Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/60218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתק ולמיין אוכלוסיית תאים מסוימת של בלוטות אביזר זכר Drosophila ילה (תאים משניים) עבור רצפי RNA ו-RT-qpcr. בידוד התא מושגת באמצעות הטיהור של FACS של התאים המשניים של GFP-ביטוי לאחר תהליך מרובה שלב-דיסוציאציה המחייב ניתוח, העיכול הפרוטסיס ופיזור מכני.

Abstract

כדי להבין את הפונקציה של איבר, לעתים קרובות שימושי להבין את התפקיד של אוכלוסיית התאים המכוננת שלה. למרבה הצער, הנדירות של אוכלוסיות תאים בודדות מקשה בדרך כלל להשיג מספיק חומר למחקרים מולקולריים. לדוגמה, בלוטת האביזרים של מערכת הרבייה הגברית של דרוזוהילה מכילה שני סוגי תאי הפרשה נפרדים. התאים העיקריים לפצות 96% של התאים הפרשה של בלוטת, בעוד התאים המשניים (SC) לפצות את הנותרים 4% של תאים (כ 80 תאים לזכר). למרות ששני סוגי התא לייצר רכיבים חשובים של נוזל הזרע, רק כמה גנים ידועים להיות ספציפיים ה scs. הנדירות של ה scs יש, עד כה, מפריע ניתוח הטרנססקריפט המחקר של סוג תא חשוב זה. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת טיהור של ה scs עבור החילוץ RNA ורצפי. הפרוטוקול מורכב בלוטות הניתוח הראשון מפני זבובים המבטא כתבת GFP ספציפיים SC ולאחר מכן לאשר את הבלוטות הללו לעיכול פרוטאז ודיסוציאציה מכנית כדי להשיג תאים בודדים. בעקבות שלבים אלה, בודדים, חיים, מסומנים GFP תאים ממוינים באמצעות מסדר פלורסנט המופעל התא (FACS) לטיהור RNA. הליך זה התשואות RNAs ספציפי SC מ ~ 40 גברים לכל תנאי עבור במורד RT-qPCR ו/או רצפי RNA במהלך יום אחד. המהירות והפשטות של ההליך מאפשר הטרנססקריפט של זבובים שונים רבים, מתוך גנוטיפים שונים או תנאים סביבתיים, להיקבע בפרק זמן קצר.

Introduction

איברים מורכב מסוגי תאים מרובים, כל אחד עם פונקציות דיסקרטית ולפעמים לבטא קבוצות שונות בהרבה של גנים. כדי לקבל הבנה מדויקת של אופן הפעולה של איבר, זה לעתים קרובות קריטי ללמוד כל סוג תא שונה שיוצר את האיבר הזה. אחת השיטות הראשיות המשמשות לחקר הפונקציה האפשרית היא ניתוח להמרה. שיטה רבת עוצמה זו מספקת תמונה של הביטוי הגנטי בתא, כדי לחשוף תהליכים ומסלולים פעילים. עם זאת, סוג זה של ניתוח קשה לעתים קרובות עבור אוכלוסיות תאים נדירים שיש לטהר מתאים השכנה הרבה יותר שופע. לדוגמה, בלוטת העזר הגברית דרוזוהילה היא איבר שנוצר בעיקר משני סוגי תאי הפרשה. ככל שהנדירים יותר מבין שני סוגי התא מורכב רק 4% מהתאים של בלוטה זו, השימוש בניתוח מסוג תא מסוים לא היה בשימוש כדי לעזור לקבוע את הפונקציה של תאים אלה.

בלוטות האביזרים (AGs) הם איברים של מערכת הרבייה הגברית בחרקים. הם אחראים לייצור של רוב החלבונים של נוזל הזרע (חלבונים נוזלי הזרע (SFPs) ו בלוטת אביזר חלבונים (ACPs)). חלק אלה SFPs ידועים כדי לזרז את התגובות הפיסיולוגיים והתנהגותיים בנשים מזדווג, שנקרא בדרך כלל תגובה לאחר ההזדווגות (PMR). חלק מה ' כוללים: ביוץ מוגבר וקצב הנחת ביצים, אחסון ושחרור של זרע, שינוי בתזונה נשית וירידה בקבלה נשית לגברים מחזרים משניים1,2. כמו חרקים המשפיעים על סוגיות חברתיות גדולות רבות מבריאות האדם (כמו וקטורים עבור מחלות קטלניות) לחקלאות (חרקים יכולים להיות מזיקים, אך הם קריטיים להאבקה ולאיכות הקרקע), הבנת שעתוק חרקים הוא תחום חשוב של מחקר. המחקר של AGs ו-ACPs כבר מתקדמים באופן משמעותי עם האורגניזם מודל Drosophila ילה מלאנוגסטר. מחקרים אלה הדגישו את התפקיד של AGs וחלק מהחלבונים הבודדים שהם מייצרים ביצירת pmr, להשפיע על העבודה במינים אחרים כמו aedes המחלה וקטור aמצרים3,4, וחרקים אחרים1 ,5. יתר על כן, כמו AGs להפריש את המרכיבים של נוזל הזרע1,6 הם נחשבים לעתים קרובות כאנלוגי פונקציונלי של בלוטת הערמונית היונקים הזרע. פונקציה זו דומה בשילוב עם דמיון מולקולרי בין שני סוגי הרקמה, עשו את AGs מודל עבור בלוטת הערמונית זבובים7.

בתוך מעשה זכר, יש שתי אונות של בלוטות אביזר. כל אונה ניתן לראות כמו מבנה סאק כמו שק העשוי מונאולייר של תאים הפרשה סביב לומן מרכזי, עטוף על ידי שרירים חלקים. כפי שהוזכר לעיל, יש שני מורפולוגית, פיתוח מבחינה מנטלית ופונקציונלית הסוד סוגי תאים ממציא בלוטה זו: התאים העיקריים בצורת מצולע (לפצות ~ 96% של התאים), והגדול, תאים משניים עגולים (SC) (ממציא את ה הנותרים 4% של תאים, או כ 40 תאים לכל אונה). זה הוכח כי שני סוגי התא לייצר סטים שונים של ACPs כדי לגרום ולתחזק את PMR. רוב הנתונים שהושגו עד היום להדגיש את התפקיד של חלבון יחיד מפעילה את רוב ההתנהגויות האופייניות של PMR. חלבון זה, פפטיד המין, הוא קטן, 36 הפפטיד חומצות אמינו המופרש על ידי התאים העיקריים8,9,10. למרות פפטיד מין נראה לשחק תפקיד מרכזי pmr, acps אחרים, המיוצר על ידי שני התאים העיקריים והמשני, הוכחו גם להשפיע על היבטים שונים של pmr11,12,13,14 ,15,16,17. לדוגמה, בהתבסס על הידע הנוכחי שלנו, ה scs, דרך החלבונים שהם מייצרים, נראה צורך לנצח של איתות SP לאחר היום הראשון18.

לאור הנדירות של ה scs (רק 80 תאים לזכר), כל הידע שלנו על התאים האלה ואת החלבונים שהם מייצרים מגיע גנטיקה וגישות המועמדים. עד כה, רק רשימה קטנה יחסית של גנים הוכח להיות מוגדר SC. רשימה זו כוללת את החלבון הביאואואמין הפגום הבלוטות (dve)19, האינקרונה מס ' 20, Rab6, 7, 11 ו 1921, CG1656 ו CG1757511, 15,21 והומבוקס מקדם התמלול הבטן-b (עבד-ב)18. בעבר, הצגנו כי מוטציה לקויה הן הביטוי של עבד-B ו- lncRNA מס בתאים משניים (מעבדה-6cocuD1 מוטציה) מקצר את אורך pmr מ ~ 10 ימים רק יום אחד12 , מיכל בן 18 , 20. הפנוטיפ הזה נראה כתוצאה מאחסון לא תקין של SP במערכת הרבייה הנשית12,18,20. במישור הסלולר, התאים המשניים של המוטציות האלה מראים מורפולוגיה לא נורמלית, ומאבדים את המבנה האופייני שלהם במבנים שלהם18,20,21. באמצעות קו זה מוטציה, בעבר ניסינו לזהות גנים המעורבים בפונקציה SC על ידי השוואת הפרופילים הטרנססקריפט של AGs שלמים מסוג פראי או בלוטות אביזר מוטציה12. כמו כן, מעבדות אחרות הראו כי מספר SC, מורפולוגיה ומין תוכן וולאואר תלוי בתזונה גברית, סטטוס ההזדווגות וגיל21,25,26.

למרות התקדמות חיובית נעשתה באמצעות גישות אלה, מלאה SC ההמרה היה רחוק מושגת. האטימות של תאים אלה באיבר זה הפכה את זה קשה להתקדם עוד יותר בתאי סוג פראי. לבדיקת ביטוי גנים, שינויים בתאים אלה לאחר גירויים סביבתיים מסוימים יהיה אפילו קשה יותר. כך, שיטה לבידוד וטיהור SC RNA כי היה מהיר ופשוט מספיק כדי לבצע תחת רקעים גנטיים שונים ותנאים סביבתיים היה צורך.

הגנים של עבד-B ו- מס ' מס ' דורשים משפר ספציפי של 1.1 kb ממתחם דרוזוהילה בבית החזה (המכונה D1 משפר) על ביטויו בה scs18,20. משפר זה בעבר נעשה שימוש כדי ליצור מנהל התקן GAL4 , כאשר משויך UAS-gfp, הוא מסוגל לנהוג ביטוי gfp חזק במיוחד ב ה scs. לפיכך, השתמשנו בשורה זו כבסיס לפרוטוקול FACS לבידוד תאים אלה מסוג פראי וממעבדה-6cocuD1 AGs). כמו המעבדה -6cocuD1 מוטציה ה scs להציג מורפולוגיה סלולרית שונים, אנו מראים כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד תאים לקביעת ההמרה שלהם מסוג זה תא נדיר תחת תנאים שונים בהרבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מסילות דרוסופילה משומשים ואוסף של זכרים

  1. עבור פרוטוקול זה, השתמש בזכרים המבטאים GFP ב-ה scs ולא בתאים הראשיים. כאן, מנהל התקן Abdb-GAL4 (המתואר בהתייחסות18), בשילוב עם uas-gfp (על כרומוזום 2) משמש. ניתן להשתמש גם בנהגים מתאימים אחרים. עבור בידוד של ה scs בתנאים שונים של מוטציות, לחצות את המוטציה לתוך קווים המכילים את הקו הספציפי SC-GFP.
  2. לאסוף שתי קבוצות של כ -25 בריאים, זכרים בתולה עבור כל גנוטיפ ולגילם ב 25 ° c עבור 3-4 ימים בבקבוקונים עם מזון מתוצרת הדרוזולה טרי.
    הערה: כגיל, מצב ההזדווגות, התזונה והסביבה החברתית כל אחד משפיעים על ביולוגיה של הרבייה, יש לעקוב אחר פרוטוקולים נוקשים כדי לשלוט בפרמטרים אלה. זכרים הבתולה התיישן במשך 3-4 ימים לאחר גולמי eclosion ב -25 ° c עם מחזור אור/12 h 12 שנים/כהות, על הארוחה הרגילה קמח-שמרים מזון, בקבוצות של 20-25 גברים במבחנה.

2. הכנת פתרונות וחומרים

  1. הכינו את הפתרונות הבאים.
    1. הכנת סרום שיושלם בינוני (SSM): הדרוזוזה של שניידר מדיום בינוני עם 10% החום מופעל סרום בקר ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. הכינו את מחלת האנזים של 1x טריפסין (לדוגמה, טרילה אקספרס אנזים) והחנות בטמפרטורת החדר.
    3. הכינו את הליבטים של פפאין [50 U/mL] (מאוחסן ב-20 ° c והופסדר פעם אחת בלבד).
    4. הכינו תמיסת מלח באגירה 1 x פוספט (PBS, מאוחסנת בטמפרטורת החדר).
  2. להכין כמה טיפים להבה מעוגל pipet עבור הדיסוציאציה הפיזית של בלוטות אביזר.
    הערה: השתמש     בעצות שמירה נמוכות לטיפול בבלוטות האבזר כשהן נוטות לדבוק בפלסטיק לא מטופל. תהליך עיגול הלהבה מקטין את הקצה הפותח ומsmoothens את קצות הקצה. זה מבטיח דיסוציאציה יעילה לאחר העיכול peptidase מבלי להגז את קרום התא.
    1. גזור 1 200 μL טיפ עם להב חד ולהעביר אותו בעדינות מעל להבה כדי לעגל את הקצה שלה כך הפתח הוא רחב יותר, אבל חלק לטיפול במהלך שלב 3.7.
    2. צמצם את הפתיחה של עצות מרובות של 1,000 μL על-ידי העברת הקצה בסמוך ללהבה במשך פחות משנייה אחת. סובב את הקצה במקצת כדי למנוע התכה או סתימת. מיין את העצות שעשויות להיות צר יותר לרוחב. זה יכול להיעשות על ידי עיתוי מהירות השאיפה. נסה לנתק מדגם בקנה מידה קטן של AGs כדי לבדוק את היעילות של עצות הצרה ביותר.
      הערה: עצות אלה קריטיות לעצבנות מכנית (שלבים 5.2 ו-5.3). איכות להבה מעוגל pipet טיפים לאפשר דיסוציאציה מלאה תוך שמירה על הכדאיות התא. ככזה, טיפים אלה נשטפים ביסודיות עם מים בסוף ההליך לשימוש חוזר. הדבר מאפשר את הדיסוציאציה ליום יום.

3. חיתוך בלוטות אביזר

  1. הכניסו 20 ל -25 מדרוזופילה . בקערת זכוכית על הקרח
  2. . בסדר. להוריד את מערכת הרבייה שלה לנקות את הצמד בלוטת אביזר מכל הרקמות האחרות מלבד צינור הפליטה.
    הערה: הסר את האשכים מכיוון שהזרע המשוחרר יכול ליצור גושים ולהפריע לתהליך הדיסוציאציה. הסר את הנורה הפליטה, מה שהופך את הטיפול קשה כאשר הוא צף.
  3. עם מלקחיים, אביזר העברת בלוטות לצלחת זכוכית מלא SSM בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 3.2-3.3 20 פעמים כדי לקבל אצווה של 20 זוגות של בלוטות ב SSM.
    הערה: שלבים אלה יהיו מושגת בתוך 15 עד 20 דקות. AGs צריך להיראות בריא, ואת התנועות הפריסטלטיות של שכבת השריר סביב בלוטות צריך להיות גלוי. ניתן לפקח על GFP בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט.
  4. העבר בלוטות אביזר ל 1x PBS עבור 1-2 דקות לשטוף בטמפרטורת החדר.
    הערה: עבור דיסוציאציה טובה יותר, זה הכרחי לשטוף את הבלוטות עם PBS. עם זאת, משך שלב זה צריך להיות מוגבל כמו התאים להראות סימנים של לחץ ב-PBS; תאים משניים הנתק ב-PBS להתנפח במהירות ולמות.
  5. לדלל 20 μl פפאין [50 U/mL] לתוך 180 μl של 1x טריפסין אנזים להשיג את פתרון הדיסוציאציה (כדי לשנות את גודל למעלה או למטה לשמור 9 μl של אנזים טריפסין ו 1 μl של פפאין עבור כל זכר). עם מלקחיים, להעביר בלוטות אביזר לפתרון זה.
  6. לבודד את הקצה של בלוטות אביזר (המכיל תאים משניים) מהחלק האבובי. השתמש מלקחיים עדינים לצבוט בחוזקה באמצע האונה הבלוטות לחתוך עם קצה חדה של מלקחיים שנייה. הסר את החלק הטוב ביותר של בלוטות אביזר ואת צינור הפליטה כדי לשפר את הדיסוציאציה ולהפחית את זמן מיון התא.
    הערה: מנתח את החלק המרוחק מ 20 זוגות של בלוטות ייקח 15 עד 20 דקות והעיכול על ידי הפמיסים יהיה ובכך להתחיל בטמפרטורת החדר.
  7. לאחר כל העצות בלוטת כבר גזור, להעביר אותם לתוך צינור 1.5 mL באמצעות מיוחד 200 μL מחמד טיפ מוכן בשלב 2.2.1. זה צריך להיות רחב, מעוגל ורטוב לפני הטיפול בלוטות.
    הערה: כדי לקבל את רקמת בלוטת אביזר, טיפים תמיד צריך להיות מראש רטוב עם הפתרון המתאים (טריפסין אנזים או SSM, לשמור על שפופרת אחת של כל אחד למטרה זו). לשטוף בזהירות את הטיפים בין דגימות כדי למנוע זיהום.

4. עיכול רקמות

  1. מניחים את המיקרו צינור ב 37 ° צ' שייקר עבור 60 דקות, נדנדה ב 1,000 rpm.
    הערה: זמן העצבנות והעיכול הם קריטיים לדיסוציאציה מוצלחת. העיכול קצר או חסר תנועה ייתן את הדיסוציאציה המסכנה, כנראה משום ששכבת השריר החיצונית ונוזל הזרע הפנימי בחומר צמיגי מגינים על תאי בלוטת האביזרים.
  2. הוסיפו 1 מ ל SSM בטמפרטורת החדר כדי לעצור את העיכול ולהמשיך מיד לשלב 5.

5. דיסוציאציה מכנית של תאים

  1. באמצעות מעוגל רחב 1,000 μL קצה, מראש רטוב עם SSM, להעביר את המדגם לצלחת 24. ניטור הזריחה GFP תחת המיקרוסקופ: עצות בלוטת רוב צריך להיראות שלמים וכמה SC יש להתנתק.
  2. באמצעות קצה מעוגל קצר pipet שנוצר בשלב 2.2.2, pipet למעלה ולמטה 3 כדי 5 פעמים כדי לשבש את רקמת בלוטת אביזר.
    הערה: צג הקרינה הפלואורסצנטית כדי לוודא שתיקוני רקמות גדולים שבורים. חזור על השלב 5.2 אם אין זה כך.
  3. באמצעות קצה מאוד צר מעוגל pipet (שנוצר בשלב 2.2.2), pipet למעלה ולמטה 1-2 פעמים.
    הערה: רק תאים בודדים צריכים להיות גלויים לאחר שלב 5.3. מומלץ להשתמש בלוחות של 24 שעות מכיוון שהם מאפשרים ניטור קל של התהליך. כאשר מספר דגימות עובדו ונתן תוצאה משביעת רצון (תאים משניים בריאים מראה מושלמת שאינו מתאים), שלבי הפיליטוף יבוצעו במיקרו-צינורית.
  4. המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב בתחתית הבאר ולהסיר את עודפי SSM כדי להקטין את זמן המיון.
    הערה: מתן תאים להתיישב הוכיחה מעולה על שיטות חלופיות כמו צנטריפוגה, ומאפשר בדיקה חזותית אחרונה של תאים בדיוק לפני FACS.
  5. Pipet התאים לתוך נקי 1.5 mL ובריכה דגימות זהות (שתי אצוות של 20 זכרים עבור כל תנאי). לשטוף בארות עם SSM לשחזר את התאים האחרונים, ו ללטף אותם לתוך הצינור (להשתמש באמצעי אחסון קטן).
  6. ב 1.5 מיקרוצינוריות mL, להוסיף 300 μL של פתרון לליזה תאים 1 μL של פרוטטינואז K [50 μg/μL] (פתרונות המסופקים בערכת הטיהור של RNA, ראה שלב 7). הכן שתי שפופרות לכל מדגם (אחד עבור MCs ואחד עבור ה scs).

6. FACS (מיון תאים מופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית)

  1. הוסף מסמן הכדאיות לכל דוגמה להיות ממוין כמה דקות לפני מיון (0.3 mM Draq7).
    זהירות: יש לטפל בDraq7 בזהירות.
  2. מיון אוכלוסיה הומוגנית של תאים משניים חיים (GFP-חיוביים, Draq7-שלילי תאים). במיקרו-צינורית אחרת, מיון אוכלוסיה של תאים ראשיים (קטן יותר, GFP-שלילי, Draq7-שלילי תאים). השתמש באסטרטגיית הפעולה הבאה של ה-FACS:
    הערה:     הגדר את הלחץ של סדרן התא ב 25 PSI ולעבור תאים באמצעות זרבובית 100 יקרומטר. שיעור המיון הוא סביב 2,000 תאים/s.
    1. הוצא את הפסולת ובחר את התאים הכולל בהתבסס על FSC-להאס-אס (איור 2E) כדי להוציא את הפסולת.
    2. אל תכלול תאים מתים. לרגש Draq7 עם לייזר ננומטר 640 ולאסוף הפליטה הנפלטת עם מסנן לעבור הלהקה 795/70. שער Draq7 התאים החיוביים (איור 2F).
    3. הסרת כפולים באמצעות מסירה כפולה על האס. אס. אס לעומת אס. אס. אס. ו. FSC-A לעומת FSC-H (איור 2H).
      הערה: אל תכלול את התא doublets באמצעות המשך כפול, כדי להפחית את זיהום התא הראשי.
    4. מיין ~ 550 GFP-חיוביים תאים לתוך מיקרוצינורית 1.5 mL עם מאגר לוליזיס ו פרוטטינואז K. אוכלוסייה זו נחשבת לתאים משניים (SC, איור 2G). לרגש GFP ב 488 ננומטר ולאסוף את הזריחה הנפלטת עם מסנן לעבור הלהקה 526/52.
    5. מיון ~ 1,000 GFP שליליים תאים, הומוגנית קטן בגודל, לתוך מיקרוtube 1.5 mL עם מאגר לוליזיס ו פרוטטינואז K. אוכלוסייה זו נחשבת התאים העיקריים (MC, איור 2G).
    6. . וורטקס כל הדגימות
      הערה: מ 40 גברים (~ 40 x 80 SC = 3,200 תאים משניים), 600 ל800 חי התאים המשניים מתקבלים (סביב 20-25% אחזור). הפסק למיין סביב 550 SC ו 1,000 MC כדי לנרמל דגימות.

7. הוצאת רנ א

הערה: השתמשנו באפיטרה לטיהור של רנ א להפקת RNA, עם העיבודים הבאים. ערכות אחרות עשוי לשמש כל עוד התשואה גבוהה מספיק כדי להכין ספריה עבור רצף מ ~ 500 תאים (2 ng RNAs היה בשימוש כאן).

  1. חום דגימות ב 65 ° c עבור 15 דקות ומערבולת כל 5 דקות כדי להשלים את הליזה התא.
  2. הניחו דגימות על הקרח במשך 5 דקות. בצע את ההמלצות של היצרן עבור חומצות גרעין משקעים (חלקים "המשקעים של חומצות גרעין סה כ" ו "הסרת דנ א מזהם ההכנות הכולל חומצות גרעין").
  3. השעיה גלולה RNA ב 10 μL של מאגר האטה חינם RNase.
  4. הוספת מעכב RNase (אופציונלי).
  5. דגימות מהחנות ב-80 ° c.

8. איכות בקרת RNA כמות, איכות וספציפיות

  1. הערכת איכות וריכוז RNA. בשל אמצעי האחסון הקטן והריכוז, השתמש ב-RNA 6000 פיקו צ'יפס כאן. באיכות טובה RNA מוגדר לא מושפל, גלוי כמו בסיס נמוך עם פסגות חדות המתאימות rRNAs.
  2. RT-qPCR כדי לשלוט בזהות של תאים ממוינים
    1. לבצע תמלול הפוכה עם 2 ng של RNAs הכולל באמצעות החוקרים אקראיים כמו התחל. לבצע RT ב-RNA תא משני ו-RNA התא הראשי.
      הערה: cDNAs יכול להיות מדולל, מצוטט, ונשאר קפוא לשימוש מאוחר יותר.
    2. לבצע בזמן אמת PCR כמותי באמצעות זוגות פריימר מתאים כדי לכמת שירות הגנים (אלפא-טובולין, 18S rRNA), תאים משניים ספציפיים הגנים (מס א, Rab19, עבד-B) ואת התא הראשי ספציפי גן (מין פפטיד).

9. רצף (cDNA הכנה, רצף וניתוח נתונים)

  1. השתמש ב-2 ng של RNAs כולל כדי לסנתז cDNAs עם צבעי יסוד פולידט. השתמש בטכנולוגיה חכמה יותר כדי להגביר את ההגברה.
  2. השתמש בערכת XT של Nextera כדי להכין את הספריה.
  3. רצף באמצעות ריבוב, 100 נוקלאוטידים בודד קריאות ברצף (למרות 50 נוקלאוטידים קריאות מתאימות לרוב המטרות) כדי להניב סביב 30,000,000 קורא עבור כל מדגם.

10. ניתוח נתונים

  1. . רוץ.
  2. השתמש בתנינים הכוכב כדי למפות את הקריאות ב-UCSC dm6 Drosophila התייחסות הגנום וליצור קבצי. bam. השתמש במציג גנומיקה אינטגרטיבית (IGV) כדי להמחיש קריאות בדפדפן הגנום.
  3. השתמש ב-HTSeq כדי לבצע ספירות גנים.
  4. השתמש בשיטה ממוצע חתוך של M-values (TMM) כדי לנרמל ספירות גנים22. השתמש ב-edgeR כדי לבצע ניתוח סטטיסטי של ביטוי דיפרנציאלי, מחלקות MA ו-PCA.
  5. לניתוח וסטטיסטיקה של ביטויים גנטיים, השתמש במודל ליניארי כללי, הסבירות F-test עם שיעור זיהוי שווא (רוזוולט) ובנימיני & הוכברג תיקון (BH).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לאחד הניסויים לבודד תאים משניים מתוך בלוטות אביזר זכר דרוזוהילה ולחלץ את ה-RNA שלהם במהלך יום אחד (איור 1).

אנו משתמשים במבנה עבד-B-GAL4 18 כדי לסמן תאים משניים (SC) אבל לא התאים העיקריים (MC) עם gfp (איור 2א). מטרה אחת של הליך זה היא להשיג את סוג פראי transcript של ה scs (פראי סוג נכתב עם פסיקים הפוכים מאז הם מתקבלים מתוך זבובים טרנסגניים המבטא GFP ו GAL4). מטרה נוספת היא להשיג SC RNA באמצעות הליך מהיר וקל המאפשר לימוד ביטוי הגנים שלהם בתנאים שונים. כך, אנו ביצעו את ההליך הזה באמצעות סוג פראי ו "המעבדה -6cocuD1" מוטציות הנושאות מחיקה 1.1 kb הסרת משפר של עבד-B אחראי על ביטוי SC. מחיקה זו מסירה גם את היזם של מסא, תעתיק חשוב לפיתוח תאים משניים, מורפולוגיה ופונקציה18,20 (איור 2ב, ג). פרוטוקול זה חזר על עצמו שלוש פעמים עם 2 גנוטיפ בכל פעם כדי להשיג טריליטים ביולוגיים (להלן המכונה WT -1, 2,-3 עבור סוג פראי ו D1-1, -2 ו-3 עבור המעבדה-6cocuD1).

פרוטוקול זה מאפשר הדיסוציאציה של MC ו-SC מבלוטות האביזרים של דרוזוהילה בעוד כמה שעות (איור 2ד). שתי אוכלוסיות תאים ממוינות מכן בשתי שפופרות שונות כדי לבודד MCs ו ה scs. אסטרטגיית הסיכום עבור FACS מראה באיור 2E-2g. Draq7 מאפשר הערכת הכדאיות של התא סביב 70% עבור המדגם כולו (איור 2F). הסינגטים מייצגים מעל 90% מאוכלוסיית ה-SC, ולמעלה מ-80% מאוכלוסיית ה-MC, כפי שנאמד ב-FSC-A לעומת FSC-h ובאס. (ראה איור 2H). הדבר משקף את הדיסוציאציה היעילה. כ-10% מאירועי המיון בוטלו מכיוון שתאים או פסולת אחרים היו קיימים באותה droplet של FACS. מ 40 גברים, אנחנו בדרך כלל לאסוף 550 ה scs ו 1,000 MCs ולאחר מכן פסיקות מיון. ממדגם 1 (מתוך 6), לא יכולנו להגיע 550 תאים משניים. המדגם WT-1 הושג אפוא רק 427 SC אך סיפק RNA של איכות וכמות דומים אחרים.

תאים ממוינים לתוך מאגר הליזה (המכיל פרוטאינאז K). ברגע שכל הדגימות מוכנות, RNAs מופק מכל מדגם תא כדי לקבל כדורי RNA בסוף היום. איכות וכמות של RNAs מוערכים באמצעות Bioanalyzer עם שבב מתאים להתמודד עם ריכוזים נמוכים וכרכים קטנים. בגלל ריכוזי מוערך היו משתנה בין דגימות (החל מעל 1,300 pg/μL עד 344 pg/μL, ראה איור 3א), אנו מותאמים את החומר ההתחלתי עבור שני RT-Qpcr ו cdna סינתזה הספרייה בערך 2 ng (נמדד ריכוזים אינם מדויקים במיוחד). אנו לכמת את הביטוי של גנים ספציפיים על ידי בזמן אמת qPCR על סוג פראי MC ו-SC מחלץ לשלוט על הזהות של אוכלוסיות התאים אנו מיון. איור 3 B מציג ביטוי גנטי ככמת יחסית לביטוי alpha-טובולין . גנים משק בית כמו 18 rrna ו -alpha-טובולין מזוהים בכל הדגימות, כצפוי. להיפך, Rab19 gene הגנים מזוהה רק מתוך מחלץ SC, ו-Mc גן סקס פפטיד מזוהה רק מ-mc. אנו מודעים לכך Rab19 ביטוי במעבדה -6cocuD1 מוטציה היא נמוכה יחסית פראי סוג sc, מציע כי הביטוי של הגן הזה מושפע על ידי אובדן של עבד-B ו -מס (בעקביות, הגדול Rab19 לות המסומנות בתוויות אבדו במעבדה-6cocuD1 מוטציה21). התעתיק המשני הספציפי לתא מזוהה רק מ מסוג פראי SC ולא מ-MC, וגם לא ממעבדת-6cocuD1 ה scs, אשר צפוי מאז היזם מס א נמחק במוטציות זה. בסך הכל, QCs המוצג באיור 3 להדגים כי rnas שהתקבלו דרך פרוטוקול זה אינם מושפל, וכי הן אוכלוסיות תאים (SC ו-MC) ממוינים בהצלחה מבלוטות אביזר, הן סוג פראי ומוטציה תנאים. רק התאים המשניים ' RNAs ' הגיעו לכאן ברצף, אך שים לב שהליך זה מאפשר במקביל ליצור פרופילים של ה scs ו-MCs.

רנ א-רצף התממשו באמצעות הליכים סטנדרטיים. כאן, אנו רק לדון בניתוחי בקרת איכות הרלוונטיים למטרת שיטה זו. כאשר מתקבלים רצפים, הקריאות ממופות לייחוס דרוזוהילה הגנום, המיוחס לגנים ומנורמל. PCA (ניתוח המרכיב העיקרי) בוצע על 6 דגימות (3 סוג פראי ו 3 ממעבדה-6cocuD1 משכפל). ככל שההבדלים בנתונים ככל האפשר מתומחרים ב-PC1, וככל שההבדלים הנותרים מתומחרים ב-PC2. כפי שמוצג באיור 4א, משכפל את האשכול ביחד, ורחוק ממעבדת-6cocuD1 דגימות. זה מראה כי דגימות WT דומים יותר זה לזה ממה שהם ממוטציות. זה ממחיש את שיטת התוכנה והיכולת שלה לזהות תוכנית גנטית נורמלית מתאי מוטציה משני. בעוד שהדוגמאות d1-2 ו-D1-3 מרוכזות יחד, אנו מודעים לכך שדגימת D1-1 מתפצלת לחלוטין. מאז כל QCs עבור שכפול זה טוב ודומה לכל משכפל אחרים, אנחנו יכולים להוציא בעיה הכנה לדוגמה (29,000,000 קורא בסך הכל, > 76% אשר ליישר באופן ייחודי הגנום התייחסות. בין אלה, > 77% מיוחסים גנים, > 90% הם mRNAs, ו < 3% הם rRNA). סטייה זו יכולה לשקף כי ביטוי הגנים ב-SC אינו יציב במעבדה-6-גרה, למרות שבדיקת השערה זו תדרוש יותר משכפל.

המחשה קוראת מיושר גנים מסוימים על הגנום מאפשר שערוך חזותי של איכות הנתונים. איור 4 מציג מבחר של גנים, עם קריאות מ-1 נציג שכפול עבור כל גנוטיפ. באופן לא מפתיע, גנים שירות כגון Act5C מבוטאים בשני הגנוטיפים (איור 4ב), כמו גם את הגנים הספציפיים של SC Rab19 ו- dve (איור 4ג, ד). העדר מאשרת כי polydT הפוכה באופן סלקטיבי שעתוק mRNAs בוגרת עבור הכנה לספרייה cDNA. בעיקר, אנו יכולים לראות וריאציות חשובות ומשמעותיות בביטוי של גנים ספציפיים בין סוג פראי וממעבדה-6cocuD1 SC. זה לדוגמה באיור 4E על ידי הגן מס א שהביטוי החזק בסוג פראי הוא איבד במעבדה-6cocuD1. מס א מוצג כהוכחה לעיקרון ששיטה זו מאפשרת לזהות גנים שאינם מוסדרים בתנאי מוטציה. זה יעזור להבין את פנוטיפים שנצפו במוטציה הזאת, ואולי לתת תובנות חדשות לפונקציות רגילות תאים משניים.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על הפרוטוקול. השלבים המרכזיים של הפרוטוקול מוצגים, עם ציר הזמן בצד ימין. הליך זה מאפשר לאחד להתחיל עם לחיות Drosophila ילה בבוקר יש הנתק תאים בלוטת האביזרים עד הצהריים, למיין אותם מבוסס על ביטוי gfp, ולקבל rnas שלהם שחולצו עד סוף יום העבודה. רצפי RNA וניתוח נתונים ייקח בדרך כלל כמה שבועות. דמות זו השתנתה מהפניה27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידוד ומיון של תאים משניים מבוססי GFP. (א) מוקד של התמונה של עבד-B:GAL4 UAS-gfp בלוטת אביזר ביטוי gfp בתאים משניים (SC), אבל לא בתאים העיקריים (MC). גרעינים הם מוכתמים DAPI (כחול). קו לבן מנוקד מפריד את האונות שלה. . אד הוא צינור הפליטה הפסים הלבנים בפינה השמאלית העליונה הם משקל של 50 יקרומטר. (ב,ג) תצוגות מוגדלות של בלוטת אביזר החלק עם SC ביטוי gfp, בסוג פראי (ב) ו ממעבדה-6cocuD1 (ג) רקע. (ד) הנתק תאים בהגדלה נמוכה תחת המשקפת gfp. (E-ח) FACS לצבור אסטרטגיה לטיהור SC ו-MC. נקודות אדומות על כל הפאנלים המוצג ה scs כפי שהוגדר בלוח (G). ראשית הפסולת הם נשלל (E, step 6.2.1) כמו גם התאים המתים draq-7 חיובי (F, שלב 6.2.2). תאים GFP חיוביים נבחרים (SC) כמו גם אוכלוסיה הומוגנית של תאים שליליים GFP (G, שלבים 6.2.4 ו 6.2.5). Doublets מושמטים הן מ-MC והן מאוכלוסיית SC (שלב 6.2.3, רק ה-סי. אס. אס. לעומת המרכז למידע על המרכז למטרות SC מוצג ב- 2H כדוגמה). דמות זו השתנתה מהפניה27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: QC על RNAs: איכות, כמות וספציפיות לסוג תא. (א) שליטה באיכות RNA ובהערכת ריכוז ב-PicoChip. השיא של 25 nt הוא הפקד עבור כימות. קו בסיס נמוך מעיד על ירידה נמוכה ואת 2 הפסגות המרכזיות הן RNAs הריבוזומלית. 3 דגימות המשמשות RT-qPCR מוצגים, האיכות שלהם הוא נציג של כל הדגימות RNA המשמשים במחקר זה, ואת ריכוזי המשוער שלהם לשקף את הווריאציה ב-RNA הכולל שקיבלנו בין דגימות. (ב) RT-qpcr מדגימים את הספציפיות של מיון התאים המשניים (SC) והתאים הראשיים (MC). קוונפיקציה של ביטוי גנטי נעשה באמצעות הנוסחה q = 2(40-Cq) . כל טרילקאט של כל אחד מהגנים בכל תנאי הוא מנורמל לכמות ממוצע של אלפא-טובולין RNA כדי לפצות על וריאציה כוללת של RNA. קווי שגיאה מציגים סטיית תקן. WT פירושו סוג פראי ו D1 מתייחס המעבדה-6cocuD1 החשבונאי. דמות זו השתנתה מהפניה27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: QC על הנתונים רצפי RNA. (א) ניתוח רכיבים עיקריים (pca) ב WT-1,-2,-3 (נקודות ירוקות) ו-D1-1,-2,-3 (נקודות כחולות) וערכות נתונים של רצפי RNA. (ב-ה) ברצף הקריאות ממופה לגנום ההפניה דרוזוהילה באמצעות תוכנת IGV. רק מדגם מייצג אחד של כל גנוטיפ מוצג למען בהירות (WT-1 ו-D1-2), ורק מספר מסים ספציפיים מוצגים. שמות גנים נכתבים על גבי כל פאנל, > ו< סמלים מתייחסים לאוריינטציה שלהם. מספרים בסוגריים מייצגים עבור כל רצועה בקנה מידה עבור מספר הקריאות לכל זוג בסיס DNA. קנה מידה זה זהה בשני התנאים עבור גן נתון, אך משתנה בין גנים להדמיה טובה יותר. ברים כחולים בחלק התחתון של כל הפאנל להראות גנים introns (קו דק), exons (קו רחב) ו ORF (מלבנים עם > >). שים לב כי Rab19 ו Arl5 הם חופפים, גנים מתכנסת (ג). דמות זו השתנתה מהפניה27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שימוש בתחל עבור RT-qPCR במחקר זה:
גן יעד פריימר קדימה פריימר הפוכה
אלפא-טובולין TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA כמוסות מגנט
18S rRNA מיכל הכהן מיכל בע
Rab19 CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC מ, מיכאל
פפטיד מין המנון באגה מדריך כללי
ולכת למס א CTCATCTGCGTCTTCGCGTG מדריך כמוסות ומטגנים

שולחן 1: סדרת התחל

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות לדיסוציאציה של תא מרקמת דרוזוהילה כמו דיסקים מתוארים כמתואר כבר23. הניסיונות שלנו פשוט להשתמש בהליכים אלה על בלוטות האביזר נכשלו, מעודדים אותנו לפתח את הפרוטוקול החדש. העיכול הפרוטאז והטריטורציה המכנית היו צעדים קריטיים שאנחנו בצרות ירו להצלחת ההליך, ואנו מניחים הערות רבות בסעיפים 2 כדי 5 כדי לסייע בניסויים כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. כדי שהדיסוציאציה תצליח, הפטיות חייבות להגיע לתאי בלוטת האביזרים, אשר מוגנים על ידי הנוזל הזרע הצמיגי של לומן ואת שכבת השריר סביב בלוטת. מנתח את החלק המרוחק של בלוטות היה כך קריטי (שלב 3.6). כמו כן, עיכול עבור 60 דקות לפחות עם טלטול נמרץ (שלב 4.1) היה הכרחי. דיסוציאציה עדינה עם טריפסין תמיסה (לדוגמה, טרילדל) שימר את שלמות הבלוטה ואת יכולת הקיום של התא עד לדיסוציאציה המכנית. התוספת של פפאין או הקולגן בתוך שיוך פתרון טריפסין שיפור את הדיסוציאציה (דיסוציאציה מושלמת הושגה עם פחות ליטוף, וכתוצאה מכך הישרדות תא טוב יותר). עם זאת, אף אחת מהאנזימים הללו לא הספיקה לנתק את התאים בעצמם. ליטוף באמצעות עצות צרות מעוגלות שנוצרו בחלק 2.2.2 הוא צעד מפתח עבור שיטה זו. מכאן, זה נשחקו (שלבים 5.2-5.3) צריך להיות ממוטב בניסויים בקנה מידה קטן כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של טיפים (ראה הערה בשלב 5.3).

באמצעות פרוטוקול זה, אחד יוכל לבודד 500 כדי 800 תאים משניים לחיות מתוך 40 זכרים. פעולה זו מייצגת את ~ 20% (± 5%) התאוששות בהתחשב 3,200 SC כחומר ההתחלתי (40 גברים x 80 SC). 20% יעילות היתה גבוהה מספיק עבור רצפי RNA מאז אנחנו יכולים לעבד דגימות מרובות ביום. עם זאת, הדבר עשוי להשתפר במספר שיטות כולל: עבודה בקבוצות גדולות יותר; ביצוע משולש בצינור העיכול ודילוג על שלב 5.4 כדי להפחית העברות; triturating מאוד בעדינות (כמה תאים GFP הנתק למות זמן קצר לאחר שלב 5.3); קיצור התקופה בין הדיסוציאציה לבין ה-FACS; הפחתת זמן העיכול באמצעות פתרון טריפסין בריכוז גבוה יותר; שימוש בפרמטרים מחמירים פחות עבור הבחירה (step 6.2.3) ומיון שבוטלו. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא שאורכת מספר שעות כדי לבודד את התאים; ולכן הוא לא מתאים לחקור מאוד ארעי ביטוי גנים שינויים. עם פרוטוקול זה, 4 x 20 זכרים ניתן לעבד על ידי אדם בודד (עם הכשרה) בבוקר אחד, המאפשר חילוץ RNA מ-SC של שני מצבים שונים ביום 1 (איור 1). בעיקר, ניסויים נוספים יכולים להשתתף באוסף בלוטות אביזר (שלבים 3.1-3.3) על מנת לעבד דגימות מרובות באותו יום. עם זאת, צעדים 3.4 ואילך מעדיפים להתבצע על ידי אותו אדם כדי למקסם את האפשרות להיות מרוצה.

תאים משניים לבצע פונקציות חיוניות עבור פוריות הזכר12,20,24, אבל את התמונה המלאה של הגנים הם מביעים להגשים תפקיד זה עדיין חסר. כאן, אנו מתארים כיצד להשיג את ההמרה של תאים אלה ממספר קטן יחסית של זבובים, המאפשר השוואה של ביטוי גנים ב-SC בתנאים שונים. כאן, מוטציה אחת המשפיעה על הפונקציה SC ומורפולוגיה שימש, ושינויים חשובים הטרנססקריפט שלה גלויים. שיטה זו עשויה לסייע בזיהוי הגנים החדשים של SC הנחוצים לתפקידם. לידיעתך, השיטה החלופית היחידה להשגת SC הטרנססקריפט בוצעה במעבדה שלנו על ידי איסוף ידני של ה scs. איכות טובה רצפי RNA נתונים הושגה, אבל ההליך היה יותר מדי עבודה אינטנסיבית להתבצע בתנאים מרובים. אנו נשווה את הנתונים שלנו SC RNAseq מגדיר ולנתח את המשמעות הביולוגית שלהם על SC ביולוגיה בנייר נפרד (כהכנה).

בעתיד, טכניקה זו לא רק לשפוך אור על פראי סוג SC הטרנס, אבל גם לאפשר ללמוד את ההשפעה של סביבה או שינוי גנים על תאים בלוטת אביזר הטרנס. SC מספר, מורפולוגיה והתוכן הריק הוכחו תלוי בתזונה גברית, סטטוס ההזדווגות וגיל21,25,26. עדיין יש לנו הבנה מוגבלת של מסלולים גנטיים מעורבים והשוואת SC הטרנססקריפט בתנאים שונים יהיה תובנה. פרוטוקול זה מהיר ופשוט יחסית יאפשר לימודים כאלה. חשוב מכך, שיטה זו מאפשרת בידוד התאים העיקריים מאותם אנשים, ולכן יכול לשמש כפי שהוא כדי לקבוע אם הפרמטרים הגנטיים והסביבתיים משפיעים על שני סוגי התאים בלוטת העזר בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין כל חשיפה.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לחברי מעבדת Karch, לplateform הגנומיקה הiGE3, למתקן הליבה של המרכז האוניברסיטאי של ז'נבה, ולדר ' ז'אן-פייר אוברי-לבאיי שקבע את הפרוטוקול ל-FACS. אנו מודים ללוקה Stickley על עזרתו באמצעות להמחיש את הקריאות ב IGV. אנו מודים לעצמנו על הרשאה עדינה לשימוש חוזר בדמויות, והעורכים המבקשת מאיתנו להיות יצירתיים בכתיבה.

מחקר זה מומן על ידי מדינת ז'נבה (CI, RKM, FK), הקרן הלאומית השוויצרית למחקר (www.snf.ch) (FK ו RKM) ותרומות של קרן Claraz (FK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μL graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).

Tags

גנטיקה סוגיה 151 FACS תא דיסוציאציה סוג תא RNA ספציפי רצפי RNA שעתוק תאים משניים בלוטת אביזר Drosophila ילה רבייה לאחר תגובת ההזדווגות התאים העיקריים
פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של <em>דרוזוהילה</em> בלוטות אביזר זכר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. … More

Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (151), e60218, doi:10.3791/60218 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter