Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

رصد درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر كونكوالبؤر

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60270
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

Summary

يصف البروتوكول زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من المبيضات البيض وMutans العقدية ويقدم طريقة confocal المجهرية المستندة إلى رصد درجة الحموضة خارج الخلية داخل هذه الأغشية الحيوية.

Abstract

وتشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من كل من الخلايا الفطرية والبكتيرية في مجموعة متنوعة من أمراض الفم، مثل الالتهابات اللاقانية، والتهاب اللثة، والالتهابات المخاطية، وأبرزها تسوس الطفولة المبكرة. في كل هذه الظروف ، يؤثر درجة الحموضة في مصفوفة البيوفيلم على تفاعلات الميكروب والمضيف وبالتالي تطور المرض. ويصف البروتوكول الحالي طريقة مُحدّدة للتنظير المجهري لرصد ديناميات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتألف من المبيضات البيضوات وموتان المكورات العقدية. يتم استغلال الطيف ثنائي الانبعاثات المعتمد على درجة الحموضة وخصائص تلطيخ المسبار النسبةي C-SNARF-4 لتحديد القطرات في درجة الحموضة في المناطق خارج الخلية من الأغشية الحيوية. يتطلب استخدام قياس نسبة الأس الهيدروجيني مع المسبار اختيارًا دقيقًا لمعلمات التصوير ، ومعايرة شاملة للصبغة ، ومعالجة دقيقة تستند إلى العتبة بعد معالجة بيانات الصورة. عندما تستخدم بشكل صحيح، تسمح هذه التقنية للتقييم السريع للدرجة الحموضة خارج الخلية في مناطق مختلفة من بيوفيلم وبالتالي رصد كل من التدرجات درجة الحموضة الأفقية والعمودية مع مرور الوقت. في حين أن استخدام المجهر التكوري يحد من Z-profiling إلى أغشية حيوية رقيقة تبلغ 75 ميكرومتر أو أقل ، فإن استخدام قياس نسبة الحموضة مناسب بشكل مثالي للدراسة غير الباضعة لعامل الفوعة الهام في الأغشية الحيوية عبر المملكة.

Introduction

تشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تضم كلا من الأنواع الفطرية والبكتيرية في العديد من الحالات المرضية في تجويف الفم. المبيضات spp. وكثيرا ما تم عزلها من الالتهابات اللاقانية1 ومن آفات اللثة2،3. في الالتهابات المخاطية ، ثبت أن الأنواع العقدية من مجموعة التهاب الخلايا العضوية تعزز تكوين البيوفيلم الفطري ، وغزو الأنسجة ، والنشر في كل من نماذج المختبر والمورين4،5،6،7. الأكثر إثارة للاهتمام، وقد ثبت النقل عن طريق الفم من المبيضات spp. أن تكون مرتبطة مع انتشار التسوس في الأطفال8. كما هو مبين في نماذج القوارض ، فإن العلاقة التكافلية بين الموكانات العقدية والمبيضات البيض تزيد من إنتاج السكريات خارج الخلية وتؤدي إلى تكوين أفلام حيوية أكثر سمكًا وأكثر مسرطنة9،10.

في جميع الظروف المذكورة أعلاه ، تسوس الطفولة المبكرة على وجه الخصوص ، فإن درجة الحموضة في بيوفيلم ذات أهمية لتطور المرض ، والدور البارز لمصفوفة الأغشية الحيوية لتطوير البيئات الدقيقة الحمضية11 يدعو إلى منهجيات تسمح بدراسة تغيرات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة. وقد وضعت بسيطة ودقيقة النهج القائمة على المجهر confocal لرصد درجة الحموضة داخل البكتيريا12 والفطرية13 الأغشية الحيوية. مع صبغة النسبة C-SNARF-4 والصورة المستندة إلى العتبة بعد المعالجة ، يمكن تحديد درجة الحموضة خارج الخلية في الوقت الحقيقي في جميع الأبعاد الثلاثة للبيوفيلم14. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات المنشورة لرصد درجة الحموضة المستندة إلى المجهر في الأغشية الحيوية ، فإن قياس نسبة الحموضة مع C-SNARF-4 بسيط ورخيص ، لأنه لا يتطلب تركيب الجسيمات أو المركبات التي تتضمن صبغة مرجعية15 أو استخدام الإثارة ذات الفوتونين 16. استخدام صبغة واحدة فقط يمنع مشاكل مع تقسيم التحقيق، الفلورسنت تنزف من خلال، والتبييض الانتقائي16،17،18 في حين لا يزال يسمح للتمييز موثوق بها بين داخل وخارج الخلية درجة الحموضة. وأخيرا، يتم تنفيذ الحضانة مع الصبغة بعد نمو بيوفيلم، والذي يسمح بدراسة كل من المختبر وفي الأغشية الحيوية المزروعة في الموقع.

والهدف من هذا العمل هو توسيع نطاق استخدام قياس نسب الحموضة وتوفير طريقة لدراسة تغيرات درجة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة. كدليل على المفهوم ، يتم استخدام الطريقة لمراقبة درجة الحموضة في الأنواع الحيوية المزدوجة التي تتكون من S. mutans وC. albicans المعرضة للجلوكوز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استعراض بروتوكول جمع اللعاب والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات في مقاطعة آرهوس (M-20100032).

1. زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة

  1. تنمو S. mutans DSM 20523 وC. albicans NCPF 3179 على لوحات أغار الدم في 37 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية.
  2. نقل مستعمرات واحدة من كل كائن حي لاختبار أنابيب مليئة 5 مل من ضخ قلب الدماغ (BHI). تنمو لمدة 18 ساعة في ظل الظروف الهوائية في 37 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها في 1200 × ز لمدة 5 دقيقة. تجاهل supernatant، إعادة تعليق الخلايا في المالحة الفسيولوجية وضبط OD550 نانومتر إلى 0.5 لC. albicans (~ 107 خلايا / مل) وS. mutans (~ 108 خلايا / مل). تمييع تعليق S. mutans 1:10 مع المالحة الفسيولوجية المعقمة (~ 107 خلايا / مل).
  4. ماسيت 50 ميكرولتر من محلول اللعاب المعقم، أعدت وفقا لطريقة دي جونغ وآخرون19،في الآبار من لوحة البصرية القاع 96-جيدا للمجهر. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. غسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من المالحة الفسيولوجية العقيمة. أفرغ الآبار
  5. إضافة 100 ميكرولتر من C. تعليق albicans إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة غسل 3x مع المالحة الفسيولوجية العقيمة.
    ملاحظة: لا تفرغ الآبار بالكامل أثناء الغسيل. ترك خزان من 20 ميكرولتر لتجنب قوات القص المفرطة.
  6. أضف 100 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنيني المعطل للحرارة (معطل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2 ح. غسل 3x مع المالحة الفسيولوجية العقيمة. إفراغ الآبار، وترك خزان من 20 ميكرولتر.
  7. أضف 100 ميكرولتر من تعليق S. mutans (أعدت في الخطوة 1.3) إلى كل بئر. أضف 150 ميكرولتر من BHI تحتوي على 5٪ السكروز. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر. عند زراعة الأفلام الحيوية القديمة، قم بتغيير المتوسط يوميًا إلى BHI الطازج. في نهاية مرحلة النمو الحيوي عبر المملكة، وغسل 5x مع المالحة الفسيولوجية العقيمة.

2. نسبة قياس درجة الحموضة التصوير

ملاحظة: يجب إجراء تصوير درجة الحموضة النسبةية مباشرة بعد اكتمال نمو الفيلم الحيوي.

  1. بالنسبة لتصوير درجة الحموضة النسبةية، استخدم مجهر مسح ليزر مقلوب مع عدسة غمر زيت أو ماء 63 x، وخط ليزر 543 نانومتر، ونظام تصوير طيفي (أي كاشف META) للسماح بتصوير الإشارات الفلورية المتداخلة. استخدم حاضنة لتدفئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية.
  2. ضبط الكاشف لضمان الكشف عن الفلورسين الأخضر من 576-608 نانومتر والكشف المتزامن عن الفلورسين الأحمر من 629−661 نانومتر. اختيار قوة الليزر المناسبة وكسب لتجنب الإفراط في التعرض.
    ملاحظة: من الأفضل مشاهدة التعرض للصور في صور اللوحة مع تلوين زائف.
  3. تعيين حجم الثقب إلى وحدة متجدد الهواء 1 أو شريحة بصرية من ~ 0.8 ميكرومتر. تعيين حجم الصورة إلى 512 × 512 بكسل وسرعة المسح الضوئي إلى 2. اختر متوسط سطر 2، باستخدام خيار الوسط.
    ملاحظة: في بداية سلسلة من التجارب، تحقق من أن إعدادات المجهر المختار يوفر تباين واضح بين الخلايا البكتيرية، جدران الخلايا الفطرية، مصفوفة بيوفيلم، والسيتوبلازم الفطرية.
  4. إعداد 100 ميكرولتر من المالحة الفسيولوجية العقيمة التي تحتوي على 0.4٪ (ث / v) من الجلوكوز، معتثّم إلى درجة الحموضة 7. إعداد حل الأسهم من C-SNARF-4 (1 mM في ثنائي ميثيل sulfoxide). أضف الصبغة إلى تركيز نهائي قدره 30 ميكرومتر.
    تنبيه: ارتداء قفازات النتريل عند التعامل مع صبغة النسبة.
  5. تفريغ أحد الآبار بفيلم بيوفير عبر المملكة، وترك خزان 20 ميكرولتر. أضف المالحة المعقمة التي تحتوي على الجلوكوز والصبغة النسبة. ضع لوحة 96-well على مرحلة المجهر وابدأ في تصوير الفيلم الحيوي.
  6. الحصول على صور واحدة أو Z-مداخن في مواقع مختلفة من biofilm. وضع علامة على موضع X-Y في برنامج المجهر لمتابعة تغييرات درجة الحموضة في مجالات معينة من الرؤية بمرور الوقت. على فترات منتظمة، التقاط الصور مع الليزر إيقاف لتصحيح لإزاحة كاشف.
  7. كرر الخطوات 2.4-2.6 لتحليل كل بيوفيلم يزرع في بئر مختلف.

3. معايرة الصبغة النسبةية

ملاحظة: يمكن إجراء معايرة الصبغة وتركيب منحنى المعايرة في يوم مختلف عن تصوير درجة الحموضة القياسية.

  1. إعداد سلسلة من 50 mM 2-morpholinothanesulfonic حمض (MES) العازلة تم تُتّخّت إلى درجة الحموضة 4.0−7.8 في خطوات من وحدات درجة الحموضة 0.2 في 35 درجة مئوية. ماسيت 150 ميكرولتر من كل محلول عازل في آبار لوحة بصرية القاع 96-well للفحص المجهري.
  2. أضف الصبغة إلى الآبار المملوءة بالمخزن المؤقت في لوحة 96 بئرًا إلى تركيز نهائي قدره 30 ميكرومترًا. اسمحوا equilibrate لمدة 5 دقيقة.
  3. تدفئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية. اختر نفس إعدادات المجهر كما هو الحال بالنسبة لتصوير درجة الحموضة النسبة. ضع لوحة 96-well على مسرح المجهر. التركيز على الجزء السفلي من الآبار. الحصول على صورتين (قناة خضراء وحمراء) لجميع المحاليل العازلة، 5 ميكرومتر فوق الجزء السفلي من البئر. على فترات منتظمة، التقاط الصور مع الليزر إيقاف لتصحيح لإزاحة كاشف.
  4. إجراء تجربة المعايرة في ثلاثية.
  5. تصدير كافة الصور كملفات TIF. استيرادها إلى برامج مخصصة لتحليل الصور (أي ImageJ20). طرح الصور التي اتخذت مع الليزر إيقاف من الصور ذات الصلة من حلول العازلة عن طريق النقر على عملية | حاسبة الصور | طرح).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، اقتصاص الصور للقضاء على القطع الأثرية على حدود الصورة عن طريق تنفيذ تحديد مستطيل ة باستخدام صورة | المحاصيل.
  6. تقسيم صور القناة الخضراء من خلال صور القناة الحمراء وحساب متوسط كثافة الفلورسينس في الصور الناتجة عن ذلك عن طريق النقر على تحليل | الرسم البياني.
  7. من التجارب ثلاثية، رسم متوسط نسب الأخضر/ الأحمر ضد درجة الحموضة. استخدم برنامجًا مخصصًا لملاءمة وظيفة لبيانات المعايرة (أي MyCurveFit).

4. تحليل الصور الرقمية

ملاحظة: يمكن إجراء تحليل الصور الرقمية في أي وقت بعد معايرة التصوير بالصبغة والرقم الهيدروجيني القياسي.

  1. تخزين الصور بيوفيلم القناة الخضراء والحمراء في مجلدات منفصلة وإعادة تسمية كل من سلسلة من الملفات مع أرقام متتابعة (على سبيل المثال، GREEN_0001). استيراد الصور إلى برنامج مخصص لتحليل الصور (أي ImageJ). انقر على تحليل | الرسم البياني لتحديد متوسط كثافة الفلورسينس في الصور التي اتخذت مع الليزر قبالة وطرح القيمة من الصور بيوفيلم بالنقر فوق عملية | الرياضيات | طرح.
  2. استيراد سلسلة الصور 2 في برنامج مخصص لتحليل الصور (أي daime21). إجراء تجزئة تستند إلى عتبة من صور القناة الحمراء(الجزء | التقسيم التلقائي | عتبة مخصصة). تعيين عتبة "منخفضة" فوق شدة الفلورسة من السيتوبلازم الفطرية وعتبة "عالية" تحت شدة جدران الخلايا الفطرية والبكتيريا.
    ملاحظة: عند اختيار العتبات المناسبة، يتم التعرف على المناطق خارج الخلية فقط ككائنات.
  3. نقل طبقة الكائن من سلسلة الصور المجزأة إلى سلسلة صور القناة الخضراء. للقيام بذلك، انقر فوق المقطع | نقل طبقة الكائن.
    ملاحظة: إذا كان التباين بين المناطق خارج الخلية والسيتوبلازم الفطري ضعيفًا جدًا في قنوات الألوان الفردية، فأضف سلسلة صور القناة الخضراء إلى سلسلة القنوات الحمراء قبل التقسيم بالنقر فوق تحرير | حاسبة الصور | بالإضافة إلى ذلك. قم بإجراء التقسيم كما هو موضح تحت 4.2 ونقل طبقة الكائن من سلسلة الصور المجزأة إلى كل من سلسلة صور القناة الخضراء والحمراء.
  4. توظيف محرر الكائن لحذف وحدات البكسل غير الكائن في سلسلة صور القناة الحمراء والخضراء(المصور المرئي | محرر الكائنات | في جميع الصور | حذف وحدات البكسل غير الكائن). الآن يتم مسح الصور بيوفيلم من كل من الخلايا البكتيرية والفطرية. تصدير سلسلة الصور المعالجة كملفات TIF.
  5. استيراد كل من سلسلة الصور إلى ImageJ. يقوم ImageJ بتعيين كثافة 0 إلى كافة وحدات البكسل غير الكائنة. إزالة تلك بكسل عن طريق تقسيم سلسلة الصور الحمراء (R1) في حد ذاته(عملية | حاسبة الصور | الصورة 1: R1; العملية: قسمة؛ صورة 2: R1)وضرب سلسلة الصور الناتجة (R2) مع سلسلة الصور الحمراء الأصلية(عملية | حاسبة الصور | الصورة 1: R1; العملية: ضرب؛ الصورة 2: R2). يتم إنشاء سلسلة صور ثالثة (R3) ، مطابقة لـ R1 ، باستثناء حقيقة أن NaN تم تعيينها إلى جميع وحدات البكسل بكثافة 0 في R1. المضي قدما بنفس الطريقة مع سلسلة الصور الخضراء.
  6. استخدام عامل تصفية "المتوسط"(عملية | مرشحات | يعني | نصف قطر | 1 بكسل) على سلسلة صور القناة الحمراء والخضراء للتعويض عن ضوضاء الكاشف. تقسيم سلسلة صور القناة الخضراء حسب سلسلة صور القناة الحمراء(عملية | حاسبة الصور | الصورة 1: G3; العملية: قسمة؛ الصورة 2: R3). تعرض سلسلة الصور الناتجة (G3/R3) النسبة الخضراء/الحمراء لكافة وحدات بكسل الكائن.
  7. حساب متوسط النسبة لكل صورة(تحليل | الرسم البياني). تطبيق التلوين كاذبة لتحسين التمثيل البصري للنسب في الصور(صورة | جداول البحث). تحويل النسب الخضراء / الحمراء إلى قيم درجة الحموضة توظيف وظيفة تركيبها تحت 3.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد 24 ساعة و 48 ساعة، تطورت الأغشية الحيوية عبر المملكة القوية في لوحات البئر. C. أظهرت albicans درجات متفاوتة من النمو الخيطي، وشكلت S. mutans مجموعات كثيفة تصل إلى 35 ميكرون في الارتفاع. أشارت الخلايا والسلاسل المفردة من الموتانات S. مجمعة حول التنويم المغناطيسي الفطري ، والمساحات الكبيرة بين الخلايا إلى وجود مصفوفة ضخمة(الشكل S1).

معايرة الصبغة النسبةية تسفر عن منحنى السيني غير متناظرة13،14. انخفض درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية بسرعة في أول 5 دقيقة بعد التعرض للجلوكوز بمعدلات مختلفة في مجالات الرؤية المجهرية المختلفة. بعد ذلك ، تباطأ التحمض ، وعادة ما تصل إلى قيم 5.5-5.8 بعد 15 دقيقة(الشكل 1). وأظهرت الأغشية الحيوية تكرار سلوك مماثل، مع اختلافات طفيفة فقط في متوسط درجة الحموضة(الشكل S2).

تعتمد دقة حسابات درجة الحموضة بشدة على الاختيار الدقيق لإعدادات الصورة أثناء الاستحواذ. بالنسبة للأفلام الحيوية المعنية ، أثبتت شريحة بصرية تبلغ 0.8 ميكرومتر أنها مثالية للحصول على أفضل تباين ممكن بين المناطق خارج الخلية والسيتوبلازم الفطري(الشكل S3). وعلاوة على ذلك، فإن حجم البكسل 0.28 ميكرومتر(الشكل S4)،ووقت البكسل الذي يبلغ 102.4 ميكرون(الشكل S5)،ومتوسط خط 2(الشكل S6)قدم تباينًا جيدًا إلى جانب وقت شراء صورة مقبول يبلغ ~ 1 دقيقة. أثناء معالجة الصور، تمت إزالة جميع الخلايا البكتيرية والفطرية من الصور، في حين تم تضمين معظم المناطق المحيطة خارج الخلية في تحليل درجة الحموضة اللاحقة. اعتمادا على سطوع الصور ، وكان لا بد من اختيار مختلف العتبات العليا والسفلى(الشكل 2).

تم تسجيل بيانات الرقم الهيدروجيني المبينة في الشكل 1 والشكل S2 5 ميكرومتر من واجهة biofilm-substratum. مع زيادة المسافة من الركيزة ، واعتمادا على كثافة الخلايا في الأغشية الحيوية ، تنخفض كثافة الفلورية ، مما يؤدي إلى انخفاض التباين بين الخلايا والمصفوفة. ومع ذلك ، في الأغشية الحيوية رقيقة (~ 35 ميكرون) نمت في هذه الدراسة ، وعلى النقيض من أعلى بيوفيلم يسمح تحليل الصورة موثوق بها(الشكل S7A).

Figure 1
الشكل 1: استخدام قياس نسبة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة المعرضة للجلوكوز. (أ)تم تصوير حقل رؤية في فيلم بيوفيلم ملطخ بالمجهر المُتَّكَّر، وأزيلت المنطقة التي تغطيها الخلايا البكتيرية والفطرية قبل التحليل القياسي. (ب)تم حساب درجة الحموضة في المساحة خارج الخلية وتصورها باستخدام جدول بحث (16 لونًا). مقياس القضبان = 20 ميكرون . (C) درجة الحموضة في 24 ساعة عبر المملكة biofilms انخفض بسرعة عند التعرض للجلوكوز بمعدلات مختلفة قليلا في مجالات مختلفة من الرؤية. أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري (SD). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تجزئة الصور المستندة إلى العتبة للأفلام البيولوجية الملونة. بسبب تغيرات الرقم الهيدروجيني المحلية ، تتغير كثافة الفلورسينس في الأفلام الحيوية بمرور الوقت. (أ)و(ب)تظهر نفس المجال المجهري للعرض بعد 1 دقيقة و 15 دقيقة من التعرض للجلوكوز، على التوالي. أثناء تجزئة الصورة ، يجب اختيار العتبات العالية والمنخفضة بشكل كاف ٍ للقضاء على جميع المناطق التي تغطيها الخلايا البكتيرية والفطرية. (ج)تم القضاء على المناطق الزرقاء بالعتبة المنخفضة (40)، والمناطق الحمراء بالعتبة العالية (115). (د)تم التعرف على المناطق خارج الخلية فقط ككائنات (محاطة بخطوط برتقالية). (E)بعد القضاء على المنطقة التي تغطيها الخلايا الميكروبية ، يمكن إجراء حساب درجة الحموضة في مصفوفة البيوفيلم. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 1
الشكل S1: نموذجي 24 ساعة عبر المملكة بيوفيلم ملطخة مع صبغة النسبة. العديد من الخلايا C. albicans عرض نمو خيطي، في حين S. mutans (الأصفر) شكلت الخلايا مجموعات كثيفة أو المترجمة حول hyphae الفطرية كخلايا واحدة أو سلاسل. أشارت المساحات الكبيرة بين الخلايا إلى وجود مصفوفة بيوفيلم ضخمة. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 2
الشكل S2: تطور درجة الحموضة في 24 ساعة عبر المملكة الأغشية الحيوية المعرضة للجلوكوز. (أ)،(ب)،و(ج)تم تحديد درجة الحموضة نسبة القياس في ثلاثة أفلام بيولوجية تكرار لمدة 15 دقيقة بعد التعرض للجلوكوز. بعد انخفاض سريع في درجة الحموضة في أول 5 دقيقة، تباطأ التحمض، وتم الوصول إلى مستويات 5.5−5.8 بعد 15 دقيقة. ولوحظت معدلات مختلفة قليلاً في مجالات الرؤية المجهرية المختلفة (كل منها يمثله خط). تم إجراء معايرة مسبار قياس النسبة مرة واحدة فقط. أشرطة الخطأ = SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 3
الشكل S3: تأثير سمك الشريحة البصرية على تباين الصورة. تم الحصول على صور من الأغشية الحيوية الملونة مع (A) حجم الثقب من 2 وحدات متجدد الهواء وسمك شريحة بصرية من 1.6 ميكرومتر ، و(B)1 وحدة متجدد الهواء وشريحة بصرية من 0.8 ميكرون. في 1 وحدة متجدد الهواء، كانت هناك حاجة إلى أعلى قوة ليزر / كسب للحصول على صورة، ولكن تحسن التباين بين السيتوبلازم الفطرية والمناطق خارج الخلية. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 4
الشكل S4: تأثير الدقة على تباين الصورة. تم الحصول على صور الأفلام الحيوية الملونة بأحجام بكسل(A)1.12 ميكرومتر ،(B)0.56 ميكرومتر ،(C)0.28 ميكرومتر ،(D)0.14 ميكرومتر ، و(E)0.11 ميكرومتر. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 5
الشكل S5: تأثير سرعة المسح الضوئي على تباين الصورة. تم الحصول على صور الأفلام الحيوية الملونة مع أوقات البكسل من (A) 12.8 μs ،(B)25.6 μs ،(C)51.2 μs ،(D)102 μs ، و(E)164 μs. لم تحسن زيادة وقت البكسل إلى ما بعد 102 μs التباين بين المناطق خارج الخلية وداخل الخلايا. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 6
الشكل S6: تأثير المتوسط على تباين الصورة. تم الحصول على صور من الأغشية الحيوية الملونة مع متوسطات خط (متوسط) من (A) 1 ،(B)2 ، و(C)4. وقدم متوسط خط 2 أفضل حل وسط بين التباين ووقت الاستحواذ. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplemental Figure 7
الشكل S7: تباين الصورة في الأغشية الحيوية الفطرية البحتة والأغشية الحيوية عبر المملكة. (أ)تم تصوير الجزء العلوي من بيوفيلم ملون عبر المملكة 30 ميكرومتر من الواجهة. كان التباين بين المناطق خارج الخلية وداخل الخلايا أقل مما كان عليه في قاعدة بيوفيلم ولكنه لا يزال كافياً لتحليل درجة الحموضة قياساً. (ب)تم تصوير C. albicans أحادية الأنواع بيوفيلم لقياس نسبة درجة الحموضة. ويمكن زيادة قوة الليزر / كسب لتحسين التباين بين جدران الخلايا الفطرية والسيتوبلازم. (C)في الأغشية الحيوية عبر المملكة، حالت البكتيريا الفلورية الزاهية دون زيادة المزيد من قوة الليزر / الكسب. وبالتالي ، فإن التباين بين جدران الخلايا الفطرية والسيتوبلازم أقل وضوحًا مما هو عليه في الأفلام الحيوية الفطرية البحتة. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكولات مختلفة لزراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تنطوي على C. albicans وStreptococcus spp. ومع ذلك ، يركز الإعداد الحالي على ظروف النمو البسيطة ، وجدول زمني متوافق مع أيام العمل العادية ، وتكوين الأنواع المتوازن ، وتطوير مصفوفة بيوفيلم ضخمة. وعلاوة على ذلك، كانت لوحات 96-well مغلفة بمحلول اللعابي لمحاكاة الظروف الفموية للالتصاق إلى حد ما.

استخدام قياس نسبة درجة الحموضة مع C-SNARF-4 هو طريقة غير مكلفة للقياسات السريعة للدرجة الحموضة بيوفيلم، مزايا وعيوب التي نوقشت بالتفصيل في مكان آخر12،26. باختصار ، تسمح هذه التقنية بتقييم درجة الحموضة في مواقع مختلفة داخل الأغشية الحيوية وبالتالي مراقبة تدرجات الحموضة الأفقية وتطورات درجة الحموضة بمرور الوقت27. يمكن تسجيل الملامح الرأسية للدرجة الحموضة أيضًا ، ولكن عمق الاختراق محدود باستخدام المجهر البؤري. وبالتالي ، يمثل قياس نسبة درجة الحموضة بديلًا أسرع وأكثر تنوعًا وأقل غزوًا للأقطاب الكهربائية الدقيقة للدرجة الهيدروجينية ، والتي هي حاليًا الطريقة المفضلة لتوصيف Z من الأغشية الحيوية السميكة28. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب القائمة على المجهر لتسجيلات درجة الحموضة في الأغشية الحيوية ، قياس نسبة الحموضة مع C-SNARF-4 لديه ميزة استخدام وصمة عار واحدة فقط. لذلك ، يتم التحايل على العديد من المشاكل التي قد تنشأ عن السلوك الفلوري التفاضلي والتفاعل بين الأصباغ المختلفة26.

في الأغشية الحيوية عبر المملكة، يثير التمايز القائم على العتبة بين الكتلة الحيوية الميكروبية والمناطق خارج الخلية بعض المشاكل بالمقارنة مع الأغشية الحيوية التي تضم الخلايا البكتيرية أو الفطرية فقط. الخلايا البكتيرية استيعاب صبغة نسبة وعرض إشارة الفلورسنت مشرق بالمقارنة مع مصفوفة بيوفيلم، ولكن أيضا بالمقارنة مع جدران الخلايا الفطرية. جدران الخلايا الفطرية تبدو أكثر إشراقا إلى حد ما من مصفوفة بيوفيلم، والتي بدورها تظهر أعلى الفلورسة من السيتوبلازم الفطرية. في الأغشية الحيوية التي تتكون فقط من الخلايا الفطرية ، يمكن الحصول على الصور بقوة / مكسب ليزر عالية ، مما يؤدي إلى تباين كاف بين مصفوفة الأغشية الحيوية والسيتوبلازم الفطري(الشكل S7B). عندما تكون البكتيريا موجودة ، يجب تقليل قوة الليزر / الكسب لتجنب التعرض المفرط للخلايا البكتيرية(الشكل S7C). وبالتالي ، فإن التباين بين السيتوبلازم الفطري والمناطق خارج الخلية ليس واضحًا ، ويجب اختيار إعدادات الصورة مثل حجم الثقب وحجم البكسل ووقت البكسل مع عناية كبيرة لتحليل النسبة.

أما بالنسبة لجميع التقنيات القائمة على المجهر ، ونوعية الصورة ووقت اكتساب ترتبط ارتباطا عكسيا. في الأغشية الحيوية الحالية عبر المملكة ، كان وقت التصوير من ~ 30 ث ، من الناحية المثالية 1 دقيقة ، ضروريًا للحصول على جودة مناسبة لتحليل درجة الحموضة اللاحقة. بالمقارنة، يمكن تصوير الأغشية الحيوية التي لا تحتوي إلا على البكتيريا ذات جودة كافية في 10 ق أو أقل29. بالنسبة لتحليلات المجهر لنمو الفيلم الحيوي أو هيكله أو تكوينه ، فإن أوقات الاستحواذ التي تبلغ دقيقة واحدة لا تشكل مشكلة ، وفي كثير من الحالات ، قد ينطبق هذا أيضًا على تسجيلات درجة الحموضة. ومع ذلك، من الصعب رصد التغيرات الشديدة في درجة الحموضة، مثل التحمض السريع الذي لوحظ مباشرة بعد التعرض للجلوكوز (وحدة واحدة/دقيقة)، في الأغشية الحيوية عبر المملكة.

يوضح العمل الحالي أن تسجيلات درجة الحموضة النسبةية مع C-SNARF-4 ممكنة في الأفلام الحيوية عبر المملكة المكونة من S. mutans وC. albicans. قد تستخدم الدراسات المستقبلية طريقة لتحليل تغيرات درجة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة مع تنوع أكبر للأنواع ، خاصة في الأفلام الحيوية التي تزرع في الموقع (أي في الأطفال الذين يعانون من تسوس الطفولة المبكرة)30. في هذه الدراسة ، تم رصد درجة الحموضة في الأغشية الحيوية في ظل ظروف ثابتة ولفترة مراقبة محدودة من 15 دقيقة ، مباشرة بعد نبض الجلوكوز. مزيد من التقدم قد تشمل تطبيق تدفق السوائل لتقليد في ظروف الموقع بشكل أوثق14،31،32. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام قياس نسبة الحموضة لدراسة تأثير الظروف الغذائية المختلفة على التغيرات طويلة الأجل في درجة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة والمساهمة في توضيح تأثير درجة الحموضة في الأغشية الحيوية على الأنسجة المضيفة الأساسية. مرة أخرى ، قد يكون إزالة المعادن من مينا الأسنان في تسوس الطفولة المبكرة بمثابة مثال بارز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ومن المسلم به أنيت Aakjær تومسن وخافيير غارسيا لدعم فني ممتاز. يشكر المؤلفون روبنز سبين نيتو على المناقشات المثمرة حول تحليل الصور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 155، البكتيريا، بيوفيلم، المبيضات ألبيكانس،confocal الليزر المجهر المسح الضوئي، عبر المملكة، تسوس الطفولة المبكرة، والفطريات، وقياس نسبة الحموضة، العقدية المكورات العنقودية،الخميرة
رصد درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر كونكوالبؤر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlafer, S., Frost Kristensen, M.… More

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter