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Genetics

Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/60218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour dissocier et trier une population cellulaire spécifique des glandes accessoires mâles de Drosophila (cellules secondaires) pour le séquençage d'ARN et RT-qPCR. L'isolement cellulaire est accompli par la purification FACS des cellules secondaires GFP-exprimant après un processus multiétape-dissociation exigeant la dissection, la digestion de protéases et la dispersion mécanique.

Abstract

Pour comprendre la fonction d'un organe, il est souvent utile de comprendre le rôle de ses populations cellulaires constituantes. Malheureusement, la rareté des populations cellulaires individuelles rend souvent difficile l'obtention de suffisamment de matériel pour les études moléculaires. Par exemple, la glande accessoire du système reproducteur mâle Drosophila contient deux types distincts de cellules sécrétrices. Les cellules principales représentent 96% des cellules sécrétrices de la glande, tandis que les cellules secondaires (SC) constituent les 4% restants des cellules (environ 80 cellules par mâle). Bien que les deux types de cellules produisent des composants importants du liquide séminal, seuls quelques gènes sont connus pour être spécifiques aux SCs. La rareté des SC a, jusqu'ici, entravé l'étude transcriptomic d'analyse de ce type important de cellules. Ici, une méthode est présentée qui permet la purification des SC pour l'extraction et le séquençage de l'ARN. Le protocole consiste d'abord à disséquer les glandes de mouches exprimant un journaliste SC-spécifique GFP, puis soumettre ces glandes à la digestion de la protéase et la dissociation mécanique pour obtenir des cellules individuelles. Après ces étapes, les cellules individuelles, vivantes, marquées gFP sont triées à l'aide d'un trieur de cellules activés fluorescentes (FACS) pour la purification de l'ARN. Cette procédure donne des ARN spécifiques à SC à partir de 40 mâles par condition pour le séquençage EN aval de RT-qPCR et/ou d'ARN au cours d'une journée. La rapidité et la simplicité de la procédure permet de déterminer les transcriptomes de nombreuses mouches différentes, de différents génotypes ou conditions environnementales, dans un court laps de temps.

Introduction

Les organes sont constitués de plusieurs types de cellules, chacun e avec des fonctions discrètes et exprimant parfois des ensembles très différents de gènes. Pour obtenir une compréhension précise du fonctionnement d'un organe, il est souvent essentiel d'étudier chaque type de cellule distinct qui constitue cet organe. L'une des principales méthodes utilisées pour explorer la fonction possible est l'analyse de transcriptome. Cette méthode puissante fournit un instantané de l'expression du gène dans une cellule, pour révéler les processus actifs et les voies. Cependant, ce type d'analyse est souvent difficile pour les populations de cellules rares qui doivent être purifiées à partir de cellules voisines beaucoup plus abondantes. Par exemple, la glande accessoire mâle Drosophila est un organe composé principalement de deux types de cellules sécrétrices. Comme le plus rare des deux types de cellules ne comprend que 4% des cellules de cette glande, l'utilisation d'une analyse de transcriptome spécifique de type cellulaire n'avait pas été utilisée pour aider à déterminer la fonction de ces cellules.

Les glandes accessoires (AG) sont des organes de l'appareil reproducteur masculin chez les insectes. Ils sont responsables de la production de la plupart des protéines du liquide séminal (protéines de liquide séminal (SFP) et protéines accessoires de glande (ACPs)). Certains de ces SFP sont connus pour induire les réponses physiologiques et comportementales chez les femelles accouplées, communément appelée la réponse post-accouplement (PMR). Parmi les RPM, mentionnons : une augmentation du taux d'ovulation et de ponte, le stockage et la libération de spermatozoïdes, un changement de l'alimentation des femmes et une diminution de la réceptivité des femmes aux mâles qui courtisent secondairement1,2. Comme les insectes ont un impact sur de nombreux problèmes sociétaux majeurs, de la santé humaine (vecteurs de maladies mortelles) à l'agriculture (les insectes peuvent être des ravageurs, mais sont essentiels à la pollinisation et à la qualité du sol), la compréhension de la reproduction des insectes est un domaine de recherche important. L'étude des AG et des ACP a été avancée de manière significative avec l'organisme modèle Drosophila melanogaster. Ces études ont mis en évidence le rôle des AG et certaines des protéines individuelles qu'ils produisent dans la création de la PMR, impactant le travail dans d'autres espèces comme le vecteur de la maladie Aedes aegypti3,4, et d'autres insectes1 ,5. En outre, comme les AG sécrètent les constituants du fluide séminal1,6 ils sont souvent considérés comme l'analogue fonctionnel de la prostate des mammifères et la vésicule séminale. Cette similitude de fonction combinée avec des similitudes moléculaires entre les deux tissus-types, ont fait les AGs un modèle pour la prostate chez les mouches7.

Chez le mâle Drosophila, il y a deux lobes de glandes accessoires. Chaque lobe peut être considéré comme une structure en forme de sac composée d'une monocouche de cellules sécrétrices entourant un lumen central, et enveloppée par des muscles lisses. Comme mentionné ci-dessus, il existe deux types de cellules sécrétrices morphologiquement, développementale et fonctionnellement distinctes qui composent cette glande : les cellules principales en forme de polygonale (qui représentent environ 96 % des cellules) et les cellules secondaires plus grandes et rondes (SC) (qui composent le 4 % restants des cellules, soit environ 40 cellules par lobe). Il a été démontré que les deux types de cellules produisent des ensembles distincts d'ACP pour induire et maintenir le PMR. La plupart des données obtenues à ce jour mettent en évidence le rôle d'une seule protéine dans le déclenchement de la plupart des comportements caractéristiques de la PMR. Cette protéine, le peptide sexuel, est un petit peptide d'acide aminé de 36 qui est sécrété par les cellules principales8,9,10. Bien que le peptide sexuel semble jouer un rôle majeur dans le PMR, d'autres ACP, produits par les cellules principales et secondaires, ont également été montrés pour affecter divers aspects de la PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Par exemple, d'après nos connaissances actuelles, les SC, par l'intermédiaire des protéines qu'ils produisent, semblent être nécessaires pour la perpétuation de la signalisation SP après le premier jour18.

Étant donné la rareté des SC (seulement 80 cellules par mâle), toutes nos connaissances sur ces cellules et les protéines qu'ils produisent proviennent de la génétique et des approches candidates. Jusqu'à présent, seule une liste relativement petite de gènes s'est avérée spécifique à SC. Cette liste comprend la protéine homéodomaine defectiveré proventriculus (Dve)19, l'ARNlM MSA20, Rab6, 7, 11 et 1921, CG1656 et CG1757511, 15,21 et le facteur de transcription homéobox Abdominal-B (Abd-B)18. Précédemment, nous avons montré qu'un mutant déficient pour l'expression d'Abd-B et de l'ARNlAR MSA dans les cellules secondaires(iab-6cocuD1 mutant) raccourcit la durée de la PMR de 10 jours à un seul jour12 , 18 ans, états-unis qui , 20. Ce phénotype semble être causé par le stockage incorrect de SP dans l'appareil reproducteur féminin12,18,20. Au niveau cellulaire, les cellules secondaires de ce mutant montrent une morphologie anormale, perdant leurs structures caractéristiques de type vacuole18,20,21. En utilisant cette ligne mutante, nous avons précédemment essayé d'identifier les gènes impliqués dans la fonction SC en comparant les profils transcriptionnels des AG entiers de type sauvage ou de glandes accessoires mutantes12. En outre, d'autres laboratoires ont montré que le nombre de SC, la morphologie et la teneur en vacuolateur dépendent de l'alimentation masculine, le statut d'accouplement et l'âge21,25,26.

Bien que des progrès positifs aient été réalisés à l'aide de ces approches, un transcriptome complet de SC était loin d'être atteint. La rareté de ces cellules dans cet organe a rendu difficile de progresser plus loin, même à partir de cellules de type sauvage. Pour tester l'expression des gènes, les changements dans ces cellules après des stimuli environnementaux particuliers seraient encore plus difficiles. Ainsi, une méthode pour isoler et purifier l'ARN SC qui était assez rapide et simple pour fonctionner dans différents milieux génétiques et conditions environnementales était nécessaire.

Les gènes Abd-B et MSA nécessitent un exhausteur spécifique de 1,1 kb du complexe Bithorax Drosophila (appelé l'améliorateur D1) pour leur expression dans les SC1,20. Cet exhausteur a déjà été utilisé pour créer un pilote GAL4 qui, lorsqu'il est associé à un UAS-GFP, est capable de conduire l'expression GFP forte spécifiquement dans les SC. Ainsi, nous avons utilisé cette ligne comme base pour un protocole FACS pour isoler ces cellules de type sauvage et iab-6cocuD1 AGs). Comme les SC mutants iab-6cocuD1 présentent une morphologie cellulaire différente, nous montrons que ce protocole peut être utilisé pour isoler les cellules pour la détermination de leur transcriptome de ce type de cellule rare dans des conditions très différentes.

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Protocol

1. Lignes drosophila utilisées et collection d'hommes

  1. Pour ce protocole, utilisez des mâles exprimant le GFP dans les SC et non dans les cellules principales. Ici, un pilote AbdB-GAL4 (décrit en référence18), recombiné avec UAS-GFP (sur le chromosome 2) est utilisé. D'autres pilotes appropriés peuvent également être utilisés. Pour l'isolement des SC dans différentes conditions mutantes, traversez la mutation en lignes contenant la ligne GFP spécifique au SC.
  2. Recueillir deux lots d'environ 25 mâles vierges sains pour chaque génotype et les vieillir à 25 oC pendant 3-4 jours en flacons avec des aliments Drosophila fraîchement préparés.
    REMARQUE: À mesure que l'âge, l'état d'accouplement, la nutrition et l'environnement social affectent chacun la biologie de la reproduction, des protocoles stricts doivent être suivis pour contrôler ces paramètres. Les mâles vierges sont âgés de 3 à 4 jours après l'éclosion pupal à 25 oC avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h, sur la nourriture standard de farine de maïs-agar-levure, en groupes de 20-25 mâles par flacon.

2. Solutions et préparation des matériaux

  1. Préparer les solutions suivantes.
    1. Préparer le sérum moyen complété (SSM) : Le milieu de Drosophila de Schneider complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    2. Préparer les aliquots de l'enzyme 1x trypsine (p. ex., TrypLE Express Enzyme) et les conserver à température ambiante.
    3. Préparer les aliquots de papaïne [50 U/mL] (stockés à -20 oC et décongelés une seule fois).
    4. Préparer 1x tampon de phosphate salin (PBS, stocké à température ambiante).
  2. Préparer plusieurs pointes de pipet arrondies par les flammes pour la dissociation physique des glandes accessoires.
    REMARQUE :     Utilisez des conseils de faible rétention pour manipuler les glandes accessoires, car elles ont tendance à adhérer au plastique non traité. Le processus d'arrondi des flammes réduit l'ouverture de la pointe et lisse les bords de la pointe. Cela assure une dissociation efficace après la digestion peptidase sans tonte des membranes cellulaires.
    1. Couper une pointe de 200 l avec une lame pointue et la passer doucement sur une flamme pour arrondir sa pointe de sorte que l'ouverture soit plus large mais lisse pour la manipulation pendant l'étape 3.7.
    2. Réduisez l'ouverture de plusieurs bouts de 1 000 l en passant la pointe s'ouvrant près d'une flamme pendant moins d'une seconde. Faites pivoter légèrement la pointe pour éviter la surfusion ou l'engorgement. Trier les bouts faits de plus étroit à plus large. Cela peut être fait en chronométrant la vitesse de l'aspiration. Essayez de dissocier un échantillon à petite échelle d'AG pour tester l'efficacité des pointes les plus étroites.
      REMARQUE: Ces pointes sont essentielles à l'agitation mécanique (étapes 5.2 et 5.3). Des pointes de pipet de qualité arrondies par les flammes permettent une dissociation complète tout en préservant la viabilité des cellules. En tant que tel, ces pointes sont lavées à fond avec de l'eau à la fin de la procédure de réutilisation. Cela permet une dissociation reproductible au jour le jour.

3. Dissection des glands accessoires

  1. Mettre 20 à 25 Drosophila mâles dans un plat en verre sur la glace.
  2. Disséquer 1 mâle dans SSM. Enlevez son appareil reproducteur et effacez la paire accessoire de glande de tous les autres tissus en dehors du conduit éjaculatoire.
    REMARQUE: Enlever les testicules parce que le sperme libéré peut créer des amas et perturber le processus de dissociation. Retirez l'ampoule éjaculatoire, ce qui rend la manipulation difficile lorsqu'elle flotte.
  3. Avec les forceps, transférer les glandes accessoires sur une plaque de verre remplie de SSM à température ambiante. Répétez les étapes 3.2-3.3 20 fois pour obtenir un lot de 20 paires de glandes dans SSM.
    REMARQUE: Ces étapes seront réalisées en 15 à 20 min. Les AG devraient avoir l'air en bonne santé, et les mouvements péristaltiques de la couche musculaire autour des glandes devraient être visibles. Le GFP peut être surveillé à l'aide d'un microscope fluorescent.
  4. Transférer les glandes accessoires à 1x PBS pour un lavage de 1-2 min à température ambiante.
    REMARQUE: Pour une meilleure dissociation, il est impératif de rincer les glandes avec PBS. La durée de cette étape, cependant, devrait être limitée car les cellules montrent des signes de stress dans PBS ; cellules secondaires dissociées dans PBS rapidement gonfler et mourir.
  5. Diluer 20 'L papain [50 U/mL] en 180 'L d'enzyme 1x trypsine pour obtenir la solution de dissociation (pour monter ou descendre garder 9 'L d'enzyme de trypsine et 1 'L de papaïne pour chaque mâle). Avec des forceps, transférer les glandes accessoires à cette solution.
  6. Isoler la pointe des glandes accessoires (contenant des cellules secondaires) de la partie proximale. Utilisez des pincements fins pour pincer fermement le milieu d'un lobe glandulaire et couper avec la pointe pointue d'un deuxième forceps. Enlever la partie proximale des glandes accessoires et le conduit éjaculatoire pour améliorer la dissociation et réduire le temps de tri cellulaire.
    REMARQUE: La disséquer la partie distale de 20 paires de glandes prendra 15 à 20 min et la digestion par des peptidases commencera ainsi à température ambiante.
  7. Après que toutes les extrémités de glande aient été disséquées, les transférer dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pointe spéciale de 200 l de pipet préparée à l'étape 2.2.1. Il doit être large, arrondi et humide avant de manipuler les glandes.
    REMARQUE: Pour pipet tissu de glande accessoire, les pointes doivent toujours être pré-humide avec la solution appropriée (enzyme de trypsine ou SSM, garder un tube de chacun à cet effet). Rincer soigneusement les pointes entre les échantillons pour éviter la contamination.

4. Digestion des tissus

  1. Placer le microtube dans un shaker de 37 oC pendant 60 min, en se balançant à 1 000 tr/min.
    REMARQUE: L'agitation et le temps de digestion sont essentiels pour une dissociation réussie. Une digestion plus courte ou immobile donnera une mauvaise dissociation, probablement parce que la couche musculaire externe et le liquide séminal visqueuse intérieur protègent les cellules accessoires de la glande contre les peptidases.
  2. Ajouter 1 ml de SSM à température ambiante pour arrêter la digestion et procéder immédiatement à l'étape 5.

5. Dissociation mécanique des cellules

  1. À l'aide d'une large pointe arrondie de 1 000 l, préhumide avec le SSM, transférer l'échantillon dans une plaque de 24 puits. Surveillez la fluorescence du GFP sous le microscope : la plupart des extrémités des glandes devraient sembler intactes et quelques SC devraient être détachés.
  2. À l'aide d'une pointe arrondie et étroite générée à l'étape 2.2.2, le tuyau et le tuyau de 3 à 5 fois pour perturber le tissu de glande accessoire.
    REMARQUE: Surveillez la fluorescence pour vous assurer que les gros trafiques de tissus ont été brisés. Répétez l'étape 5.2 si ce n'est pas le cas.
  3. À l'aide d'une pointe de pipet arrondie très étroite (générée à l'étape 2.2.2), la tuyauterie monte et descend 1-2 fois.
    REMARQUE: Seules les cellules individuelles doivent être visibles après l'étape 5.3. L'utilisation de plaques de 24 puits est recommandée parce qu'elles permettent une surveillance facile du processus. Lorsque quelques échantillons ont été traités et ont donné un résultat satisfaisant (cellules secondaires à la recherche saine parfaitement dissocié), les étapes de pipetage seront effectuées dans le microtube.
  4. Attendez au moins 15 min pour laisser les cellules se déposer au fond du puits et enlever l'excès de SSM pour réduire le temps de tri.
    REMARQUE: Laisser les cellules s'installer s'est avéré supérieur à d'autres méthodes comme la centrifugation, et permet une dernière inspection visuelle des cellules juste avant LE CAS.
  5. Pipet les cellules dans un tube propre 1,5 ml et la piscine des échantillons identiques (deux lots de 20 mâles pour chaque condition). Rincer les puits avec SSM pour récupérer les dernières cellules, et les épilerons dans le tube (utiliser un petit volume).
  6. Dans 1,5 ml de microtubes, ajouter 300 l de solution de lysis cellulaire et 1 l de Proteinase K [50 g/L] (solutions fournies dans le kit de purification de l'ARN, voir étape 7). Préparer deux tubes pour chaque échantillon (un pour les MC et un pour les SC).

6. FACS (Tri cellulaire activé par fluorescence)

  1. Ajouter un marqueur de viabilité à chaque échantillon à trier quelques minutes avant le tri (0,3 mM Draq7).
    MISE EN GARDE: Draq7 doit être traité avec prudence.
  2. Trier une population homogène de cellules secondaires vivantes (cellules gFP-positives, Draq7-négatives). Dans un autre microtube, trier une population de cellules principales (plus petites, GFP-négatives, Draq7-négatives cellules). Utilisez la stratégie de gating FACS suivante :
    REMARQUE :     Réglez la pression du trieur cellulaire à 25 PSI et passez les cellules à travers une buse de 100 m. Le taux de tri est d'environ 2 000 cellules/s.
    1. Exclure les débris et sélectionner les cellules totales en fonction du FSC-SSC (figure 2E) afin d'exclure les débris.
    2. Exclure les cellules mortes. Excitez Draq7 avec un laser de 640 nm et collectez la fluorescence émise avec un filtre à bande 795/70. Gate Draq7-positifs cellules(Figure 2F).
    3. Supprimer les doublettes à l'aide d'un double gating sur SSC-H vs SSC-W et FSC-A vs FSC-H (Figure 2H).
      REMARQUE: Exclure rigoureusement les doublets cellulaires à l'aide d'un double gating, afin de réduire la contamination des cellules principales.
    4. Trier les cellules positives de 550 GFP dans un microtube de 1,5 ml avec le tampon Lysis et la protéase K. Cette population est considérée comme des cellules secondaires (SC, figure 2G). Excitez GFP à 488 nm et collectez la fluorescence émise avec un filtre 526/52 bande-pass.
    5. Trier 1 000 cellules GFP-négatives, homogènes et de petite taille, dans un microtube de 1,5 ml avec tampon Lysis et Proteinase K. Cette population est considérée comme des cellules principales (MC, figure 2G).
    6. Vortex tous les échantillons.
      REMARQUE: De 40 mâles (40 x 80 SC et 3 200 cellules secondaires), 600 à 800 cellules secondaires vivantes de singlet sont obtenues (environ 20-25% de récupération). Arrêtez de trier environ 550 SC et 1 000 MC pour normaliser les échantillons.

7. Extraction d'ARN

REMARQUE: Nous avons utilisé Epicentre MasterPure ARN Purification Kit pour l'extraction de l'ARN, avec les adaptations suivantes. D'autres kits peuvent être utilisés tant que le rendement est assez élevé pour préparer une bibliothèque pour le séquençage à partir de 500 cellules (2 ng ARN a été utilisé ici).

  1. Chauffer les échantillons à 65 oC pendant 15 min et le vortex toutes les 5 minutes pour compléter la lyse cellulaire.
  2. Placer des échantillons sur la glace pendant 5 min. Suivez les recommandations du fabricant concernant les précipitations d'acides nucléiques (parties « Précipitations d'acides nucléiques totaux » et « Élimination de l'ADN contaminant des préparations totales d'acide nucléique »).
  3. Suspendre le granule d'ARN dans 10 l de tampon TE sans RNase.
  4. Ajouter l'inhibiteur de la RNase (facultatif).
  5. Entreposer les échantillons à -80 oC.

8. Contrôle de la qualité de la quantité, de la qualité et de la spécificité de l'ARN

  1. Estimer la qualité et la concentration de l'ARN. En raison du petit volume et de la concentration, utilisez l'ARN 6000 pico chips ici. L'ARN de bonne qualité est défini comme non dégradé, visible comme une ligne de base faible avec des pics aigus correspondant aux ARR.
  2. RT-qPCR pour contrôler l'identité des cellules triées
    1. Effectuer la transcription inverse avec 2 ng de ARN totaux en utilisant des hexamers aléatoires comme amorces. Effectuer la RT sur l'ARN cellulaire secondaire et l'ARN des cellules principales.
      REMARQUE : Les CDNA peuvent être dilués, aliquoted, et conservés congelés pour une utilisation ultérieure.
    2. Effectuer en temps réel quantitative PCR en utilisant des paires d'apprêt appropriés pour quantifier les gènes d'entretien ménager (alpha-Tubulin, 18S rRNA), gènes spécifiques à des cellules secondaires (MSA, Rab19, Abd-B) et gène spécifique à la cellule principale (Peptide sexe).

9. Séquençage (préparation de la bibliothèque de l'ADNc, séquençage et analyse des données)

  1. Utilisez 2 ng d'ARN totaux pour synthétiser les CDNA avec des amorces polydT. Utilisez la technologie SMARTer pour les amplifier pour l'amplification.
  2. Utilisez un kit Nextera XT pour préparer la bibliothèque.
  3. Séquence utilisant multiplexé, 100 nucléotides simples lit le séquençage (même si 50 nucléotides lit sont appropriés pour la plupart des fins) pour produire environ 30 millions de lectures pour chaque échantillon.

10. Analyse des données

  1. Exécuter FastQC.
  2. Utilisez l'aligneur STAR pour cartographier les lectures sur le génome de référence Drosophila d'UCSC dm6 et générer des fichiers .bam. Utilisez Integrative Genomics Viewer (IGV) pour visualiser les lectures sur le navigateur du génome.
  3. Utilisez HTSeq pour effectuer des comptages génétiques.
  4. Utilisez la méthode Trimmed Mean of M-values (TMM) pour normaliser le nombre de gènes22. Utilisez edgeR pour effectuer une analyse statistique de l'expression différentielle, des parcelles MA et de l'APC.
  5. Pour l'analyse de l'expression génique et les statistiques, utilisez le modèle linéaire général, le test F de quasi-probabilité avec le taux de détection des fausses (FDR) et la correction de Benjamini et Hochberg (BH).

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Representative Results

Le protocole présenté ici permet à un expérimentateur d'isoler les cellules secondaires des glandes accessoires mâles Drosophila et d'extraire leur ARN au cours d'une seule journée (Figure 1).

Nous utilisons la construction Abd-B-GAL4 18 pour étiqueter les cellules secondaires (SC) mais pas les cellules principales (MC) avec GFP (Figure 2A). L'un des objectifs de cette procédure est d'obtenir le transcriptome de type sauvage des SC (type sauvage est écrit avec des virgules inversées puisqu'elles sont obtenues à partir de mouches transgéniques exprimant gFP et GAL4). Un autre objectif est d'obtenir l'ARN SC par une procédure rapide et facile qui permet d'étudier leur expression génique dans différentes conditions. Ainsi, nous avons effectué cette procédure en utilisant le type sauvage et "iab-6cocuD1" mutants qui portent une suppression de 1,1 kb enlevant l'exhausteur d'Abd-B responsable de l'expression SC. Cette suppression supprime également le promoteur de mSA, une transcription importante pour le développement des cellules secondaires, la morphologie et la fonction18,20 (Figure 2B,C). Ce protocole a été répété trois fois avec 2 génotypes à chaque fois pour obtenir des triplicates biologiques (ci-après désigné sous le nom wT-1,-2,-3 pour le type sauvage et D1-1,-2 et -3 pour l'iab-6cocuD1).

Ce protocole permet la dissociation MC et SC des glandes accessoires Drosophila en quelques heures (Figure 2D). Les deux populations cellulaires sont ensuite triées en deux tubes différents pour isoler les MC et les SC. La stratégie de gating pour FACS est montré dans la figure 2E-2G. Draq7 permet d'estimer la viabilité cellulaire autour de 70 % pour l'ensemble de l'échantillon(figure 2F). Les singlets représentent plus de 90 % de la population de SC, et plus de 80 % de la population MC, selon les estimations de FSC-A vs FSC-H et SSC-H vs SSC-W. (voir Figure 2H). Cela reflète une dissociation efficace. Environ 10 % des événements de tri ont été interrompus parce qu'une autre cellule ou débris était présent dans la même gouttelette FACS. À partir de 40 mâles, nous recueillons généralement 550 SC et 1 000 MC, puis interrompons le tri. À partir d'un échantillon (sur 6), nous n'avons pas pu atteindre 550 cellules secondaires. L'échantillon WT-1 a donc été obtenu à partir de seulement 427 SC, mais a fourni un ARN de qualité et de quantité similaires à d'autres.

Les cellules sont triées en tampon de lyse (contenant de la protéase K). Dès que tous les échantillons sont prêts, les ARN sont extraits de chaque échantillon de cellules afin d'avoir des granulés d'ARN à la fin de la journée. La qualité et la quantité d'ARN sont estimées à l'aide d'un bioanalyseur doté d'une puce appropriée pour faire face à de faibles concentrations et à de faibles volumes. Étant donné que les concentrations estimées étaient variables entre les échantillons (allant de plus de 1 300 pg/L à 344 pg/L, voir Figure 3A),nous avons ajusté le matériau de départ pour la synthèse de la bibliothèque RT-qPCR et cDNA à environ 2 ng (mesuré les concentrations ne sont pas très précises). Nous avons quantifié l'expression de gènes spécifiques en temps réel qPCR sur les extraits sauvages de type MC et SC pour contrôler l'identité des populations cellulaires que nous avons triées. Figure 3 B montre l'expression des gènes comme des quantifications relatives normalisées à l'expression alpha-tubulin. Des gènes d'entretien ménager comme l'ARNr 18S et l'alpha-tubulin sont détectés dans tous les échantillons, comme prévu. Bien au contraire, le gène SC Rab19 n'est détecté que par des extraits de SC, et le gène MC Sex Peptide n'est détecté que par MC. Nous notons que l'expression de Rab19 dans iab-6cocuD1 mutant SC est faible par rapport au type sauvage SC, suggérant que l'expression de ce gène est affectée par la perte d'Abd-B et MSA (constamment, le grand Les vacuoles étiquetés Rab19 sont perdus dans le mutant iab-6cocuD1 21). La transcription cellulaire secondaire spécifique MSA est détecté uniquement à partir de type sauvage SC et non de MC, ni de iab-6cocuD1 SCs, qui était prévu depuis promoteur MSA est supprimé dans ce mutant. Dans l'ensemble, les CQ présentés à la figure 3 démontrent que les ARN obtenus grâce à ce protocole ne sont pas dégradés et que les deux populations cellulaires (SC et MC) sont triées avec succès à partir de glandes accessoires, dans des conditions de type sauvage et de mutant. Seuls les ARN des cellules secondaires ont été séquencés ici, mais notez que cette procédure permet le profilage transcriptome concomitant des SC et des MCs.

Le séquençage de l'ARN a été réalisé à l'aide de procédures standard. Ici, nous ne discuterons que des analyses de contrôle de la qualité qui sont pertinentes aux fins de cette méthode. Lorsque des séquences sont obtenues, les lectures sont cartographiées au génome de référence Derosophila, attribuée aux gènes, et normalisées. L'APC (Analyse principale des composants) a été effectuée sur les 6 échantillons (3 types sauvages et 3 répliques de cocuD1 iab-6). La plus grande partie possible de la variabilité des données est comptabilisée dans PC1, et une grande partie de la variabilité restante est comptabilisée dans PC2. Comme le montre la figure 4A, le type sauvage reproduit les grappes rapprochées, et loin des échantillons de cocuD1 Iab-6. Cela montre que les échantillons de WT sont plus semblables les uns aux autres que ceux des mutants. Ceci illustre la reproductibilité de méthode et sa capacité à détecter le programme génétique anormal des cellules secondaires mutantes. Bien que les échantillons D1-2 et D1-3 se regroupent, nous notons que l'échantillon D1-1 est assez divergent. Étant donné que tous les QC pour cette réplique sont bons et comparables à toutes les autres répliques, nous pouvons exclure un problème de préparation d'échantillons (29 millions de lectures au total, dont 76 % s'alignent uniquement sur le génome de référence. Parmi ceux-ci, 'gt;77% sont attribués à un gène, 'gt;90% sont des ARNm, et 'lt;3% sont rRNA). Cette divergence pourrait refléter que l'expression génique en SC est instable dans lecocuDiab-6, bien que l'essai de cette hypothèse nécessiterait plus de répliques.

La visualisation des lectures alignées sur des gènes particuliers sur le génome permet une estimation visuelle de la qualité des données. La figure 4 montre une sélection de gènes, avec des lectures de 1 représentatif pour chaque génotype. Sans surprise, les gènes d'entretien ménager tels que Act5C sont exprimés dans les deux génotypes (figure 4B), ainsi que les gènes spécifiques au SC Rab19 et Dve (Figure 4C,D). L'absence de lectures introniques confirme que polydT a amorcé sélectivement la transcription inverse des ARNm épissés matures pour la préparation de la bibliothèque d'ADNc. Notamment, nous pouvons voir des variations importantes et significatives dans l'expression de gènes spécifiques entre le type sauvage et iab-6cocuD1 SC. Ceci est illustré dans la figure 4E par le gène MSA dont l'expression forte dans le type sauvage est perdue dans iab-6cocuD1. MSA est présenté comme une preuve de principe que cette méthode permet d'identifier les gènes qui sont mal réglementés dans des conditions mutantes. Cela aidera à comprendre les phénotypes observés dans ce mutant, et pourrait donner de nouvelles perspectives dans les fonctions normales des cellules secondaires.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu du protocole. Les étapes clés du protocole sont affichées, avec la chronologie sur le côté droit. Cette procédure permet de commencer par la drosophile vivante le matin d'avoir dissocié les cellules de glandes accessoires à midi, de les trier en fonction de l'expression GFP, et d'obtenir leurs ARN extraits à la fin de la journée de travail. Le séquençage de l'ARN et l'analyse des données prennent généralement quelques semaines. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Isoler et trier les cellules secondaires exprimant le GFP. (A) Image confocale de la glande accessoire Abd-B:GAL4 UAS-GFP exprimant le GFP dans les cellules secondaires (SC), mais pas dans les cellules principales (MC). Les noyaux sont tachés de DAPI (bleu). La ligne blanche pointillée délimite les lobes AG. ED est conduit éjaculatoire. Les barres blanches dans le coin supérieur gauche sont des échelles de 50 m. (B,C) Vues agrandies de la partie distale de glande accessoire avec SC exprimant GFP, dans le type sauvage (B) et iab-6cocuD1 (C) fond. (D) Cellules dissociées à faible grossissement sous la jumelle GFP. (E-H) FACS stratégie de gating pour purifier SC et MC. Points rouges sur tous les panneaux indiqués SCs tels que définis dans le panneau (G). D'abord, les débris sont exclus (E, étape 6.2.1) ainsi que les cellules mortes positives Draq-7 (F, étape 6.2.2). Les cellules positives de GFP sont sélectionnées (SC) aussi bien qu'une population homogène des cellules négatives de GFP (MC)(G,étapes 6.2.4 et 6.2.5). Les doublets sont exclus de la population MC et SC (étape 6.2.3, seule la sSC-H vs SSC-W gating pour SC est montrée sur 2H à titre d'exemple). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : QC sur les ARN : qualité, quantité et spécificité du type cellulaire. (A) Contrôle de la qualité de l'ARN et de l'estimation de la concentration sur PicoChip. Le pic de 25 nt est le contrôle de la quantification. Une faible ligne de base indique une faible dégradation et les 2 principaux sommets sont les ARN ribosomal. Les 3 échantillons utilisés pour rt-qPCR sont montrés, leur qualité est représentative de tous les échantillons d'ARN utilisés dans cette étude, et leurs concentrations estimées reflètent la variation de l'ARN total que nous avons obtenu entre les échantillons. (B) RT-qPCR démontrent la spécificité du tri des cellules secondaires (SC) et des cellules principales (MC). La quantification de l'expression génique se fait à l'aide de la formule q-2(40-Cq). Chaque triplicate de chaque gène dans chaque condition est normalisé à la quantité moyenne de l'ARN alpha-Tubulin pour compenser la variation totale de l'ARN. Les barres d'erreur montrent l'écart standard. WT signifie type sauvage et D1 se réfère à l'iab-6cocuD1 mutant. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : QC sur les données de séquençage de l'ARN. (A) Analyse des composants principaux (APC) sur les ensembles de données de séquençage de l'ARN WT-1,-2,-3 (points bleus). (B-E) Le séquençage est cartographié sur le génome de référence de Drosophila à l'aide du logiciel IGV. Un seul échantillon représentatif de chaque génotype est montré pour des raisons de clarté (WT-1 et D1-2), et seulement quelques loci spécifiques sont montrés. Les noms de gènes sont écrits au-dessus de chaque panneau, et les symboles se réfèrent à leur orientation. Les nombres entre parenthèses représentent pour chaque piste l'échelle pour le nombre de lectures par paire de base d'ADN. Cette échelle est la même pour les deux conditions pour un gène donné, mais varie entre les gènes pour une meilleure visualisation. Les barres bleues au bas de chaque panneau montrent les introns des gènes (ligne mince), les exons (ligne large) et l'ORF (rectangles avec 'gt;). Notez que Rab19 et Arl5 se chevauchent, les gènes convergents (C). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence27. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Amorces utilisées pour RT-qPCR dans cette étude:
Gène cible Apprêt vers l'avant Apprêt inversé
alpha-Tubulin TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA CCAGCCTGACCAACATGGAT
18S rRNA CTGAGAAACGGCTACCACATC ACCAGACTTGCCCTCCAAT
Rab19 (en) CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC TTGGAAAAAGGAAGACCGCTTG TTG TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG TTTG TTGGAAAAAGG
Peptide sexe GGAATGGCCGTGGAATAGGA GGAATGG TAACATCTTCCACCCCAGGC
Msa CTCATCTGCGTCTTCGCGTG CAGCTCCGTTTGTAATCTTCCGagCGAGC

Tableau 1 : Séquence des amorces

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Discussion

Les méthodes de dissociation cellulaire du tissu Drosophila comme les disques imaginaires sont déjà décrites23. Nos tentatives d'utiliser simplement ces procédures sur les glandes accessoires ont échoué, nous encourageant à développer ce nouveau protocole. La digestion de la protéase et la trituration mécanique ont été des étapes critiques que nous avons dépannées pour le succès de la procédure, et nous avons donc placé de nombreuses notes dans les sections 2 à 5 pour aider les expérimentateurs à obtenir des résultats satisfaisants. Pour que la dissociation soit réussie, les peptidases doivent atteindre les cellules accessoires de glande, qui sont protégées par le fluide séminal visqueux dans le lumen et la couche de muscle autour de la glande. La dissection de la partie distale des glandes était donc critique (étape 3.6). En outre, digérer pendant 60 min au moins avec des secousses vigoureuses (étape 4.1) était nécessaire. La dissociation douce avec la solution de trypsine (par exemple, TrypLE) a préservé l'intégrité et la viabilité de cellules de glande jusqu'à la dissociation mécanique. L'addition de la papaïne ou de la collagène en association avec la solution de trypsine a amélioré la dissociation (la dissociation parfaite a été obtenue avec moins de pipetting, ayant pour résultat une meilleure survie de cellules). Cependant, aucune de ces enzymes n'était suffisante pour dissocier les cellules par elles-mêmes. Pipetting à l'aide de pointes arrondies étroites générées dans la partie 2.2.2 est une étape clé pour cette méthode. Par conséquent, cette trituration (étapes 5.2-5.3) devrait être optimisée dans les expériences à petite échelle pour choisir la meilleure combinaison de conseils (voir note à l'étape 5.3).

Grâce à ce protocole, on pourra isoler 500 à 800 cellules secondaires vivantes de 40 mâles. Cela représente 20 % (5 %) récupération considérant 3 200 SC comme matériau de départ (40 mâles x 80 SC). L'efficacité de 20% était assez élevée pour le séquençage d'ARN puisque nous pourrions traiter plusieurs échantillons dans une journée. Cependant, cela pourrait être amélioré par plusieurs méthodes, y compris: travailler dans de plus grands lots; faire la trituration dans le tube de digestion et sauter l'étape 5.4 pour réduire les transferts; triturating très doucement (certaines cellules GFPd dissociées meurent peu de temps après l'étape 5.3); raccourcir la période entre la dissociation et le FACS; diminuer le temps de digestion en utilisant la solution de trypsine à une concentration plus élevée; en utilisant des paramètres moins stricts pour la sélection des singlets (étape 6.2.3) et le tri avorté. Une limitation de ce protocole est qu'il faut plusieurs heures pour isoler les cellules; par conséquent, il n'est pas adapté pour étudier les changements d'expression génique très transitoire. Avec ce protocole, 4 x 20 mâles peuvent être traités par une seule personne (avec formation) en un matin, permettant l'extraction de l'ARN de SC de deux conditions différentes en 1 jour (Figure 1). Notamment, plus d'expérimentateurs peuvent participer à la collecte des glandes accessoires (étapes 3.1-3.3) afin de traiter plusieurs échantillons le même jour. Toutefois, les étapes 3.4 à partir seront préférentiellement effectuées par la même personne afin de maximiser la reproductibilité.

Les cellules secondaires remplissent des fonctions essentielles pour la fécondité masculine12,20,24, mais l'image complète des gènes qu'ils expriment pour remplir ce rôle est encore manquante. Ici, nous décrivons comment obtenir le transcriptome de ces cellules à partir d'un nombre relativement faible de mouches, permettant la comparaison de l'expression génique en SC dans différentes conditions. Ici, un mutant affectant la fonction et la morphologie de SC a été employé, et des changements importants dans son transcriptome sont visibles. Cette méthode pourrait donc aider à identifier de nouveaux gènes SC nécessaires à leur fonction. À notre connaissance, la seule méthode alternative pour obtenir le transcriptome de SC a été exécutée dans notre laboratoire par la cueillette manuelle des SCs. Des données de séquençage d'ARN de bonne qualité ont été obtenues, mais la procédure était trop laborieuse pour être exécutée dans de multiples conditions. Nous comparerons nos ensembles de données SC RNAseq et analyserons leur signification biologique au sujet de la biologie de SC dans un article distinct (en préparation).

À l'avenir, cette technique permettra non seulement de faire la lumière sur le transcriptome sC de type sauvage, mais aussi d'étudier l'impact de l'environnement ou de l'altération des gènes sur les cellules de glandes accessoires transcriptome. Le nombre de SC, la morphologie et la teneur en vacuolateur ont été montrés pour dépendre de l'alimentation masculine, le statut d'accouplement et l'âge21,25,26. Nous avons toujours une compréhension limitée des voies génétiques impliquées et comparer les transcriptomes de SC dans différentes conditions serait perspicace. Ce protocole rapide et relativement simple permettra de telles études. Fait important, cette méthode permet d'isoler les cellules principales des mêmes individus, et pourrait donc être utilisée comme il est pour déterminer si les paramètres génétiques et environnementaux affectent les deux types de cellules de glande accessoire simultanément.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du laboratoire Karch, la forme de plaque de génomique iGE3, le centre de Cytométrie Flow de l'Université de Genève et le Dr Jean-Pierre Aubry-Lachainaye qui a établi le protocole pour les FACS. Nous remercions Luca Stickley pour son aide dans la visualisation des lectures sur IGV. Nous nous remercions de la permission douce de réutiliser les chiffres, et les éditeurs pour nous inciter à être créatifs avec l'écriture.

Cette recherche a été financée par l'Etat de Genève (CI, RKM, FK), le Fonds national suisse pour la recherche (www.snf.ch) (FK et RKM) et les dons de la Fondation Claraz (FK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μL graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

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References

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Génétique Numéro 151 FACS Dissociation cellulaire ARN spécifique de type cellulaire séquençage de l'ARN Transcriptome Cellules secondaires Glande accessoire Drosophila Reproduction Réponse post-accouplement Cellules principales
Protocole facétoien visant à isoler l'ARN des cellules secondaires des glandes accessoires mâles <em>Drosophila</em>
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