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Genetics

Drosophila पुरुष सहायक Glands के माध्यमिक कोशिकाओं से आरएनए अलग करने के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/60218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

Summary

यहाँ, हम आरएनए अनुक्रमण और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए Drosophila पुरुष सहायक ग्रंथियों (माध्यमिक कोशिकाओं) से एक विशिष्ट सेल आबादी को अलग और सॉर्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल अलगाव एक multistep-dissociation प्रक्रिया विच्छेदन की आवश्यकता होती है के बाद GFP-expressing माध्यमिक कोशिकाओं के FACS शुद्धि के माध्यम से पूरा किया है, proteases पाचन और यांत्रिक फैलाव.

Abstract

एक अंग के कार्य को समझने के लिए, यह अक्सर अपने घटक कोशिका आबादी की भूमिका को समझने के लिए उपयोगी है. दुर्भाग्य से, व्यक्तिगत सेल आबादी की दुर्लभता अक्सर यह मुश्किल आणविक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए बनाता है. उदाहरण के लिए, Drosophila पुरुष प्रजनन प्रणाली के सहायक ग्रंथि दो अलग स्रावी सेल प्रकार शामिल हैं. मुख्य कोशिकाओं को बनाने के 96% स्रावी कोशिकाओं की ग्रंथि, जबकि माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) कोशिकाओं के शेष 4% बनाने (के बारे में 80 कोशिकाओं प्रति पुरुष). हालांकि दोनों सेल प्रकार मौलिक तरल पदार्थ के महत्वपूर्ण घटक का उत्पादन, केवल कुछ जीन अनुसूचित जातियों के लिए विशिष्ट होने के लिए जाना जाता है. अनुसूचित जातियों की दुर्लभता, इस प्रकार अब तक, इस महत्वपूर्ण सेल प्रकार के ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण अध्ययन में बाधा आई है। यहाँ, एक विधि है कि आरएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण के लिए अनुसूचित जातियों के शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल एक अनुसूचित जाति विशेष GFP रिपोर्टर व्यक्त मक्खियों से पहले विच्छेदन ग्रंथियों में होते हैं और फिर इन ग्रंथियों protease पाचन और यांत्रिक वियोजन के अधीन करने के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए. इन चरणों के बाद, व्यक्ति, रहने वाले, GFP चिह्नित कोशिकाओं आरएनए शुद्धि के लिए एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) का उपयोग कर हल कर रहे हैं. इस प्रक्रिया में अनुसूचित जाति-विशिष्ट आरएनए को एक दिन के दौरान डाउनस्ट्रीम आरटी-क्यूपीसीआर और/या आरएनए अनुक्रमण के लिए प्रति शर्त $40 पुरुषों से प्राप्त होता है। तेजी और प्रक्रिया की सादगी कई अलग अलग मक्खियों के transcriptomes के लिए अनुमति देता है, विभिन्न जीनोटाइप या पर्यावरण की स्थिति से, समय की एक छोटी अवधि में निर्धारित किया जा करने के लिए.

Introduction

अंग कई सेल प्रकार के होते हैं, असतत कार्यों के साथ प्रत्येक और कभी कभी जीन के काफी अलग सेट व्यक्त. कैसे एक अंग कार्य करता है की एक सटीक समझ प्राप्त करने के लिए, यह अक्सर इस अंग को बनाता है कि प्रत्येक अलग सेल प्रकार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. संभव समारोह का पता लगाने के लिए इस्तेमाल प्राथमिक तरीकों में से एक ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण है. इस शक्तिशाली विधि सक्रिय प्रक्रियाओं और रास्ते प्रकट करने के लिए, एक सेल में जीन अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। हालांकि, विश्लेषण के इस प्रकार अक्सर दुर्लभ सेल आबादी है कि कहीं अधिक प्रचुर पड़ोसी कोशिकाओं से शुद्ध किया जाना चाहिए के लिए मुश्किल है. उदाहरण के लिए, Drosophila पुरुष गौण ग्रंथि एक अंग मुख्य रूप से दो स्रावी सेल प्रकार से बना है. के रूप में दो सेल प्रकार के दुर्लभ इस ग्रंथि की कोशिकाओं का केवल 4% शामिल हैं, एक सेल प्रकार विशिष्ट transcriptome विश्लेषण का उपयोग करने में मदद करने के लिए इन कोशिकाओं के समारोह का निर्धारण नहीं किया गया था.

सहायक ग्रंथियां (एजीएस) कीड़ों में पुरुष प्रजनन पथ के अंग हैं। वे मौलिक तरल पदार्थ (सेमिनल तरल पदार्थ प्रोटीन (एसएफपी) और सहायक ग्रंथि प्रोटीन (एसीपी) के अधिकांश प्रोटीन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। इन SFPs में से कुछ के लिए mated महिलाओं में शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, आमतौर पर पोस्ट-मैचिंग प्रतिक्रिया (PMR) कहा जाता है. कुछ पीएमआर में शामिल हैं: बढ़ी हुई ओव्यूलेशन और अंडे देने की दर, शुक्राणु का भंडारण और रिहाई, मादा आहार में परिवर्तन, और महिला ग्रहणशीलता में माध्यमिक कोर्टिंग पुरुषों1,2के लिए कमी । के रूप में कीड़े प्रभाव मानव स्वास्थ्य से कई प्रमुख सामाजिक मुद्दों (घातक रोगों के लिए सदिश के रूप में) कृषि के लिए (कीट कीट हो सकता है, अभी तक परागण और मिट्टी की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैं), कीट प्रजनन को समझने के अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है. एजीएस और एजीपी का अध्ययन मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर के साथ काफी उन्नत किया गया है। इन अध्ययनों में ए जी की भूमिका और कुछ व्यक्तिगत प्रोटीनों की भूमिका पर प्रकाश डाला गया है जो वे पीएमआर बनाने में उत्पन्न करते हैं, जो रोग वेक्टर एडीज एजिप्टी3,4, और अन्यकीटों 1 जैसी अन्य प्रजातियों में काम को प्रभावित करते हैं ,5. इसके अलावा, के रूप में AGs मौलिक तरल पदार्थ के घटकों स्रावित1,6 वे अक्सर स्तनधारी प्रोस्टेट ग्रंथि और मौलिक vesicle के कार्यात्मक अनुरूप के रूप में के बारे में सोचा जाता है. इस समारोह समानता दो ऊतक प्रकार के बीच आणविक समानता के साथ संयुक्त, AGs मक्खियों में प्रोस्टेट ग्रंथि के लिए एक मॉडल बना दिया है7.

Drosophila पुरुष के भीतर, सहायक ग्रंथियों के दो पालियों रहे हैं. प्रत्येक पालि एक थैली की तरह एक केंद्रीय लुमेन आसपास स्रावी कोशिकाओं के एक मोनोलेयर से बना संरचना के रूप में देखा जा सकता है, और चिकनी मांसपेशियों द्वारा लिपटे. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, वहाँ दो रूपात्मक, विकास और कार्यात्मक रूप से अलग स्रावी सेल प्रकार इस ग्रंथि बना रहे हैं: बहुभुज के आकार की मुख्य कोशिकाओं (कोशिकाओं के 96% बनाने), और बड़ा, दौर माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) (बनाने ऊपर शेष 4% कोशिकाओं, या प्रति लोब के बारे में 40 कोशिकाओं). यह दिखाया गया है कि दोनों सेल प्रकार के ACPs के अलग सेट का उत्पादन करने के लिए प्रेरित और PMR बनाए रखने. तारीख करने के लिए प्राप्त डेटा के अधिकांश PMR की विशेषता व्यवहार के सबसे ट्रिगर में एक प्रोटीन की भूमिका पर प्रकाश डाला. यह प्रोटीन, सेक्स पेप्टाइड, एक छोटा सा है, 36 एमिनो एसिड पेप्टाइड कि मुख्य कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है8,9,10. हालांकि सेक्स पेप्टाइड PMR में एक प्रमुख भूमिका निभा रहा है, अन्य ACPs, दोनों मुख्य और माध्यमिक कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, भी PMR11के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है ,12,13,14 ,15,16,17. उदाहरण के लिए, हमारे वर्तमान ज्ञान के आधार पर, अनुसूचित जातियों, प्रोटीन वे उत्पादन के माध्यम से, पहले दिन18के बाद एसपी संकेत के स्थायीकरण के लिए आवश्यक प्रतीत होते हैं.

अनुसूचित जातियों की दुर्लभता को देखते हुए (पुरुष प्रति केवल 80 कोशिकाओं), इन कोशिकाओं और प्रोटीन वे उत्पादन के बारे में हमारे सभी ज्ञान आनुवंशिकी और उम्मीदवार दृष्टिकोण से आता है. अब तक, जीनों की केवल एक अपेक्षाकृत छोटी सूची को अनुसूचित जाति-विशिष्ट दिखाया गया है। इस सूची में होमियोडोमेन प्रोटीन दोषपूर्ण सिद्धिका (डीवीई)19, एलएनसीआरए एमएसए20, राब6, 7, 11 और 1921, सीजी 1656 और सीजी 1757511, 15,21 और होमबॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पेट -बी (अब्द-बी)18. पहले, हमने दिखाया है कि अब्द-बी की अभिव्यक्ति और माध्यमिक कोशिकाओं में lncRNA MSA दोनों के लिए उत्परिवर्ती कमी(iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती) $ 10 दिनों से केवल एक दिन12 के लिए PMR की लंबाई shortens , 18 , 20. यह फीनोटाइप मादा प्रजनन पथ12,18,20में एसपी के अनुचित भंडारण के कारण प्रतीत होता है . सेलुलर स्तर पर, इस उत्परिवर्ती की माध्यमिक कोशिकाओं असामान्य आकृति विज्ञान दिखाने के लिए, उनकी विशेषता धानी की तरह संरचनाओं को खोने18,20,21. इस उत्परिवर्ती लाइन का उपयोग करना, हम पहले या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती गौण ग्रंथियों12से पूरे AGs के transcriptional प्रोफाइल की तुलना करके अनुसूचित जाति समारोह में शामिल जीन की पहचान करने का प्रयास किया. इसके अलावा, अन्य प्रयोगशालाओं से पता चला कि अनुसूचित जाति संख्या, आकारिकी और धानी की मात्रा पुरुष आहार, संभोग की स्थिति और उम्र21,25,26पर निर्भर करती है.

हालांकि सकारात्मक प्रगति इन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था, एक पूर्ण अनुसूचित जाति transcriptome हासिल से दूर था. इस अंग में इन कोशिकाओं की दुर्लभता ने जंगली प्रकार की कोशिकाओं से भी आगे बढ़ने में कठिनाई का कारण बनाया। जीन अभिव्यक्ति के परीक्षण के लिए, विशेष रूप से पर्यावरण उत्तेजनाओं के बाद इन कोशिकाओं में परिवर्तन भी कठिन होगा. इस प्रकार, अनुसूचित जाति आरएनए को अलग और शुद्ध करने के लिए एक विधि जो विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और पर्यावरणीय स्थितियों के तहत प्रदर्शन करने के लिए काफी तेज और सरल थी।

अब्द-बी और एमएसए दोनों जीनों को अनुसूचित जातियों में अपनी अभिव्यक्ति के लिए ड्रोसोफिला बिटोरैक्स परिसर(जिसे डी1 बढ़ाने कहा जाता है ) से एक विशिष्ट 1.1 केबी बढ़ाने की आवश्यकता होती है। इस enhancer पहले एक GAL4 ड्राइवर बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि, जब एक UAS-GFPके साथ संबद्ध, विशेष रूप से अनुसूचित जातियों में मजबूत GFP अभिव्यक्ति ड्राइव करने में सक्षम है. इस प्रकार, हम दोनों जंगली प्रकार और iab-6cocuD1 AGs से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक FACS प्रोटोकॉल के लिए आधार के रूप में इस लाइन का इस्तेमाल किया. iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती अनुसूचित जाति के रूप में एक अलग सेलुलर आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल काफी अलग परिस्थितियों में इस दुर्लभ सेल प्रकार से उनके transcriptome के निर्धारण के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. Drosophila लाइनों प्रयुक्त और नर का संग्रह

  1. इस प्रोटोकॉल के लिए, अनुसूचित जातियों में GFP व्यक्त पुरुषों और नहीं मुख्य कोशिकाओं का उपयोग करें. यहाँ, एक AbdB-GAL4 ड्राइवर (संदर्भ में वर्णित18), UAS-GFP के साथ recombined (गुणसूत्र पर 2) प्रयोग किया जाता है. अन्य उपयुक्त ड्राइवर भी उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न उत्परिवर्ती शर्तों के तहत अनुसूचित जातियों के अलगाव के लिए, अनुसूचित जाति-विशिष्ट GFP लाइन युक्त लाइनों में उत्परिवर्तन पार.
  2. प्रत्येक जीनोटाइप के लिए लगभग 25 स्वस्थ, कुंवारी पुरुषों के दो बैच ों को एकत्र करें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 दिनों के लिए शीशियों में ताजा बनाया Drosophila भोजन के साथ उम्र।
    नोट: उम्र के रूप में, संभोग की स्थिति, पोषण और सामाजिक वातावरण प्रत्येक प्रजनन जीव विज्ञान को प्रभावित, सख्त प्रोटोकॉल इन मापदंडों के लिए नियंत्रित करने के लिए पालन किया जाना चाहिए. वर्जिन पुरुषों के लिए आयु वर्ग के हैं 3-4 एक 12 h/12 एच प्रकाश के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर pupal eclosion के बाद दिन/

2. समाधान और सामग्री की तैयारी

  1. निम्न समाधान तैयार करें।
    1. सीरम पूरक मध्यम (एसएसएम): श्नाइडर के Drosophila मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरित.
    2. 1x ट्रिप्सिन एंजाइम (उदा., ट्रिपल एक्सप्रेस एंजाइम) के एलिकोट्स तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. पैपिन [50 U/mL] के एलिकोट्स तैयार करें (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और केवल एक बार।
    4. 1x फॉस्फेट बफर नमकीन तैयार (पीबीएस, कमरे के तापमान पर संग्रहीत).
  2. सहायक ग्रंथियों के भौतिक वियोजन के लिए एकाधिक ज्वाला गोल पाइप्ट युक्तियाँ तैयार करें।
    नोट:     सहायक ग्रंथियों से निपटने के लिए कम प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करें क्योंकि वे अनुपचारित प्लास्टिक का पालन करते हैं। लौ दौर की प्रक्रिया टिप खोलने कम कर देता है और टिप के किनारों smoothens. यह कोशिका झिल्ली को सुनने के बिना peptidase पाचन के बाद एक कुशल वियोजन सुनिश्चित करता है.
    1. एक तेज ब्लेड के साथ एक 200 डिग्री एल टिप कट और धीरे से यह एक लौ पर पारित करने के लिए अपनी टिप दौर इतना है कि खोलने के व्यापक है, लेकिन चरण 3.7 के दौरान से निपटने के लिए चिकनी है.
    2. एक सेकंड से भी कम समय के लिए एक लौ के पास टिप खोलने गुजर द्वारा कई 1,000 $L युक्तियों के उद्घाटन संकीर्ण. अधिक पिघलने या clogging से बचने के लिए टिप थोड़ा घुमाएँ. संकरा से व्यापक करने के लिए किए गए सुझावों को क्रमबद्ध करें। यह आकांक्षा की गति के समय के द्वारा किया जा सकता है. सबसे संकीर्ण सुझावों की दक्षता का परीक्षण करने के लिए AGs के एक छोटे पैमाने पर नमूना अलग करने की कोशिश करो.
      नोट: इन युक्तियों यांत्रिक आंदोलन के लिए महत्वपूर्ण हैं (कदम 5.2 और 5.3). गुणवत्ता लौ गोल पाइप्ट युक्तियाँ पूर्ण वियोजन के लिए अनुमति देते हैं, जबकि सेल व्यवहार्यता के संरक्षण. इस तरह, इन युक्तियों को पुन: उपयोग के लिए प्रक्रिया के अंत में पानी के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है। यह दिन के लिए दिन reproducingible वियोजन के लिए अनुमति देता है.

3. सहायक Glands के विच्छेदन

  1. बर्फ पर एक गिलास पकवान में 20 से 25 पुरुष Drosophila रखो.
  2. एसएसएम में 1 पुरुष को अलग करें। इसके प्रजनन पथ को हटा दें और स्खलन वाहिनी के अलावा अन्य सभी ऊतकों से सहायक ग्रंथि जोड़ी को साफ़ करें।
    नोट: testes निकालें क्योंकि जारी शुक्राणु clumps बनाने के लिए और वियोजन प्रक्रिया को परेशान कर सकते हैं. स्खलन बल्ब निकालें, जो हैंडलिंग मुश्किल बनाता है जब यह तैरता है.
  3. संदंश के साथ, कमरे के तापमान पर एसएसएम से भरी एक कांच की प्लेट में सहायक ग्रंथियों को स्थानांतरित करें। एसएसएम में ग्रंथियों के 20 जोड़े के एक बैच को प्राप्त करने के लिए चरण 3-2-3.3 20 बार दोहराएँ।
    नोट: इन चरणों में प्राप्त किया जाएगा 15 से 20 मिनट AGs स्वस्थ दिखना चाहिए, और ग्रंथियों के आसपास मांसपेशियों की परत के peristaltic आंदोलनों दिखाई देना चाहिए. जीएफपी को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मटकी की जा सकती है।
  4. कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट धोने के लिए 1x पीबीएस के लिए सहायक ग्रंथियों स्थानांतरण।
    नोट: बेहतर वियोजन के लिए, यह पीबीएस के साथ ग्रंथियों कुल्ला करने के लिए आवश्यक है। इस चरण की अवधि, हालांकि, सीमित होनी चाहिए क्योंकि कोशिकाएं पीबीएस में तनाव के लक्षण दिखाती हैं; पीबीएस में अलग माध्यमिक कोशिकाओं तेजी से प्रफुल्लित और मर जाते हैं.
  5. वियोजन समाधान प्राप्त करने के लिए 180 डिग्री सेल्सियस में 180 डिग्री सेल्सियस पैपिन [50 U/mL] को विलेयता समाधान प्राप्त करने के लिए (अप या नीचे रखने के लिए 9 डिग्री सेल्सियस ट्रिप्सिन एंजाइम और प्रत्येक पुरुष के लिए पैपिन का 1 [L)। forceps के साथ, इस समाधान के लिए सहायक ग्रंथियों हस्तांतरण.
  6. निकट भाग से सहायक ग्रंथियों (द्वितीयक कोशिकाओं वाले) की नोक को अलग करें। एक ग्रंथियों पालि के बीच मजबूती से चुटकी और एक दूसरे forceps के तेज टिप के साथ कटौती करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें। विच्छेदन में सुधार और सेल छँटाई समय को कम करने के लिए सहायक ग्रंथियों और स्खलन नलिका के समीपस्थ भाग निकालें।
    नोट: ग्रंथियों के 20 जोड़े से दूर भाग dissecting 15 से 20 मिनट और peptidases द्वारा पाचन इस प्रकार कमरे के तापमान पर शुरू हो जाएगा ले जाएगा.
  7. सभी ग्रंथि युक्तियाँ विच्छेदन किया गया है के बाद, उन्हें एक 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित एक विशेष का उपयोग कर 200 $L पाइप टिप चरण 2.2.1 पर तैयार. यह ग्रंथियों से निपटने से पहले व्यापक, गोल और गीला होना चाहिए.
    नोट: पाइप गौण ग्रंथि ऊतक करने के लिए, सुझाव हमेशा उचित समाधान के साथ पूर्व गीला होना चाहिए (trypsin एंजाइम या एसएसएम, इस उद्देश्य के लिए प्रत्येक की एक ट्यूब रखना). सावधानी से संदूषण से बचने के लिए नमूनों के बीच युक्तियाँ कुल्ला.

4. ऊतक पाचन

  1. 60 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस शेकर में माइक्रोट्यूब प्लेस, 1,000 आरपीएम पर कमाल.
    नोट: दोनों आंदोलन और पाचन समय सफल वियोजन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कम या गतिहीन पाचन गरीब वियोजन दे देंगे, शायद क्योंकि बाहरी मांसपेशी परत और आंतरिक चिपचिपा मौलिक तरल पदार्थ peptidases से सहायक ग्रंथि कोशिकाओं की रक्षा.
  2. पाचन को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर एसएसएम का 1 एमएल जोड़ें और तुरंत चरण 5 पर आगे बढ़ें।

5. कोशिकाओं के यांत्रिक वियोजन

  1. एक विस्तृत गोल 1,000 जेडएल टिप का उपयोग करना, एसएसएम के साथ पूर्व गीला, एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए नमूना हस्तांतरण. माइक्रोस्कोप के तहत GFP फ्लोरोसेंट की निगरानी: सबसे ग्रंथि युक्तियाँ बरकरार दिखना चाहिए और कुछ अनुसूचित जाति अलग किया जाना चाहिए.
  2. चरण 2.2.2 पर उत्पन्न एक गोल संकीर्ण पाइप टिप का उपयोग करना, सहायक ग्रंथि ऊतक को बाधित करने के लिए 3 से 5 बार ऊपर और नीचे पाइप।
    नोट: बड़े ऊतक पैच टूट गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंट की निगरानी करें। यदि ऐसा नहीं है, तो चरण 5.2 दोहराएँ.
  3. एक बहुत ही संकीर्ण गोल पाइप टिप का उपयोग करना (चरण 2.2.2 में उत्पन्न), पाइप ऊपर और नीचे 1-2 बार.
    नोट: चरण 5.3 के बाद केवल अलग-अलग कक्ष दिखाई देने चाहिए. 24-वेल प्लेटों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि वे प्रक्रिया की एक आसान निगरानी सक्षम करते हैं। जब कुछ नमूने संसाधित किए गए और संतोषजनक परिणाम दिया गया (स्वस्थ लग माध्यमिक कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग), पाइपिंग कदम microtube में प्रदर्शन किया जाएगा.
  4. कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे व्यवस्थित करने और छँटाई समय को कम करने के लिए अतिरिक्त एसएसएम को हटाने के लिए कम से कम 15 मिनट प्रतीक्षा करें।
    नोट: दे कोशिकाओं बसने centrifugation की तरह वैकल्पिक तरीकों से बेहतर साबित कर दिया, और सिर्फ FACS से पहले कोशिकाओं के एक अंतिम दृश्य निरीक्षण की अनुमति देता है.
  5. कोशिकाओं को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब और पूल समान नमूनों (प्रत्येक स्थिति के लिए 20 पुरुषों के दो बैच) में पाइप करें। पिछले कोशिकाओं को ठीक करने के लिए एसएसएम के साथ कुओं कुल्ला, और उन्हें ट्यूब में पाइप (एक छोटी मात्रा का उपयोग करें).
  6. 1ण्5 एमएल माइक्रोट्यूब में सेल Lysis Solution के 300 [L और 1 [L] प्रोटीनेज K [50g/[L] जोड़ें (आरएनए शोधन किट में प्रदान किए गए समाधान, चरण 7 देखें)। प्रत्येक नमूने के लिए दो ट्यूब तैयार (एक एम सी के लिए और एक अनुसूचित जातियों के लिए).

6. FACS (Fluorscence-सक्रिय सेल छंटनी)

  1. सॉर्ट करने से पहले कुछ मिनट हल करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए व्यवहार्यता मार्कर जोड़ें (0.3 m Drak7).
    चेतावनी: Drak7 सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए.
  2. लाइव माध्यमिक कोशिकाओं की एक सजातीय आबादी को क्रमबद्ध करें (GFP-सकारात्मक, Drak7-नकारात्मक कोशिकाओं). एक और microtube में, मुख्य कोशिकाओं की आबादी को सॉर्ट करें (छोटे, GFP-नकारात्मक, Drak7-नकारात्मक कोशिकाओं). निम्नFACS gating रणनीति का उपयोग करें:
    नोट:     25 पीएसआई पर सेल सॉर्टर दबाव सेट करें और कोशिकाओं को 100 डिग्री मी नोजल के माध्यम से पास करें। छँटाई दर लगभग 2,000 कोशिकाओं/
    1. मलबे को छोड़ने के लिए और FSC-SSC (चित्र 2ई) के आधार पर कुल कोशिकाओं का चयन करें।
    2. मृत कोशिकाओं को शामिल न करें. एक 640 एनएम लेजर के साथ Drak7 उत्तेजित और एक 795/ गेट ड्रेक7-सकारात्मक कोशिकाएं बाहर (चित्र 2च)।
    3. एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू और एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच पर डबल गैटका उपयोग करके डबल्स निकालें (चित्र 2एच)।
      नोट: मुख्य सेल संदूषण को कम करने के लिए, डबल गैटिंग का उपयोग करके सेल डबलेट को सख्ती से छोड़ दें।
    4. Lysis बफर और Proteinase कश्मीर के साथ एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में $ 550 GFP सकारात्मक कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। इस जनसंख्या को द्वितीयक कक्ष माना जाता है (SC, चित्र 2G)। 488 एनएम पर GFP उत्तेजित और एक 526/52 बैंड पास फिल्टर के साथ उत्सर्जित फ्लोरोसेंट इकट्ठा।
    5. $ 1,000 GFP-नकारात्मक कोशिकाओं, सजातीय और आकार में छोटे, Lysis बफर और Proteinase कश्मीर के साथ एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में क्रमबद्ध करें। इस जनसंख्या को मुख्य कक्ष माना जाता है (एमसी, चित्र 2जी)।
    6. भंवर सभी नमूने.
      नोट: से 40 पुरुषों ($40 x 80 अनुसूचित जाति $ 3,200 माध्यमिक कोशिकाओं), 600 से 800 लाइव एकल माध्यमिक कोशिकाओं प्राप्त कर रहे हैं (लगभग 20-25% पुनर्प्राप्ति). नमूनों को सामान्य करने के लिए 550 अनुसूचित जाति और 1,000 एम सी के आसपास छँटाई बंद करो।

7. आरएनए निष्कर्षण

नोट: हम निम्नलिखित रूपांतरों के साथ, आरएनए निष्कर्षण के लिए Epicentre MasterPure आरएनए शोधन किट का इस्तेमाल किया। अन्य किट के रूप में लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उपज काफी अधिक है $ 500 कोशिकाओं से अनुक्रमण के लिए एक पुस्तकालय तैयार करने के लिए (2 एनजी RNAs यहाँ इस्तेमाल किया गया था).

  1. सेल lysis पूरा करने के लिए 15 मिनट और भंवर हर 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के नमूने।
  2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखें न्यूक्लिक एसिड वर्षा के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें (भाग "कुल न्यूक्लिक एसिड की वर्षा" और "कुल न्यूक्लिक एसिड तैयारी से डीएनए को दूषित करने का हटाना")।
  3. RNase-मुक्त ते बफर के 10 $L में आरएनए गोली निलंबित.
  4. RNase अवरोध करनेवाला जोड़ें (वैकल्पिक).
  5. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।

8. आरएनए मात्रा, गुणवत्ता और विशिष्टता के गुणवत्ता नियंत्रण

  1. आरएनए की गुणवत्ता और एकाग्रता का अनुमान लगाएं। छोटी मात्रा और एकाग्रता के कारण, यहाँ आरएनए 6000 पिको चिप्स का उपयोग करें। अच्छी गुणवत्ता आरएनए गैर degraded के रूप में परिभाषित किया गया है, तेज चोटियों के साथ एक कम आधार रेखा के रूप में दिखाई rRNAs के लिए इसी.
  2. सॉर्ट किए गए कक्षों की पहचान को नियंत्रित करने के लिए RT-QPCR
    1. प्राइमर के रूप में यादृच्छिक hexamers का उपयोग कर कुल आरएनए के 2 एनजी के साथ रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करते हैं। द्वितीयक कोशिका आरएनए तथा मुख्य कोशिका आरएनए पर आरटी का कार्य करें।
      नोट: CDNAs पतला किया जा सकता है, aliQuote, और बाद में उपयोग के लिए जमे हुए रखा.
    2. हाउसकीपिंग जीन(अल्फा-टबुलिन, 18एस आरआरएनए), माध्यमिक कोशिका विशिष्ट जीन (एमएसए, राब19, अब्द-बी) और मुख्य कोशिका विशिष्ट जीन (सेक्स पेप्टाइड) की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त प्राइमर युग्मों का उपयोग करते हुए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर निष्पादित करें।

9. अनुक्रमण (cDNA लाइब्रेरी तैयारी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण)

  1. polydT प्राइमर्स के साथ सीडीएनए संश्लेषित करने के लिए कुल आरएनए के 2 एनजी का उपयोग करें। उन्हें प्रवर्धन के लिए बढ़ाना करने के लिए SMARTer प्रौद्योगिकी का उपयोग करें।
  2. लायब्रेरी तैयार करने के लिए नेक्सेरा एक्सटी किट का उपयोग करें.
  3. Multiplexed का उपयोग कर अनुक्रम, 100 न्यूक्लिओटाइड एकल अनुक्रमण पढ़ता है (भले ही 50 न्यूक्लिओटाइड पढ़ता है सबसे प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हैं) के आसपास उपज के लिए 30 लाख प्रत्येक नमूने के लिए पढ़ता है.

10. डेटा विश्लेषण

  1. FastQC चलाएँ.
  2. UCSC dm6 Drosophila संदर्भ जीनोम पर पढ़ता नक्शा और .bam फ़ाइलें उत्पन्न करने के लिए स्टार aligner का प्रयोग करें. जीनोम ब्राउज़र पर पढ़ता कल्पना करने के लिए एकीकृत जीनोम्स व्यूअर (आईजीवी) का उपयोग करें।
  3. जीन गणना करने के लिए HTSeQ का उपयोग करें.
  4. जीन गणना22को सामान्य बनाने के लिए M-मानों (TMM) विधि के ट्रिम्ड माध्य का उपयोग करें। अंतर अभिव्यक्ति, एमए भूखंडों और पीसीए के सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए edgeR का उपयोग करें।
  5. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और आंकड़ों के लिए, सामान्य रैखिक मॉडल, गलत जांच दर (एफडीआर) और बेंजामिनी और Hochberg सुधार (BH) के साथ अर्ध-likelihood एफ परीक्षण का उपयोग करें।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रयोगकर्ता को ड्रोसोफिला पुरुष सहायक ग्रंथियों से द्वितीयक कोशिकाओं को अलग करने और एक ही दिन के दौरान अपने आरएनए को निकालने में सक्षम बनाता है (चित्र 1) ।

हम अब्द-बी-GAL4 निर्माण18 का उपयोग माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) लेबल करने के लिए लेकिन नहीं मुख्य कोशिकाओं (MC) GFP के साथ (चित्र 2ए). इस प्रक्रिया का एक उद्देश्य अनुसूचित जातियों के जंगली प्रकार transcriptome प्राप्त करने के लिए है (जंगली प्रकार उल्टे अल्पविराम के साथ लिखा है क्योंकि वे ट्रांसजेनिक GFP और GAL4 व्यक्त मक्खियों से प्राप्त कर रहे हैं). एक अन्य उद्देश्य के लिए एक तेज और आसान प्रक्रिया है कि विभिन्न स्थितियों में उनके जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की अनुमति देता है के माध्यम से अनुसूचित जाति आरएनए प्राप्त है. इस प्रकार, हम जंगली प्रकार का उपयोग कर इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया और "iab-6cocuD1" उत्परिवर्ती कि एक 1.1 kb विलोपन ले अब-बी अनुसूचित जाति अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार के बढ़ाने को हटाने. यह विलोपन एमएसएके प्रवर्तक को भी हटा देता है , जो द्वितीयक कोशिकाओं के विकास, आकृति विज्ञान और कार्य18,20 (चित्र 2ब्, ब् )के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिलिपि है। इस प्रोटोकॉल को जैविक triplicates प्राप्त करने के लिए हर बार 2 जीनोटाइप्स के साथ तीन बार दोहराया गया था (इसके बाद जंगली प्रकार के लिए WT-1,-2,-3 के रूप में संदर्भित और Iab-6cocuD1के लिए D1-1,-2 और -3 )।

इस प्रोटोकॉल में कुछ ही घंटों में ड्रोसोफिला सहायक ग्रंथियों से एम सी और अनुसूचित जाति वियोजन की अनुमति दी गई है (चित्र 2डी) दोनों कोशिकाओं तो दो अलग अलग ट्यूबों में हल कर रहे हैं एम सी और अनुसूचित जातियों को अलग. एफएसीएस के लिए गटिंग कार्यनीति चित्र 2ई-2जीमें दिखाई देती है। ड्रेक7 पूरे नमूने के लिए 70% के आसपास सेल व्यवहार्यता का आकलन करने की अनुमति देता है (चित्र 2च) . एकल अनुसूचित जाति की आबादी का 90% से अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं, और एमसी आबादी का 80% से अधिक, FSC-A बनाम FSC-H और एसएससी-एच बनाम एसएससी-डब्ल्यू द्वारा अनुमानित. (चित्र 2ज) देखें । यह एक कुशल वियोजन को दर्शाता है। छँटाई की घटनाओं के लगभग 10% निरस्त कर दिया गया था क्योंकि एक और सेल या मलबे एक ही FACS बूंद में मौजूद था. 40 पुरुषों से, हम आम तौर पर 550 अनुसूचित जाति और 1,000 एम सी इकट्ठा और फिर छँटाई बाधा. 1 नमूना से (6 से बाहर), हम 550 माध्यमिक कोशिकाओं तक नहीं पहुँच सके. WT-1 नमूना इस प्रकार केवल 427 अनुसूचित जाति से प्राप्त किया गया था, लेकिन दूसरों के रूप में इसी तरह की गुणवत्ता और मात्रा के आरएनए प्रदान की.

कोशिकाओं lysis बफर में हल कर रहे हैं (प्रोटीनसे युक्त कश्मीर). जैसे ही सभी नमूने तैयार हैं, आरएनए प्रत्येक सेल नमूने से निकाले जाते हैं ताकि दिन के अंत में आरएनए छर्रों के लिए। गुणवत्ता और RNAs की मात्रा कम सांद्रता और छोटे संस्करणों के साथ सौदा करने के लिए एक उपयुक्त चिप के साथ एक Bioanalyzer का उपयोग कर अनुमान लगाया जाता है. क्योंकि अनुमानित सांद्रता नमूनों के बीच चर रहे थे (से अधिक 1,300 pg/$L नीचे से 344 pg/$L, देखें चित्रा 3ए),हम दोनों RT-QPCR और cDNA पुस्तकालय संश्लेषण के लिए प्रारंभिक सामग्री समायोजित करने के लिए मोटे तौर पर 2 एनजी (मापा सांद्रता अत्यधिक सटीक नहीं हैं)। हम जंगली प्रकार एम सी और अनुसूचित जाति के अर्क पर वास्तविक समय QPCR द्वारा विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित सेल आबादी हम हल की पहचान के लिए नियंत्रित करने के लिए. चित्र 3 बी अल्फा-ट्यूबलिन अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत सापेक्ष परिमाणीकरण के रूप में जीन अभिव्यक्ति से पता चलता है। 18S rRNA और अल्फा-tubulin जैसे हाउसकीपिंग जीन सभी नमूनों में पाए जाते हैं, जैसा कि उम्मीद है. काफी विपरीत, अनुसूचित जाति जीन Rab19 केवल अनुसूचित जाति के अर्क से पता चला है, और एम सी जीन सेक्स पेप्टाइड केवल एम सी से पता चला है. हम ध्यान दें कि Iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती अनुसूचित जाति में Rab19 अभिव्यक्ति जंगली प्रकार अनुसूचित जाति के सापेक्ष कम है, सुझाव है कि इस जीन की अभिव्यक्ति Abd-B और एमएसए के नुकसान से प्रभावित है (संगत रूप से, बड़े Rab19 लेबल धानी iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती21में खो रहे हैं. द्वितीयक सेल-विशिष्ट प्रतिलिपि MSA केवल जंगली प्रकार अनुसूचित जाति से और नहीं एम सी से पाया गया है, और न ही iab-6cocuD1 अनुसूचित जाति से, जो MSA प्रमोटर इस उत्परिवर्ती में हटा दिया जाता है के बाद से उम्मीद की गई थी. कुल मिलाकर, चित्र 3 में दिखाए गए QCs प्रदर्शित करता है कि इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त RNAs निम्नीकृत नहीं हैं, और यह कि दोनों सेल आबादी (एससी और एम सी) सफलतापूर्वक सहायक ग्रंथियों से हल कर रहे हैं, दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती स्थितियों में. केवल द्वितीयक कोशिकाओं के RNAs यहाँ अनुक्रम थे, लेकिन ध्यान दें कि इस प्रक्रिया दोनों अनुसूचित जातियों और एम सी के सहवर्ती transcriptome रूपरेखा सक्षम बनाता है.

आरएनए अनुक्रमण मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर महसूस किया गया था. यहाँ, हम केवल गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण है कि इस विधि के प्रयोजन के लिए प्रासंगिक हैं पर चर्चा करेंगे. जब अनुक्रम प्राप्त कर रहे हैं, पढ़ता संदर्भ Drosophila जीनोम के लिए मैप कर रहे हैं, जीन के लिए जिम्मेदार ठहराया, और सामान्यीकृत. पीसीए (मुख्य घटक विश्लेषण) 6 नमूने (3 जंगली प्रकार और 3 iab-6cocuD1 प्रतिकृति) पर किया गया था। के रूप में संभव के रूप में डेटा में परिवर्तनशीलता का ज्यादा PC1 में के लिए जिम्मेदार है, और शेष परिवर्तनशीलता के रूप में ज्यादा PC2 में के लिए जिम्मेदार है. जैसा कि चित्र 4Aमें दिखाया गया है, जंगली प्रकार क्लस्टर को एक साथ बंद करता है, और Iab-6cocuD1 नमूनों से दूर। यह पता चलता है कि WT नमूने अधिक से वे उत्परिवर्ती लोगों से कर रहे हैं एक दूसरे के समान हैं. यह विधि reproducibility और उत्परिवर्ती माध्यमिक कोशिकाओं से असामान्य आनुवंशिक कार्यक्रम का पता लगाने की क्षमता दिखाता है. जबकि D1-2 और D1-3 नमूने एक साथ क्लस्टर, हम ध्यान दें कि D1-1 नमूना काफी भिन्न है. चूंकि इस प्रतिकृति के लिए सभी QCs अच्छा है और अन्य सभी प्रतिकृति करने के लिए तुलनीय हैं, हम एक नमूना तैयारी मुद्दा बाहर कर सकते हैं (29 लाख कुल में पढ़ता है, और 76% जिनमें से संदर्भ जीनोम के लिए विशिष्ट संरेखित करें. उन लोगों में से, gt;77% एक जीन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, gt;90% mRNAs हैं, और lt;3% rRNA हैं). इस विचलन को प्रतिबिंबित कर सकता है कि अनुसूचित जाति में जीन अभिव्यक्ति iab-6cocuDमें अस्थिर है, हालांकि इस परिकल्पना का परीक्षण अधिक प्रतिकृति की आवश्यकता होगी.

जीनोम पर विशेष जीनों के साथ संरेखित विज़ुअलाइज़िंग डेटा गुणवत्ता के दृश्य आकलन के लिए अनुमति देता है। चित्र 4 जीनों का चयन दर्शाता है, जिसमें प्रत्येक जीनोटाइप के लिए 1 प्रतिनिधि प्रतिकृति से पढ़ता है। आश्चर्य की बात है कि Act5C जैसे हाउसकीपिंग जीनों को दोनों जीनोटाइप्स (चित्र 4ख) के साथ-साथ अनुसूचित जाति-विशिष्ट जीन राब19 और डीवी (चित्र 4ब्, डी)दोनों में व्यक्त किया जाता है। intronic की कमी पढ़ता पुष्टि करता है कि polydT चुनिंदा cDNA पुस्तकालय की तैयारी के लिए परिपक्व spliced mRNAs से रिवर्स प्रतिलेखन primed. विशेष रूप से, हम जंगली प्रकार और iab-6cocuD1 अनुसूचित जाति के बीच विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण बदलाव देख सकते हैं. एमएसए जीन द्वारा चित्र 4ई में इसका उदाहरण दिया गया है जिसकी जंगली प्रकार में प्रबल अभिव्यक्ति आईएब-6cocuD1में खो जाती है. MSA सिद्धांत है कि इस विधि जीन है कि उत्परिवर्ती स्थितियों में गलत विनियमित कर रहे हैं की पहचान करने में सक्षम बनाता है का एक सबूत के रूप में प्रस्तुत किया है. यह इस उत्परिवर्ती में मनाया phenotypes को समझने में मदद मिलेगी, और सामान्य माध्यमिक कोशिकाओं कार्यों में नई अंतर्दृष्टि दे सकता है.

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल का ओवरव्यू. प्रोटोकॉल के मुख्य चरण दिखाए जाते हैं, सही पक्ष पर समय रेखा के साथ. इस प्रक्रिया को एक सुबह में रहते Drosophila के साथ शुरू करने के लिए दोपहर तक अलग गौण ग्रंथि कोशिकाओं की अनुमति देता है, उन्हें GFP अभिव्यक्ति के आधार पर सॉर्ट, और उनके RNAs काम के दिन के अंत तक निकाले जाओ. आरएनए अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण आम तौर पर कुछ सप्ताह लगेंगे. यह आंकड़ा संदर्भ27से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: अलग करना और GFP-expressing माध्यमिक कोशिकाओं छँटाई. (ए) अब्द-बी:GAL4 UAS-GFP गौण ग्रंथि की Confocal छवि माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) में GFP व्यक्त, लेकिन मुख्य कोशिकाओं में नहीं (एमसी). Nuclei DAPI (नीले) के साथ दाग रहे हैं. डॉटेड व्हाइट लाइन एजी लोब्स सीमांकित। ईडी स्खलन वाहिनी है। ऊपरी बाएँ कोने में सफेद सलाखों 50 डिग्री मीटर तराजू हैं. (बी,सी) अनुसूचित जाति के साथ सहायक ग्रंथि distal भाग के बढ़े हुए विचारों GFP व्यक्त, जंगली प्रकार में (बी) और iab-6cocuD1 (सी) पृष्ठभूमि. (घ)जीएफपी दूरबीन के अंतर्गत निम्न आवर्धन पर विघटित कोशिकाएं। (ई-एच) FACS gating रणनीति अनुसूचित जाति और एम सी को शुद्ध करने के लिए सभी पैनलों पर लाल डॉट्स दिखाया अनुसूचित जातियों के रूप में पैनल में परिभाषित(जी). सबसे पहले मलबे को बाहर रखा गयाहै (ई, चरण 6.2.1) के साथ-साथ ड्रेक-7 सकारात्मक मृत कोशिकाएं(एफ, चरण 6.2.2)। GFP सकारात्मक कोशिकाओं का चयन कर रहे हैं (एससी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GFP नकारात्मक कोशिकाओं की एक सजातीय आबादी (एमसी)(जी, चरण 6.2.4 और 6.2.5). Doublets दोनों MC और अनुसूचित जाति की आबादी से बाहर रखा गया है (चरण 6.2.3, केवल एससी-एच बनाम अनुसूचित जाति के लिए एसएससी-डब्ल्यू gating 2H पर एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है). यह आंकड़ा संदर्भ27से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: RNAs पर QC: गुणवत्ता, मात्रा, और सेल प्रकार विशिष्टता. (क)पिकोचिप पर आरएनए गुणवत्ता और सांद्रता आकलन का नियंत्रण। 25 एन टी शिखर परिमाणीकरण के लिए नियंत्रण है। कम आधार रेखा कम गिरावट इंगित करता है और 2 प्रमुख चोटियों राइबोसोमल आरएनए हैं। आरटी-क्यूपीसीआर के लिए इस्तेमाल किए गए 3 नमूने दिखाए जाते हैं, उनकी गुणवत्ता इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी आरएनए नमूनों का प्रतिनिधि है, और उनके अनुमानित सांद्रता कुल आरएनए में भिन्नता को प्रतिबिंबित करती हैं जो हमने नमूनों के बीच प्राप्त की हैं। (बी) आरटी-क्यूपीसीआर माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) और मुख्य कोशिकाओं (एमसी) की छँटाई की विशिष्टता को प्रदर्शित करता है। जीन व्यंजक परिमाणीकरण ु$2(40-CQ) सूत्र का उपयोग करके किया जाता है। प्रत्येक स्थिति में प्रत्येक जीन के प्रत्येक त्रिफला अल्फा-Tubulin आरएनए के औसत मात्रा के लिए सामान्यीकृत कुल आरएनए भिन्नता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए है. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन दिखाएँ। WT का अर्थ है जंगली प्रकार और D1 iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती को संदर्भित करता है. यह आंकड़ा संदर्भ27से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: आरएनए अनुक्रमण डेटा पर QC. (ए) डब्ल्यूटी-1,-2,3 (हरी डॉट्स) और डी1-1,-2,-3 (नीले डॉट्स) आरएनए अनुक्रमण डेटासेट पर मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए)। (बी-ई) अनुक्रमण IGV सॉफ्टवेयर का उपयोग Drosophila संदर्भ जीनोम के लिए मैप पढ़ता है. प्रत्येक जीनोटाइप का केवल एक प्रतिनिधि नमूना स्पष्टता के लिए दिखाया गया है (WT-1 और D1-2), और केवल कुछ विशिष्ट loci दिखाए जाते हैं. जीन नाम प्रत्येक पैनल के शीर्ष पर लिखे जाते हैं, और प्रतीक उनके अभिविन्यास को संदर्भित करते हैं। कोष्ठक में संख्या प्रत्येक ट्रैक डीएनए आधार जोड़ी प्रति पढ़ता है की संख्या के लिए पैमाने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं. इस पैमाने पर एक दिया जीन के लिए दोनों स्थितियों के लिए एक ही है, लेकिन बेहतर दृश्य के लिए जीन के बीच बदलता है. प्रत्येक पैनल के तल पर ब्लू बार जीन 'introns (थिन लाइन), exons (वाइड लाइन) और ORF दिखाने के लिए (के साथ आयतों; ध्यान दें कि Rab19 और Arl5 ओवरलैपिंग कर रहे हैं, अभिसरण जीन (सी) . यह आंकड़ा संदर्भ27से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस अध्ययन में आरटी-क्यूपीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर:
लक्ष्य जीन फॉरवर्ड प्राइमर रिवर्स प्राइमर
ऐल्फा-टुबुलिन टीटीटीसीटीजीजीटीजीटीजीजीटीजीए सीसीसीसीटीजीसीएकैटगकैट
18S RRNA CTGAGAACGGCTACATC ACCAGACTTGCCCCCAAT
राब19 कैग्गागगटटीसीसीटीसीटीएसी TTGGAAAGGAACCGCTTG
सेक्स पेप्टाइड GGAATGGCCGTGGAATAGGA TAACATCTCCCACCAGC
एमएसए CTCATCTGCCTTCGCGTG CAGCCGTGTATCTCGAGC

तालिका 1: प्राइमर्स अनुक्रम

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Discussion

द्रोसोफिला ऊतक जैसे कल्पनात्मक डिस्क से कोशिका वियोजन के तरीके पहले से ही23वर्णित हैं . गौण ग्रंथियों पर इन प्रक्रियाओं का उपयोग करने के हमारे प्रयास विफल रहे, हमें इस नए प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए प्रोत्साहित किया। Protease पाचन और यांत्रिक trituration महत्वपूर्ण कदम हम प्रक्रिया की सफलता के लिए परेशानी थी, और हम इस प्रकार वर्गों में कई नोट रखा 2 से 5 के लिए प्रयोगकर्ताओं संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने में मदद करने के लिए. वियोजन सफल होने के लिए, peptidases सहायक ग्रंथि कोशिकाओं तक पहुँचने चाहिए, जो लुमेन में चिपचिपा मौलिक तरल पदार्थ और ग्रंथि के आसपास मांसपेशियों की परत द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. इस प्रकार ग्रंथियों के दूरस्थ भाग को अलग करना महत्वपूर्ण था (चरण 3.6)। इसके अलावा, 60 मिनट के लिए पचाने में कम से कम जोरदार मिलाते हुए (कदम 4.1) आवश्यक था. trypsin समाधान के साथ कोमल वियोजन (उदा., TrypLE) यांत्रिक वियोजन तक ग्रंथि अखंडता और सेल व्यवहार्यता संरक्षित. trypsin समाधान के साथ सहयोग में या तो papin या collagese के अलावा वियोजन में सुधार (सही वियोजन कम pipeting के साथ प्राप्त किया गया था, बेहतर सेल अस्तित्व में जिसके परिणामस्वरूप). हालांकि, उन एंजाइमों में से कोई भी अपने दम पर कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त थे. 2.2.2 भाग में उत्पन्न गोल संकीर्ण युक्तियों का उपयोग करपाइपिंग इस विधि के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. अतः इस अनुषभ (चरण 5-2-5.3) को सुझावों का सबसे अच्छा संयोजन चुनने के लिए छोटे पैमाने के प्रयोगों में ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए (चरण 5-3 में नोट देखें)।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक को अलग करने में सक्षम हो जाएगा 500 करने के लिए 800 जीवित माध्यमिक कोशिकाओं से 40 पुरुषों. यह $20% ($ 5%) का प्रतिनिधित्व करता है वसूली शुरू सामग्री के रूप में 3,200 अनुसूचित जाति पर विचार (40 पुरुषों x 80 अनुसूचित जाति). 20% दक्षता आरएनए अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च था क्योंकि हम एक दिन में कई नमूनों की प्रक्रिया कर सकता है. हालांकि, यह सहित कई विधियों द्वारा सुधार किया जा सकता है: बड़े बैचेस में काम कर रहा है; पाचन ट्यूब में trituration कर रही है और स्थानांतरण को कम करने के लिए कदम 5.4 लंघन; बहुत धीरे triturating (कुछ अलग GFP + कोशिकाओं कदम 5.3 के बाद शीघ्र ही मर जाते हैं); वियोजन और FACS के बीच की अवधि को छोटा करना; उच्च एकाग्रता पर trypsin समाधान का उपयोग करके पाचन समय कम; एकल चयन (चरण 6.2.3) के लिए कम कड़े पैरामीटर का उपयोग कर और सॉर्ट किया गया. इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह कोशिकाओं को अलग करने के लिए कई घंटे लगते हैं; इसलिए यह बहुत क्षणिक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं है. इस प्रोटोकॉल के साथ, 4 x 20 पुरुषों एक ही व्यक्ति द्वारा संसाधित किया जा सकता है (प्रशिक्षण के साथ) एक सुबह में, 1 दिन में दो अलग अलग स्थितियों के अनुसूचित जाति से आरएनए निष्कर्षण की अनुमति (चित्र 1) . विशेष रूप से, अधिक प्रयोगकर्ता सहायक ग्रंथियों संग्रह में भाग ले सकते हैं (चरण 3-1-3.3) ताकि एक ही दिन में एकाधिक नमूने संसाधित किए जा सकें. तथापि, चरण 3-4 के बाद एक ही व्यक्ति द्वारा पुनरूत्थानता को अधिकतम करने के लिए वरीयता से किया जाएगा।

माध्यमिक कोशिकाओं पुरुष fecundity12,20,24के लिए आवश्यक कार्य बाहर ले , लेकिन जीन वे इस भूमिका को पूरा करने के लिए व्यक्त की पूरी तस्वीर अभी भी याद आ रही है. यहाँ, हम वर्णन कैसे मक्खियों की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या से इन कोशिकाओं के transcriptome प्राप्त करने के लिए, विभिन्न स्थितियों में अनुसूचित जाति में जीन अभिव्यक्ति की तुलना को सक्षम करने. यहाँ, अनुसूचित जाति समारोह और आकृति विज्ञान को प्रभावित करने वाले उत्परिवर्ती का उपयोग किया गया था, और इसके ट्रांसक्रिप्टोम में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाई दे रहे हैं। इस विधि इस प्रकार उनके कार्य के लिए आवश्यक नए अनुसूचित जाति जीन की पहचान करने में मदद मिल सकती है. हमारे ज्ञान के लिए, अनुसूचित जाति transcriptome प्राप्त करने के लिए एकमात्र वैकल्पिक तरीका अनुसूचित जातियों के मैनुअल उठा द्वारा हमारी प्रयोगशाला में किया गया था अच्छी गुणवत्ता आरएनए अनुक्रमण डेटा प्राप्त किया गया था, लेकिन प्रक्रिया भी श्रम गहन कई स्थितियों में किया जा करने के लिए किया गया था। हम अपने अनुसूचित जाति RNAseQ डेटासेट की तुलना करेंगे और एक अलग कागज में अनुसूचित जाति जीव विज्ञान के बारे में उनके जैविक अर्थ का विश्लेषण (तैयारी में).

भविष्य में, इस तकनीक न केवल जंगली प्रकार अनुसूचित जाति transcriptome पर प्रकाश डाला जाएगा, लेकिन यह भी सहायक ग्रंथि कोशिकाओं transcriptome पर पर्यावरण या जीन परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम. अनुसूचित जाति संख्या, आकृति विज्ञान और धानी की मात्रा पुरुष आहार, संभोग की स्थिति और उम्र21,25,26पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है. हम अभी भी शामिल आनुवंशिक रास्ते की एक सीमित समझ है और विभिन्न स्थितियों में अनुसूचित जाति transcriptomes की तुलना व्यावहारिक होगा. यह तेजी से और अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल इस तरह के अध्ययन ों को सक्षम करेगा. महत्वपूर्ण बात, इस विधि एक ही व्यक्तियों से मुख्य कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है, और इस प्रकार के रूप में यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आनुवंशिक और पर्यावरण मानकों दोनों गौण ग्रंथि सेल प्रकार एक साथ प्रभावित है इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का कोई खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

हम Karch प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए आभारी हैं, iGE3 जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म करने के लिए, जिनेवा विश्वविद्यालय के प्रवाह Cytometry कोर सुविधा के लिए, और डॉ जीन Pierre Aubry-Lachainaye जो FACS के लिए प्रोटोकॉल सेट करने के लिए. हम IGV पर पढ़ता visualizing के साथ उसकी मदद के लिए Luca Stickley धन्यवाद. हम आंकड़ों का पुन: उपयोग करने के लिए कोमल अनुमति के लिए खुद को धन्यवाद, और संपादकों हमें लेखन के साथ रचनात्मक होने के लिए प्रेरित करने के लिए.

इस अनुसंधान जिनेवा के राज्य (सीआई, आरकेएम, FK), अनुसंधान के लिए स्विस राष्ट्रीय कोष (www.snf.ch) (FK और RKM) और Claraz फाउंडेशन (FK) से दान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-wells Tissue Culture plate VWR 734-2325
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Draq7 0.3 mM BioStatus DR71000
Plastic microtubes 1.5 mL Eppendorf
FACS Beckman Coulter MoFlo Astrios
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum Gibco 10270-106 heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
MasterPure RNA Purification Kit Epicentre MCR85102
Nextera XT kit illumina https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000 Gilson
P20 Gilson
P200 Gilson
Papain 50U/mL stock
PBS home made
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
PolydT primers
Random hexamer primers
RNA 6000 Pico kit Agilent
Schneider’s Drosophila medium Gibco 21720-001
SMARTer cDNA synthesis kit Takara https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFX applied biosystems 4472942
Thermo Shaker Hangzhou Allsheng intruments MS-100
Tipone 1250 μL graduated tip Starlab S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip Starlab S1161-1800
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604013
Vortex

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References

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जेनेटिक्स अंक 151 FACS सेल वियोजन सेल प्रकार विशिष्ट आरएनए आरएनए अनुक्रमण Transcriptome माध्यमिक कोशिकाओं सहायक ग्रंथि Drosophila,प्रजनन पोस्ट संभोग प्रतिक्रिया मुख्य कोशिकाओं
<em>Drosophila</em> पुरुष सहायक Glands के माध्यमिक कोशिकाओं से आरएनए अलग करने के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल
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Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. … More

Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (151), e60218, doi:10.3791/60218 (2019).

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