientais.
- Prepare uma solução de 10 μg/mL FGFR2 (pureza > 97%; ver tabela de materiais) em tampão de revestimento. Adicione 1 mL da solução preparada a um prato de 35 cm2 e gire-o repetidamente até que a superfície esteja completamente molhada. Incubar durante a noite a 4 ° c com agitação.
Nota: para evitar a seleção de ligantes alvo de chamariz, a proteína alvo deve ser altamente purificada. - Inocular 5 mL de LB + Tet médio com Escherichia coli (E. coli) ER2738 por 5 – 10 horas a 37 ° c com agitação. As células ER2738 amplificadas serão usadas para titulação na etapa 3,3.
- Despeje a solução de revestimento do prato (a solução em excesso deve ser removida) e adicione a solução de bloqueio. Incubar a 4 ° c durante pelo menos 1 h.
- Elimine a solução de bloqueio e lave 6 vezes rapidamente com TBST (TBS + 0, 5% (v/v] Tween-20). Evite secar o prato.
- Reconstituir a biblioteca de fago original em 1 mL de TBST [concentração final de 1011 unidades formadoras de placas (Pfu)], adicione ao prato revestido, e balanç delicadamente para 2 h em um abanador na temperatura ambiente.
- Descarte o sobrenadante e lave o prato 10x com TBST (TBS + 0, 5% (v/v) Tween-20), conforme realizado na etapa 2,4.
Nota: os fagos não acoplados devem ser removidos completamente pela lavagem vigorosa. - Elute o fago acoplado adicionando 1 mL do amortecedor de 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,2) ao prato e balanç delicadamente por 10 minutos na temperatura ambiente.
- Transfira o eluato para um tubo de microcentrífuga esterilizado e neutralizar-o com 100 μl de 1 M de Tris-HCl, pH 9,1.
Nota: na etapa 2,6, remova o fago não acoplado tanto quanto possível lavando o prato 10x vigorosamente. Este é um passo crucial. O fago eluída pode ser armazenado em 4 ° c por uma semana. No entanto, é melhor ir para a frente para a próxima etapa, logo que possível.
3. determinação do título dos fagos eluída
- Placas de LB + IPTG/X-GAL pré-quentes para, pelo menos, 1 h a 37 ° c antes da utilização.
- Prepare 100 μL de diluições seriadas de 10 vezes (ou seja, 101, 102, 103 e 104) do eluato da etapa 2,8 em lb. Use pontas com cartuchos de filtro para evitar a contaminação.
- Deixe a cultura da etapa 2,2 atingir a fase mid-log (OD600 ≈ 0,5). Dispensar 200 μl da cultura em tubos de microcentrífuga esterilizados, um para cada diluição de eluato.
- Para iniciar a infeção, adicione 10 μL de cada diluição do passo 3,2 a tubos de microcentrífuga individuais que contenham a cultura E. coli ER2738 a partir do passo 3,3. Vortex rapidamente e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
- Cubra 90 μL da mistura da etapa 3,4 nas placas LB + IPTG/X-GAL com varas de revestimento.
- Opcionalmente, derreter o agar superior em um microondas, dispensar 3 mL em tubos de cultura estéreis, um para cada diluição eluída, e manter os tubos a 45 ° c. Transfira a mistura do passo 3,4 para os tubos de cultura contendo o agar superior de 45 ° c. Misture rapidamente e derrame imediatamente a cultura em uma placa pre-warmed de LB/IPTG/X-GAL. Incline suavemente e gire a placa para espalhar o ágar superior uniformemente.
- Após 5 min, inverta e incubar placas durante a noite a 37 ° c.
- Conte chapas em placas com aproximadamente 100 placas. Multiplique cada número pelo fator de diluição para que a placa obtenha o Titer do fago em PFU por 10 μL.
- Inocular outro 5 mL de LB + Tet médio com E. coli ER2738 a 37 ° c durante a noite com agitação para a amplificação de fago.
Nota: Use a cultura de ER2738 na fase do mid-log (OD600 ≈ 0,5) para o Titer do fago. Se a maioria das chapas são brancas nas placas X-GAL/IPTG, isso significa que o pool de fago foi contaminado com bacteriófagos selvagens. Se a contaminação ocorre, é necessário começar outra vez com os passos de panning da solução de estoque não contaminada do fago.
4. amplificação de Phage
- Diluir (1:100) a cultura durante a noite a partir do passo 3,8 em 20 mL de LB num balão de 250 mL de Erlenmeyer. Adicione o eluato não amplificado e incubar com agitação vigorosa para 4,5 h em 37 ° c.
- Transfira a cultura para um tubo de centrifugação e Centrifugue durante 10 min a 12.000 x g a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco, centrifugue novamente e descarte o pellet.
- Transfira o 80% superior do sobrenadante a um tubo fresco e adicione-lhe 1/6 volume de 20% PEG/2.5 M NaCl. Permitir que o fago para precipitar a 4 ° c durante a noite.
Nota: Misture o sobrenadante de cultura com PEG/2.5 M NaCl bem. - Centrifugue o fago precipitado em 12.000 x g por 15 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante, centrifugue novamente e retire o sobrenadante residual com uma pipeta.
- Ressuscitar o pellet em 1 ml de TBS e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga. Centrifugador a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e precipitar novamente adicionando 1/6 volume de 20% Peg/2.5 M NaCl. Incubar no gelo por 15 – 60 min. centrifugador a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante, re-spin, e retire o sobrenadante residual com uma pipeta.
- Ressuscitar o pellet em 200 μL de TBS e centrifugar por um minuto adicional para remover as impurezas. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco para obter o eluato amplificado.
- Titer o fago amplificado como descrito na seção 3.
Nota: a diluição do eluato amplificado é maior em comparação com o eluato não amplificado; diluições seriais de 108– 1011 são tipicamente sugeridas.
5. segunda rodada de contra
- Repita as secções 2 a 4.
- Titer a segunda rodada do eluato amplificado nas placas LB + IPTG/X-GAL, conforme descrito na seção 3.
Nota: Reduza a concentração de revestimento da proteína FGFR2 para 5 μg/mL. Use o fago amplificado da etapa 4,7 como a entrada e mantenha o Titer mesmos que na primeira rodada (1011 Pfu). Encurtar o tempo de incubação de fago e FGFR2-revestido prato para 1 h e aumentar a concentração de Tween para 0,1% (v/v) nas etapas de lavagem.
6. terceira rodada de contra
- Repita os passos 2.1-2.6.
- Elute o fago encadernado adicionando 1 ml da solução de 20 μm bFGF (um ligante para FGFR2) ao prato e balanç delicadamente para 60 minutos na temperatura ambiente.
- Repita os passos 3.1-3.7.
Nota: Reduza a concentração de revestimento da proteína FGFR2 para 2,5 μg/mL. Use a segunda rodada de fago amplificado da seção 5 como a entrada e manter o Titer mesmo como na primeira rodada (1011 Pfu). Encurtar o tempo de incubação de fago e FGFR2-revestido prato para 30 min e aumentar a concentração de Tween para 0,5% (v/v) nas etapas de lavagem.
7. aquisição de DNA de chapa para sequenciamento
- Amplificação da placa
- Diluir (1:100) uma cultura overnight de ER2738 em LB. Dispense 1 mL de cultura diluída em um tubo de 2 mL, um para cada clone a ser caracterizado.
- Use uma ponta da pipeta para escolher uma placa colorida azul bem separada de uma placa do Titer da seção 6 e transfira-a ao tubo que contem a cultura diluída. Escolha um total de 15 placas.
Nota: as placas devem ser < 1 – 3 dias de idade, armazenadas a 4 ° c, e têm < placas 100. - Incubar os tubos com agitação vigorosa para 4,5 h em 37 ° c.
- Transfira as culturas para tubos de centrifugação e Centrifugue a 12.000 x g durante 30 s. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e centrifugue novamente.
- Usando uma pipeta, transfira o superior 80% do sobrenadante a um tubo fresco. Rotule isso como o estoque de fago amplificado.
Nota: diluir a fago amplificada com um volume igual de 100% de glicerol estéril e armazenar a-80 ° c para uso posterior.
- Extração de DNA de chapa
- Transfira 500 μl do fago amplificado a um tubo de microcentrífuga fresco e adicione um volume 1/6 de NaCl de 20% Peg/2.5 M. Inverta para misturar e deixá-lo ficar por 10 – 20 min à temperatura ambiente.
- Centrifugue a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c e, em seguida, despeje o sobrenadante.
Nota: a pelota de fago pode não estar visível. - Centrifugue novamente. Remova cuidadosamente qualquer sobrenadante restante.
- Ressuspender completamente o pellet em 100 μL do tampão de iodeto, tocando vigorosamente o tubo.
- Adicionar 250 μL de 100% de etanol e incubar por 15 min à temperatura ambiente.
- Centrifugue a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° c e retire o sobrenadante. Lave a pelota com 0,5 mL de etanol 70%, centrifugue rapidamente novamente, retire o sobrenadante e seque brevemente o pellet.
- Ressuspender o pellet em 30 μL de tampão TE e utilizá-lo para sequenciamento.
Nota: pré-Resfrie o etanol a 70% a-20 ° c antes da etapa 7.2.6. A pelota do fago deve completamente ser ressuscipended no amortecedor do iodeto antes da adição do ethanol.
8. identificação da sequência peptídica
- Use o primer de sequenciamento-96 gIII (5 ́-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG – 3 ́) para sequenciamento.
- Analise as sequências peptídicas exibidas na fago com base nos resultados de sequenciamento de DNA.
- Sintetizar pequenos peptídeos e analisar por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massas para confirmar sua pureza (≥ 98%).
9. detectando a afinidade do peptídeo pequeno obtido e da proteína extracelular de FGFR2 por ITC
- Água estéril de Degas usando um instrumento ultra-sônico. Dissolva o pequeno peptídeo e a proteína FGFR2 extracelular em água estéril. Centrifugue estas amostras para remover o precipitado residual.
- Realize os experimentos de titulação ITC a 25 ° c. Titrate 40 μM de peptídeo pequeno na célula com 1,5 μM de proteína FGFR2 da seringa, com uma velocidade de agitação de 750 rpm. Adicione a proteína FGFR2 em 2 μL de alíquotas (para um total de 19 injeções) em intervalos de 5 min.
- Analise os dados ITC usando um modelo de ligação de site único.
Nota: a água estéril deve ser desgaseificada, e todas as amostras devem ser centrifugadas para remover bolhas de ar e impurezas residuais. O experimento deve ser conduzido a uma temperatura constante de 25 ° c.
10. verificar a atividade biológica do pequeno peptídeo obtido utilizando um ensaio de proliferação celular
- Células de semente BALB/c 3T3 (3,0 × 103 células/poço, 100 μL) em uma placa de 96 poços com o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS) durante a noite a 37 ° c e 5% co2.
- Substitua o sobrenadante com DMEM fresco com 0,5% FBS e morra de fome as pilhas por 12 h.
- Faça diluições seriais do pequeno peptídeo (0, 0, 64, 0, 32, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 μM) com DMEM fresco suplementado com 0,5% FBS (6 poços duplicados/concentração). Retire o sobrenadante da placa 96-well e adicione 100 μL da solução pequena do peptide por bem. Incubar para 48 h a 37 ° c e 5% CO2.
- Substitua o sobrenadante por DMEM fresco contendo 10% kit de contagem de células (CCK)-8 solução e incubar por 2 h.
- Meça a absorvência de cada poço em 450 nanômetro com um leitor do microplate e analise a viabilidade da pilha.
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Representative Results
Obtendo um pequeno peptídeo de alta afinidade visando FGFR2.
Para a tela de fagos visando FGFR2, uma biblioteca de pH.D.-7 foi usada neste estudo. Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é mostrada na Figura 1. Neste processo, o número de entrada do fago (PFU) foi mantido inalterado, visto que a concentração de revestimento da proteína FGFR2 foi reduzida gradualmente. Os resultados do Titer do fago sugeriram que o número de fagos recuperados aumentou gradualmente, e após 3 círculos, havia um aumento 65-fold em comparação àquele da primeira rodada (tabela 1).
Em seguida, escolhemos clones de fago aleatoriamente após a terceira rodada e extraímos o DNA de fago para sequenciamento. Um peptídeo representativo (WRARVPL) obtido por triagem foi denominado SP1. Posteriormente, foi sintetizada, e seu peso molecular foi medido por espectrometria de massas.
O peptídeo SP1 mostrou alta afinidade de ligação para FGFR2.
Um experimento de ITC foi conduzido para medir a afinidade do pequeno peptídeo para FGFR2. O resultado indicou que o peptídeo SP1 tem alta afinidade para FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figura 2). Esta data demonstrou a eficiência do protocolo de triagem.
O peptídeo SP1 inibiu o crescimento de fibroblastos.
Para investigar a atividade biológica do peptídeo SP1, foi realizado um ensaio de proliferação de fibroblastos utilizando-se um kit CCK-8. As células BALB/c 3T3 foram incubadas com o peptídeo SP1 em diferentes concentrações (0, 0, 64, 0, 32, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 μM). O resultado sugeriu que o peptídeo SP1 suprimiu o crescimento das células BALB/c 3T3 (Figura 3).
Figura 1. Biopanning para o peptide pequeno que alvejam FGFR2 usando a biblioteca da exposição do fago.
(A) respresentação esquemática da seleção pequena do peptide usando a biblioteca da exposição do fago. Incubar a biblioteca contendo 1011 Pfu em um prato revestido com FGFR2. Descarte os fagos não acoplados lavando, e o eluir amarrou os fagos. Amplificar os fagos eluídos e usá-los como entrada para a próxima rodada de biopanning. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Medindo a afinidade da interação entre o peptídeo SP1 e FGFR2 por ITC.
a proteína 1,5 μM FGFR2 foi titulada com 40 μM do peptídeo SP1. Os dados do ITC foram analisados com o software Origin 7,0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Efeito do peptídeo SP1 no crescimento de fibroblastos.
As células BALB/c 3T3 foram tratadas com o peptídeo SP1 em diferentes concentrações (0, 0, 64, 0, 32, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 μM). Os resultados são expressos em média ± DP. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Rodada | FGFR2 (μg) | Fago da entrada (Pfu) | Fago da saída (Pfu) | Recuperação (%) | Enriquecimento |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4, 5 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2,5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabela 1. Enriquecimento de fago visando FGFR2 em relação ao round 1.
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Discussion
Uma biblioteca de fago combinatória é uma ferramenta poderosa e eficaz para a seleção da elevado-produção de peptídeos novos que podem ligar moléculas do alvo e regular sua função13. Atualmente, as bibliotecas do peptide do indicador do fago têm uma escala larga das aplicações. Por exemplo, eles podem ser usados para selecionar peptídeos bioativos vinculados a proteínas do receptor23, alvos não proteicos24,25, antigénio específico da doença imita13, peptídeos específicos de células26, 27, ou peptídeos específicos de tecido/órgão 21,28,29 e desenvolvimento de sistemas de entrega de medicamentos mediados por peptídeos19,30. Em resumo, as bibliotecas de peptídeos de exibição de fago são sistemas úteis e eficientes para identificar peptídeos específicos na pesquisa básica e desenvolvimento da medicina translacional. No estudo, utilizou-se uma biblioteca para triagem de pequenos peptídeos visando FGFR2 para inibição do crescimento celular.
As etapas críticas do protocolo são mencionadas abaixo. Na etapa de panning, a contaminação por fagos do selvagem-tipo deve ser evitada. Os fagos não acoplados devem ser removidos completamente pela lavagem vigorosa. As placas LB + IPTG/X-GAL para o título de fago devem ser pré-aqueceu para 37 ° c. Para o título de fago, E. coli ER2738 deve ser cultivada até a fase mid-log (OD600 ≈ 0,5). Na etapa 4,3, o fago deve ser precipitado durante a noite em 4 ° c. As placas azuis bem separadas devem ser escolhidas do Platea que contem menos de 100 placas para arranjar em seqüência do ADN. Na etapa 7.2.6, a solução de etanol a 70% deve ser pré-arrefecida a 20 ° c com antecedência. Por último, para o experimento ITC, a água estéril deve ser desgaseificada, e todas as amostras devem ser centrifugadas para remover bolhas de ar e impurezas residuais. O experimento deve ser conduzido a uma temperatura constante de 25 ° c.
Alguns fatores que podem afetar a qualidade dos acertos obtidos22 são os seguintes: 1) na primeira rodada de triagem, o número de entradas de fago precisa ser 1011 Pfu. No entanto, na próxima rodada de triagem, a entrada pode ser menor. 2) um ambiente puro deve ser mantido para evitar a contaminação selvagem-tipo do fago. 3) 3 ou 4 rodadas de triagem são geralmente suficientes. Evite over-panning a biblioteca de peptídeos. 4) em cada rodada, a quantidade de proteína alvo é gradualmente reduzida, enquanto que o conteúdo de Tween é gradualmente aumentado na etapa de lavagem. Além, o tempo da incubação do fago e do prato FGFR2-coated é encurtado igualmente gradualmente. Se a maioria das placas de fago eluída são brancas nas chapas X-GAL/IPTG, isso sugere contaminação por phages de tipo selvagem. A fim de evitar um baixo título de fago amplificado no processo de panning, as culturas devem ser bem ventiladas e infectadas precocemente em sua fase de crescimento (OD600 < 0, 5).
Neste estudo, o peptídeo SP1 apresentou alta afinidade para FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figura 2) e boa atividade biológica (Figura 3). Assim, nossos resultados sugerem que o protocolo foi efetivo na seleção de peptídeos contra o domínio extracelular da proteína FGFR2, embora note que, devido à alta similaridade de seqüência dos membros da família FGFR, o peptídeo SP1 pode ter alguma afinidade vinculativa com o FGFR Membros da família além FGFR2, que poderiam ser responsáveis para a atividade biológica considerada. Além disso, no processo de panning, o fago ELISA é uma alternativa para identificar os fagos positivos qualitativamente. No entanto, em nosso laboratório, sempre obtemos os peptídeos por sequenciamento e avaliando sua afinidade pelo ensaio de ITC quantitativamente e não tivemos problemas para avaliar e selecionar os peptídeos candidatos.
A biblioteca Phage-display tem várias vantagens22. As bibliotecas são de alta capacidade (até 1011 Pfu) e podem ser usadas in vitro, in vivo e ex vivo. As bibliotecas são altamente eficientes, fáceis de manusear, baratas e comercialmente disponíveis. No entanto, existem certas limitações da tecnologia. As bibliotecas contêm apenas aminoácidos proteinogênicos e só são amactivadas a peptídeos cíclicos lineares e simples, sem estruturas complicadas.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo programa de ciência e tecnologia de Guangzhou (n º 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
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