Summary

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

Published: September 05, 2019
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Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Abstract

Para entender a função de um órgão, muitas vezes é útil entender o papel de suas populações de células constituintes. Infelizmente, a raridade de populações de células individuais muitas vezes torna difícil obter material suficiente para estudos moleculares. Por exemplo, a glândula acessória do sistema reprodutivo masculino de Drosophila contém dois tipos distintos de células secretoras. As células principais compõem 96% das células secretoras da glândula, enquanto as células secundárias (SC) compõem o restante 4% das células (cerca de 80 células por macho). Embora ambos os tipos da pilha produzam componentes importantes do líquido seminal, somente alguns genes são sabidos para ser específicos aos SCs. A raridade do SCs tem, até agora, dificultado o estudo da análise transcriptômica deste importante tipo de célula. Aqui, um método é apresentado que permite a purificação de SCs para extração de RNA e seqüenciamento. O protocolo consiste em primeiras glândulas dissecantes de moscas expressando um repórter GFP específico do SC e, em seguida, sujeitando essas glândulas à digestão da protease e dissociação mecânica para obter células individuais. Seguindo estas etapas, as pilhas individuais, vivas, GFP-marcadas são classificadas usando um classificador de célula ativado fluorescente (FACS) para a purificação do RNA. Este procedimento rende RNAs SC-específicos de ~ 40 machos por a condição para a jusante RT-qPCR e/ou o sequenciamento do RNA no curso de um dia. A rapidez e simplicidade do procedimento permite o transcriptoma de muitas moscas diferentes, de diferentes genótipos ou condições ambientais, a ser determinado em um curto período de tempo.

Introduction

Os órgãos são compo de tipos múltiplos da pilha, cada um com funções discretas e expressando às vezes vastamente jogos diferentes dos genes. Para obter uma compreensão precisa de como um órgão funciona, muitas vezes é crítico para estudar cada tipo de célula distinta que compõe este órgão. Um dos principais métodos utilizados para explorar a possível função é a análise do transcriptoma. Este método poderoso fornece um instantâneo da expressão de gene em uma pilha, para revelar processos e caminhos ativos. Entretanto, este tipo de análise é frequentemente difícil para as populações raras da pilha que devem ser purificadas das pilhas vizinhas distante mais-abundantes. Por exemplo, a glândula acessória masculina de Drosophila é um órgão compo primeiramente de dois tipos secretora da pilha. Como o mais raro dos dois tipos da pilha compreende somente 4% das pilhas desta glândula, o uso de uma análise específica do transcriptoma do Cell-Type não tinha sido usado para ajudar a determinar a função destas pilhas.

As glândulas acessórias (AGs) são órgãos do trato reprodutivo masculino em insetos. Eles são responsáveis pela produção da maioria das proteínas do fluido seminal (proteínas do fluido seminal (SFPs) e proteínas de glândula acessória (ACPs)). Alguns desses SFPs são conhecidos por induzir as respostas fisiológicas e comportamentais em fêmeas acasaladas, comumente chamadas de resposta pós-acoplamento (PMR). Alguns dos PMRs incluem: uma taxa aumentada da ovulação e do ovo-colocação, o armazenamento e a liberação do esperma, uma mudança na dieta fêmea, e uma diminuição na receptividade fêmea aos machos cortejando secundários1,2. Como os insetos impactam muitas questões societais importantes da saúde humana (como vetores de doenças mortais) para a agricultura (insetos podem ser pragas, ainda são críticas para a polinização e qualidade do solo), a compreensão da reprodução de insetos é uma importante área de pesquisa. O estudo de AGs e de ACPs foi avançado significativamente com o modelo do organismo Drosophila melanogaster. Estes estudos têm destacado o papel da AGS e algumas das proteínas individuais que produzem na criação do PMR, impactando o trabalho em outras espécies como ovetor dedoença Aedes aegypti3,4, eoutros insetos1 ,5. Além disso, como AGS secretam os constituintes do fluido seminal1,6eles são muitas vezes pensado como o análogo funcional da glândula prostática de mamíferos e vesicle seminal. Esta semelhança da função combinada com as similaridades moleculars entre os dois tecido-tipos, fêz ao AGs um modelo para a glândula de próstata nas moscas7.

Dentro do macho de Drosophila , há dois lóbulos de glândulas acessórias. Cada lobo pode ser visto como uma estrutura de saco-like compo de um monocamada de pilhas secretora que cercam um lúmen central, e envolvido por músculos lisos. Como mencionado acima, há dois tipos de células secretoras morfologicamente, desenvolvimentais e funcionalmente distintas que compõem esta glândula: as células principais em forma de poligonal (tornando-se ~ 96% das células), e as células secundárias maiores, redondas (SC) (tornando-se o restantes 4% das células, ou cerca de 40 células por lobo). Tem sido demonstrado que ambos os tipos de células produzem conjuntos distintos de ACPs para induzir e manter o PMR. A maioria dos dados obtidos até o momento destacam o papel de uma única proteína no desencadeamento da maioria dos comportamentos característicos da PMR. Esta proteína, o peptídeo sexual, é um pequeno, 36 aminoácido peptídeo que é secretado pelas células principais8,9,10. Embora o peptídeo sexual pareça desempenhar um papel importante na PMR, outros ACPs, produzidos por ambas as células principal e secundária, também têm demonstrado afetar vários aspectos da PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por exemplo, com base em nosso conhecimento atual, as SCs, por meio das proteínas que produzem, parecem ser necessárias para a perpetuação da sinalização de SP após o primeiro dia18.

Dada a raridade das SCs (apenas 80 células por macho), todo o nosso conhecimento sobre estas células e as proteínas que produzem provém de abordagens genéticas e candidatas. Até agora, somente uma lista relativamente pequena de genes foi mostrada para ser SC-specific. Esta lista inclui o proventrículo defeituoso da proteína de homeodomínio (DVE)19, o lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 e 1921, CG1656 e CG1757511, 15,21 e o fator de transcrição homeobox abdominal-b (Abd-b)18. Previamente, nós mostramos que um mutante deficiente para a expressão de Abd-B e o Lncrna MSA em pilhas secundárias (mutante deIAB-6cocuD1 ) encurta o comprimento do PMR de ~ 10 dias a somente um dia12 , 18 anos de , 20. este phenotype parece ser causado pelo armazenamento impróprio de SP no intervalo reprodutivo fêmea12,18,20. No nível celular, as células secundárias deste mutante mostram morfologia anormal, perdendo suas estruturas características vacuol-like18,20,21. Usando esta linha mutante, nós tentamos previamente identificar os genes envolvidos na função do SC comparando os perfis transcricional de AGS inteiros do tipo selvagem ou das glândulas acessórias do mutante12. Além disso, outros laboratórios mostraram que o número de SC, a morfologia e o conteúdo vacuolar dependem da dieta masculina, do estado de acasalamento e da idade21,25,26.

Embora o progresso positivo fosse feito usando estas aproximações, um transcriptoma completo do SC era longe de ser conseguido. A raridade destas pilhas neste órgão fêz difícil progredir mais mais mesmo das pilhas selvagens do tipo. Para testar a expressão gênica, as alterações nessas células após estímulos ambientais específicos seriam ainda mais difíceis. Assim, foi necessário um método para isolar e purificar o RNA SC que foi rápido e simples o suficiente para atuar diferentes origens genéticas e condições ambientais.

Ambos os genes de Abd-B e de MSA exigem um potenciador específico de 1,1 KB do complexo do bithorax de Drosophila (chamado o potenciador D1 ) para sua expressão em SCs18,20. Esse potenciador tem sido usado anteriormente para criar um driver GAL4 que, quando associado a um UAS-GFP, é capaz de direcionar a expressão GFP forte especificamente no SCs. Assim, utilizamos esta linha como base para um protocolo FACS para isolar essas células tanto do tipo selvagem como do IAB-6cocuD1 AGS). Como IAB-6cocuD1 Mutant SCs exibem uma morfologia celular diferente, nós mostramos que este protocolo pode ser usado para isolar as células para a determinação de seu transcriptoma a partir deste tipo de células raras condições vastamente diferentes.

Protocol

linhas 1. Drosophila usadas e coleção dos machos Para este protocolo, use machos expressando GFP no SCs e não nas células principais. Aqui, um excitador de abdb-GAL4 (descrito na referência18), recombined com UAS-GFP (no cromossoma 2) é usado. Outros drivers apropriados também podem ser usados. Para a isolação de SCs circunstâncias diferentes do mutante, cruze a mutação nas linhas que contêm a linha SC-específica de GFP. Colete dois lote…

Representative Results

O protocolo aqui apresentado permite que um experimentador Isole as células secundárias das glândulas acessórias masculinas da Drosophila e EXTRAIA seu RNA no decorrer de um único dia (Figura 1). Utilizamos a construção de Abd-B-GAL4 18 para rotular células secundárias (SC), mas não as células principais (MC) com GFP (Figura 2…

Discussion

Os métodos para a dissociação da pilha do tecido da Drosophila como discos imaginal são descritos já23. Nossas tentativas de simplesmente usar esses procedimentos em glândulas acessórias falharam, incentivando-nos a desenvolver este novo protocolo. A digestão da protease e a trituração mecânica foram passos críticos para o sucesso do procedimento e, assim, colocamos muitas anotações nas seções 2 a 5 para ajudar os experimentadores a obter resultados satisfatórios. Para qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós somos gratos aos membros do laboratório de Karch, ao plateform da genômica de iGE3, à facilidade do núcleo da citometria do fluxo da Universidade de Genebra, e ao Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye que ajustou o protocolo para FACS. Agradecemos Luca Stickley por sua ajuda com a visualização das leituras sobre IGV. Agradecemos-nos por uma gentil permissão para reutilizar figuras, e os editores para nos pedir para ser criativo com a escrita.

Esta pesquisa foi financiada pelo estado de Genebra (CI, RKM, FK), o fundo nacional suíço de pesquisa (www.snf.ch) (FK e RKM) e doações da Fundação Claraz (FK).

Materials

24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μl graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μl bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

References

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Cite This Article
Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (151), e60218, doi:10.3791/60218 (2019).

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