Hier stellen wir ein Protokoll zur Trennung und Sortierung einer bestimmten Zellpopulation von den Drosophila männlichen Zubehördrüsen (Sekundärzellen) für RNA-Sequenzierung und RT-qPCR vor. Die Zellisolation erfolgt durch FACS-Reinigung von GFP-exezierenden Sekundärzellen nach einem mehrstufigen Dissoziationsprozess, der Dissektion, Proteasenverdauung und mechanische Dispersion erfordert.
Um die Funktion eines Organs zu verstehen, ist es oft nützlich, die Rolle seiner konstituierenden Zellpopulationen zu verstehen. Leider macht es die Seltenheit einzelner Zellpopulationen oft schwierig, genügend Material für molekulare Studien zu erhalten. Zum Beispiel enthält die Zubehördrüse des männlichen Fortpflanzungssystems Drosophila zwei verschiedene sekretore Zelltypen. Die Hauptzellen machen 96% der Sekretoniezellen der Drüse aus, während die Sekundärzellen (SC) die restlichen 4% der Zellen ausmachen (etwa 80 Zellen pro Männchen). Obwohl beide Zelltypen wichtige Bestandteile der Samenflüssigkeit produzieren, sind nur wenige Gene bekannt, die spezifisch für die SCs sind. Die Seltenheit von SCs hat bisher die transkriptomische Analyse dieses wichtigen Zelltyps behindert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Reinigung von SCs zur RNA-Extraktion und -Sequenzierung ermöglicht. Das Protokoll besteht darin, zunächst Drüsen von Fliegen zu sezieren, die einen SC-spezifischen GFP-Reporter exezieren, und diese Drüsen dann der Proteaseverdauung und mechanischen Dissoziation zu unterziehen, um einzelne Zellen zu erhalten. Nach diesen Schritten werden einzelne, lebende, GFP-markierte Zellen mit einem fluoreszierenden aktivierten Zellsortierer (FACS) zur RNA-Reinigung sortiert. Dieses Verfahren ergibt SC-spezifische RNAs von 40 Mal pro Zustand für nachgeschaltete RT-qPCR und/oder RNA-Sequenzierung im Laufe eines Tages. Die Schnelligkeit und Einfachheit des Verfahrens ermöglicht es, die Transkriptome vieler verschiedener Fliegen, aus verschiedenen Genotypen oder Umgebungsbedingungen, in kurzer Zeit zu bestimmen.
Organe bestehen aus mehreren Zelltypen, die jeweils diskrete Funktionen haben und manchmal sehr unterschiedliche Gensätze ausdrücken. Um ein genaues Verständnis der Funktionsweise eines Organs zu erhalten, ist es oft wichtig, jeden einzelnen Zelltyp zu untersuchen, aus dem dieses Organ besteht. Eine der primären Methoden, die verwendet wird, um mögliche Funktionen zu untersuchen, ist die Transkriptomanalyse. Diese leistungsstarke Methode liefert eine Momentaufnahme der Genexpression in einer Zelle, um aktive Prozesse und Pfade aufzudecken. Diese Art der Analyse ist jedoch oft schwierig für seltene Zellpopulationen, die von weit reichlich erwachsener benachbarten Zellen gereinigt werden müssen. Zum Beispiel ist die Drosophila männliche Zubehördrüse ein Organ, das hauptsächlich aus zwei sekretochen Zelltypen besteht. Da der seltenere der beiden Zelltypen nur 4 % der Zellen dieser Drüse umfasst, wurde die Verwendung einer zelltypspezifischen Transkriptomanalyse nicht verwendet, um die Funktion dieser Zellen zu bestimmen.
Zubehördrüsen (AGs) sind Organe des männlichen Fortpflanzungstraktes bei Insekten. Sie sind verantwortlich für die Produktion der meisten Proteine der Samenflüssigkeit (Seminal fluid proteins (SFPs) und Accessory Drüsenproteine (ACPs)). Einige dieser SFPs sind dafür bekannt, die physiologischen und Verhaltensreaktionen bei gepaarten Weibchen zu induzieren, die gemeinhin als Post-Mating-Antwort (PMR) bezeichnet werden. Einige der PMRs sind: eine erhöhte Eisprung- und Eiablagerate, die Lagerung und Freisetzung von Spermien, eine Änderung der weiblichen Ernährung und eine Abnahme der weiblichen Empfänglichkeit gegenüber sekundären höflichen Männern1,2. Da Insekten viele wichtige gesellschaftliche Probleme beeinflussen, von der menschlichen Gesundheit (als Vektoren für tödliche Krankheiten) bis hin zur Landwirtschaft (Insekten können Schädlinge sein, aber für bestäubungsmittel und bodenqualität entscheidend sind), ist das Verständnis der Insektenvermehrung ein wichtiger Forschungsbereich. Die Untersuchung von AGs und ACPs wurde mit dem Modellorganismus Drosophila melanogaster signifikant weiterentwickelt. Diese Studien haben die Rolle von AGs und einigen der einzelnen Proteine, die sie bei der Schaffung der PMR produzieren, hervorgehoben, was die Arbeit bei anderen Arten wie dem Krankheitsvektor Aedes aegypti3,4und anderen Insekten beeinflusst1 ,5. Darüber hinaus werden aGs, wie AGs die Bestandteile der Samenflüssigkeit1,6 absondern, oft als funktionelles Analogon der Säugetierprostata und der Samenbläschen betrachtet. Diese Funktionsähnlichkeit kombiniert mit molekularen Ähnlichkeiten zwischen den beiden Gewebetypen haben die AGs zu einem Modell für die Prostata in Fliegen7gemacht.
Innerhalb der Drosophila Männchen, gibt es zwei Lappen von Zubehör Drüsen. Jeder Lappen kann als eine sackartige Struktur gesehen werden, die aus einer Monoschicht von Sekretorienzellen besteht, die ein zentrales Lumen umgeben, und von glatten Muskeln umwickelt wird. Wie oben erwähnt, gibt es zwei morphologisch, entwicklungs- und funktionell unterschiedliche sekretorische Zelltypen, aus denen diese Drüse besteht: die polygonalen Hauptzellen (die 96 % der Zellen ausmachen) und die größeren, runden Sekundärzellen (SC) (die die verbleibenden 4% der Zellen oder etwa 40 Zellen pro Lappen). Es wurde gezeigt, dass beide Zelltypen unterschiedliche Sätze von ACPs produzieren, um die PMR zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Die meisten der bisher gewonnenen Daten unterstreichen die Rolle eines einzelnen Proteins bei der Auslösung der meisten charakteristischen Verhaltensweisen der PMR. Dieses Protein, das Sexpeptid, ist ein kleines, 36 Aminosäurepeptid, das von den Hauptzellen8,9,10abgesondert wird. Obwohl das Sexpeptid eine wichtige Rolle in der PMR zu spielen scheint, haben andere ACPs, die sowohl von der Haupt- als auch der Sekundärzelle produziert werden, auch verschiedene Aspekte der PMR11,12,13,14 beeinflusst ,15,16,17. Zum Beispiel scheinen die SCs, basierend auf unserem aktuellen Wissen, über die Proteine, die sie produzieren, für die Fortdauer der SP-Signalisierung nach dem ersten Tag18erforderlich zu sein.
Angesichts der Seltenheit der SCs (nur 80 Zellen pro Männchen) stammt unser gesamtes Wissen über diese Zellen und die Proteine, die sie produzieren, aus Genetik und Kandidatenansätzen. Bisher hat sich gezeigt, dass nur eine relativ kleine Liste von Genen SC-spezifisch ist. Diese Liste enthält das Homeodomain-Protein Defective proventriculus (Dve)19, die lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 und 1921, CG1656 und CG1757511, 15,21 und der Homeobox-Transkriptionsfaktor Abdominal-B (Abd-B)18. Zuvor haben wir gezeigt, dass ein mutierter Mangel sowohl für die Expression von Abd-B als auch für die lncRNA MSA in Sekundärzellen(iab-6cocuD1 Mutant) die Länge der PMR von 10 Tagen auf nur einen Tag12 verkürzt. , 18 , 20. Dieser Phänotyp scheint durch die unsachgemäße Lagerung von SP im weiblichen Fortpflanzungstrakt12,18,20verursacht zu werden. Auf zellulärer Ebene zeigen die Sekundärzellen dieser Mutante eine abnormale Morphologie und verlieren ihre charakteristischen vacuolähnlichen Strukturen18,20,21. Mit dieser mutierten Linie haben wir zuvor versucht, Gene zu identifizieren, die an der SC-Funktion beteiligt sind, indem wir die Transkriptionsprofile ganzer AGs entweder von Wildtyp- oder mutierten Zubehördrüsen12verglichen haben. Auch andere Labore zeigten, dass SC-Zahl, Morphologie und Vakuolargehalt von der männlichen Ernährung, dem Paarungsstatus und dem Altervon 21,25,26Abs. 1 abhängen.
Obwohl mit diesen Ansätzen positive Fortschritte erzielt wurden, war ein vollständiges SC-Transkriptom bei weitem nicht erreicht. Die Seltenheit dieser Zellen in diesem Organ machte es schwierig, auch von wilden Typzellen weiterzukommen. Für die Erprobung der Genexpression wären Veränderungen in diesen Zellen nach bestimmten Umweltreizen noch schwieriger. Daher war eine Methode zur Isolierung und Reinigung von SC-RNA erforderlich, die schnell und einfach genug war, um unter verschiedenen genetischen Hintergründen und Umweltbedingungen durchzuführen.
Sowohl die Abd-B- als auch die MSA-Gene benötigen einen spezifischen 1,1 kb Enhancer aus dem Drosophila Bithorax Complex (genannt D1 Enhancer) für ihre Expression in SCs18,20. Dieser Enhancer wurde zuvor verwendet, um einen GAL4-Treiber zu erstellen, der, wenn er mit einem UAS-GFPverknüpft ist, in der Lage ist, eine starke GFP-Expression speziell in SCs zu erzeugen. Daher haben wir diese Zeile als Grundlage für ein FACS-Protokoll verwendet, um diese Zellen sowohl von Wildtyp als auch von iab-6cocuD1 AGs zu isolieren). Da iab-6cocuD1 mutierte SCs eine andere zelluläre Morphologie aufweisen, zeigen wir, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um Zellen zur Bestimmung ihres Transkriptoms von diesem seltenen Zelltyp unter sehr unterschiedlichen Bedingungen zu isolieren.
Methoden zur Zelldissoziation aus Drosophila-Gewebe wie imaginäre Scheiben sind bereits beschrieben23. Unsere Versuche, diese Verfahren einfach auf Zubehördrüsen anzuwenden, sind gescheitert und haben uns ermutigt, dieses neue Protokoll zu entwickeln. Protease-Verdauung und mechanische Trituration waren kritische Schritte, die wir für den Erfolg des Verfahrens in Schwierigkeiten gebracht haben, und so haben wir viele Hinweise in die Abschnitte 2 bis 5 platziert, um Experimentatoren zu…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern des Karch-Labors, der iGE3 Genomik-Plattenform, der Flow Cytometry Kernanlage der Universität Genf und Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, der das Protokoll für FACS festgelegt hat. Wir danken Luca Stickley für seine Hilfe bei der Visualisierung der Lesungen auf IGV. Wir danken uns für die sanfte Erlaubnis, Figuren wiederzuverwenden, und die Redakteure dafür, dass sie uns dazu aufgefordert haben, kreativ mit dem Schreiben umzustehen.
Diese Forschung wurde vom Land Genf (CI, RKM, FK), dem Schweizerischen Nationalfonds für Forschung (www.snf.ch) (FK und RKM) und Spenden der Claraz-Stiftung (FK) finanziert.
24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
Binocular microscope for dissection | |||
Binocular with light source for GFP | |||
Bunsen | |||
Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
Fine dissection forceps | |||
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
Glass dishes for dissection | |||
Ice bucket | |||
ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
P1000 | Gilson | ||
P20 | Gilson | ||
P200 | Gilson | ||
Papain | 50U/mL stock | ||
PBS | home made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
PolydT primers | |||
Random hexamer primers | |||
RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
Vortex |