Summary
このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスとストレプトコッカス・ミュータンスからなるクロスキングダムバイオフィルムの栽培を記述し、これらのバイオフィルム内の細胞外pHを監視するための共焦点顕微鏡ベースの方法を提示する。
Abstract
真菌細胞と細菌細胞の両方からなるクロスキングダムバイオフィルムは、歯内感染症、歯中炎、粘膜感染症、特に幼児期のうねりなど、さまざまな口腔疾患に関与しています。これらの条件の全てにおいて、バイオフィルムマトリックス中のpHは微生物と宿主の相互作用に影響を及ぼし、ひいては疾患進行に影響を及ぼす。本プロトコルは、カンジダ・アルビカンスおよび連鎖球菌ミュータンを含むクロスキングダムバイオフィルム内のpHダイナミクスをモニターする共焦点顕微鏡ベースの方法を記述する。pH依存性デュアルエミッションスペクトルとレシオメトリックプローブC-SNARF-4の染色特性は、バイオフィルムの細胞外領域におけるpHの低下を決定するために利用される。プローブでpHレシオメトリーを使用するには、細心の注意を払った画像パラメータの選択、染料の完全なキャリブレーション、および画像データの慎重な閾値ベースの後処理が必要です。正しく使用すれば、バイオフィルムの異なる領域における細胞外pHの迅速な評価が可能になり、時間の経過とともに水平および垂直の両方のpH勾配を監視することができます。共焦点顕微鏡の使用は、75 μm以下の薄いバイオフィルムに対するZプロファイリングを制限する一方で、pHレシオメトリーの使用は、界を越えたバイオフィルムにおける重要な毒性因子の非侵襲的研究に理想的に適している。
Introduction
真菌種および細菌種の両方を含む界を横断するバイオフィルムは、口腔内のいくつかの病理学的状態に関与している。カンディダ属は、頻繁に歯内感染症1および歯周病変2、3から単離されている。粘膜感染症において、ミツチス群由来のレンサ球菌種は、インビトロモデルおよびマウスモデル4、5、6、7の両方で真菌バイオフィルム形成、組織浸潤、および播種を増強することが示されている。最も興味深いことに、カンディダsppの経口運送は、子供8における齲虫の蔓延に関連することが証明されている。げっ歯類モデルに示すように、レンサ球菌ミュータンとカンジダスアルビカンスとの共生関係は、細胞外多糖の産生を増加させ、より厚く、より多くの齲蝕性バイオフィルム9、10の形成をもたらす。
上記のすべての条件において、特に幼児期のうねりは、疾患進行にとってバイオフィルムpHが重要であり、および、酸性マイクロ環境の開発のためのバイオフィルムマトリックスの著しい役割を有し、11は、クロスキングダムバイオフィルム内のpH変化を研究することを可能にする方法論を求めている。細菌12および真菌13のバイオフィルムの中のpHを監視するための簡単で正確な共焦点顕微鏡ベースのアプローチが開発されている。レシオメトリック色素C-SNARF-4と閾値ベースの画像後処理により、細胞外pHはバイオフィルム14の3次元すべてにおいてリアルタイムに決定することができる。バイオフィルムにおける顕微鏡ベースのpHモニタリングに関する他の公開技術と比較して、C-SNARF-4によるpHレシオメトリーは、参照色素15を含む粒子または化合物の合成または2光子励起16の使用を必要としないため、簡便かつ安価である。1つの染料を使用するだけで、プローブ区画化、蛍光ブリードスルー、選択的漂白16、17、18の問題を防ぎ、細胞内pHと細胞外pHの間で信頼性の高い差別化を可能にします。最後に、色素を用いたインキュベーションは、バイオフィルムの成長後に行われ、実験室とその場で成長したバイオフィルムの両方を研究することができます。
本研究の目的は、pHレシオメトリーの使用を拡張し、界を越えたバイオフィルムのpH変化を研究する方法を提供することである。概念実証として、この方法は、グルコースにさらされたS.ミュータンとC.アルビカンスからなる二重種バイオフィルムのpHを監視するために使用される。
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Protocol
唾液採取の議定書はオーフス郡の倫理委員会(M-20100032)によって審査され承認された。
1. クロスキングダムバイオフィルムの栽培
- 有酸素条件下で37 °Cの血の寒天の版のS.ミュータンDSM 20523およびC.アルビカンスNCPF 3179を成長させる。
- 脳心臓注入(BHI)の5 mLで満たされた試験管に各生物の単一コロニーを移管する。37 °Cで好気条件下で18時間成長します。
- 上清を捨て、生理食塩水で細胞を再懸濁し、C.アルビカンス(約107細胞/mL)とS.ミュータン(約108細胞/mL)の場合は、OD550 nmを0.5に調整します。S.ミュータンス懸濁液1:10を無菌生理食塩水(〜107細胞/mL)で希釈します。
- ピペット50μLの滅菌唾液は、デ・ジョンら19の方法に従って調製され、顕微鏡検査用の光学底96ウェルプレートのウェルに調製される。37 °Cで30分間インキュベートします。ウェル3xを100μLの無菌生理食塩水で洗浄します。井戸を空にします。
- 各ウェルにC.アルビカンスサスペンションの100 μLを追加します。37 °Cで90分間インキュベートし、滅菌生理食塩水で3倍洗浄します。
注:洗濯中に井戸を完全に空にしないでください。せん断力を避けるために20μLの貯留部を残してください。 - 熱不活性化ウシのウシ血清(56°Cで30分間不活性化)を各ウェルに100μL加えます。37 °Cで2時間インキュベートし、滅菌生理食塩水で3倍洗浄します。20 μLの貯蔵所を残して、井戸を空にします。
- 各ウェルにS.ミュータンスサスペンション(ステップ1.3で準備)を100μL加えます。5%のショ糖を含むBHIの150 μLを加えます。37 °Cで24時間以上インキュベートします。古いバイオフィルムを栽培する場合は、毎日培地を新鮮なBHIに変更してください。クロスキングドバイオフィルム成長期の終わりに、滅菌生理食塩水で5倍洗浄する。
2. レシオメトリックpHイメージング
注:レシオメトリックpHイメージングは、バイオフィルムの成長が完了した直後に行う必要があります。
- レシオメトリックpHイメージングでは、63倍の油または水浸漬レンズ、543nmレーザー線、およびスペクトルイメージングシステム(すなわち、META検出器)を用いて、重なり合う蛍光信号のイメージングを可能にする反転共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。インキュベーターを使用して顕微鏡ステージを35°Cまで温める。
- 検出器を設定して、576-608 nm からの緑色蛍光検出と 629-661 nm からの赤色蛍光の同時検出を確認します。露出過多や過少露光を避けるために、適切なレーザーパワーとゲインを選択します。
注:画像の露出は、間違った着色を持つパレット画像で最もよく見られます。 - ピンホールサイズを1エアリーユニットに設定するか、光学スライスを~0.8 μmに設定します。平均オプションを使用して、行平均 2 を選択します。
メモ:一連の実験の開始時に、選択した顕微鏡設定が細菌細胞、真菌細胞壁、バイオフィルムマトリックス、および真菌細胞質の間の明確なコントラストを提供することを確認してください。 - グルコースの0.4%(w/v)を含む無菌生理食塩水の100μLを調製し、pH7に滴定した。C-SNARF-4(ジメチルスルホキシド中1mM)のストック溶液を調製する。染料を30μMの最終濃度に加えます。
注意: レシオメトリック染料を扱う際は、ニトリル手袋を着用してください。 - クロスキングダムバイオフィルムで井戸の1つを空にし、20 μLの貯蔵所を残し、グルコースとレシオメトリック色素を含む無菌生理食分を加えます。96ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、バイオフィルムのイメージングを開始します。
- バイオフィルムの異なる場所で単一の画像またはZスタックを取得します。顕微鏡ソフトウェアでX-Y位置をマークし、時間の経過とともに特定の視野でpHの変化に従うようにします。定期的に、レーザーをオフにして画像を撮影し、検出器のオフセットを補正します。
- 異なるウェルで成長した各バイオフィルムの分析について、ステップ 2.4 ~2.6 を繰り返します。
3. レシオメトリック色素の校正
メモ:色素のキャリブレーションとキャリブレーション曲線のフィッティングは、レシオメトリックpHイメージングとは異なる日に実行できます。
- 50 mM 2-モルフォリノエタンスルホン酸(MES)の一連のバッファーをpH 4.0-7.8に滴定して、35°Cで0.2 pH単位で調製する。顕微鏡検査用光学底96ウェルプレートのウェルに各バッファー溶液のピペット150μL。
- 96ウェルプレートのバッファー充填ウェルに染料を加え、最終濃度30μMにします。5分間平衡を取りましょう。
- 顕微鏡ステージを35°Cに温める。レシオメトリックpHイメージングと同じ顕微鏡設定を選択します。96ウェルプレートを顕微鏡ステージに置きます。井戸の底に焦点を当てます。すべてのバッファソリューションに対して、ウェルの底部から5μm上の2つの画像(緑と赤のチャンネル)を取得します。定期的に、レーザーをオフにして画像を撮影し、検出器のオフセットを補正します。
- 三重でキャリブレーション実験を行います。
- すべてのイメージを TIF ファイルとしてエクスポートします。専用の画像解析ソフトウェア(ImageJ20)にインポートします。[プロセス] をクリックして、バッファソリューションのそれぞれの画像からレーザーをオフにして撮影した画像を差し引きます。イメージ電卓 |減算します)。
注: 必要に応じて、画像をトリミングして、画像|トリミング. - 緑色のチャンネル画像を赤チャンネル画像で分割し、[Analyze]をクリックして、結果の画像の平均蛍光強度を計算します。ヒストグラム.
- 三重実験から、pHに対する平均緑/赤比をプロットします。専用のソフトウェアを使用して、キャリブレーションデータ(MyCurveFit)に機能を適合させます。
4. デジタル画像解析
メモ:デジタル画像解析は、色素とレシオメトリックpHイメージングのキャリブレーション後、いつでも実行できます。
- 緑と赤のチャンネルのバイオフィルム画像を別々のフォルダに保存し、連続する番号(例えば、GREEN_0001)を持つファイルの両方の名前を変更します。画像を専用の画像分析ソフトウェア(ImageJ)にインポートします。[分析|ヒストグラムは、レーザーをオフにして撮影した画像の平均蛍光強度を決定し、プロセスをクリックしてバイオフィルム画像から値を引く |数学|減算.
- 2 つの画像シリーズを専用画像解析ソフトウェア (daime21)にインポートします。赤チャンネル画像のしきい値ベースのセグメンテーションを実行する(Segment |自動セグメンテーション|カスタムしきい値)。真菌細胞質の蛍光強度を上回る「低」閾値と、真菌細胞壁および細菌の強度を下回る「高」閾値を設定する。
メモ:適切なしきい値を選択すると、細胞外領域のみがオブジェクトとして認識されます。 - セグメント化された画像シリーズのオブジェクトレイヤーを、緑のチャンネル画像シリーズに転送します。これを行うには、[セグメント|オブジェクト レイヤーを転送します。
注: 細胞外領域と真菌細胞質のコントラストが個々のカラーチャンネルで弱すぎる場合は、[編集] をクリックして、セグメンテーションの前に緑色のチャンネル画像シリーズを赤チャンネルシリーズに追加します。画像計算機|追加.4.2 で説明されているようにセグメンテーションを実行し、セグメント化されたイメージシリーズのオブジェクト レイヤーを緑と赤の両方のチャンネル イメージ シリーズに転送します。 - オブジェクトエディタを使用して、赤と緑のチャンネル画像シリーズのオブジェクト以外のピクセルを削除します (ビジュアライザー |オブジェクトエディタ|すべての画像で|オブジェクト以外のピクセルを削除する)。今バイオフィルム画像は、細菌および真菌細胞の両方からクリアされます。処理されたイメージシリーズを TIF ファイルとしてエクスポートします。
- 両方のイメージ シリーズを ImageJ にインポートします。ImageJ は、オブジェクト以外のすべてのピクセルに 0 の強度を割り当てます。赤の画像シリーズ(R1)をそれ自体で割って、これらのピクセルを削除します(プロセス|画像計算機|画像 1: R1;操作: 除算;図2:R1)、生成された画像系列(R2)と元の赤画像系列を乗算する(プロセス|画像計算機|画像 1: R1;操作: 乗算します。イメージ 2: R2)。R1 の 3 番目のイメージ シリーズ(R3)は、R1 の強度が 0 のすべてのピクセルに NaN が割り当てられている点を除いて、R1 と同一の 3 番目のイメージ シリーズが作成されます。緑の画像シリーズと同じ方法で進みます。
- [平均] フィルタを使用する (プロセス|フィルター |平均|半径|1ピクセル)検出器のノイズを補正するために、赤と緑のチャンネル画像シリーズに。緑のチャンネル画像シリーズを赤チャンネル画像シリーズで分割します (プロセス|画像計算機|画像 1: G3;操作: 除算;イメージ 2: R3)。生成されたイメージシリーズ(G3/R3)は、すべてのオブジェクトピクセルの緑/赤の比率を示します。
- 各画像の平均比を計算する (分析|ヒストグラム。画像の比率をより良く視覚的に表現するために偽の着色を適用する(画像|ルックアップ テーブル緑と赤の比率を、3.6以下に適合した関数を採用したpH値に変換します。
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Representative Results
24時間と48時間後、ウェルプレートで開発された堅牢なクロスキングバイオフィルム。C.アルビカンスは様々な程度の糸状成長を示し、S.ミュータンは高さ35μmまでの密なクラスターを形成した。真菌ヒパエの周りにグループ化された単一細胞およびS.ミュータンの鎖、および大きな細胞間空間は、ボリュームマトリックスの存在を示した(図S1)。
レシオメトリック色素の較正は、非対称的なシグモイド曲線13、14をもたらす。バイオフィルム中の細胞外pHは、異なる顕微鏡的視野で異なる速度でグルコースに曝露した後、最初の5分で急速に低下した。その後、酸性化は遅くなり、通常は15分後に5.5~5.8の値に達する(図1)。バイオフィルムの反復は、平均pHのわずかな変動しか示さなかった(図S2)。
pH計算の精度は、取得中の画像設定の慎重な選択に強く依存しています。問題のバイオフィルムの場合、0.8 μmの光学スライスは、細胞外領域と真菌細胞質との間の最良のコントラストを得るのに理想的であることが判明した (図 S3)。また、0.28μmのピクセルサイズ(図S4)、画素のドウェル時間は102.4μs(図S5)、線平均2(図S6)は、許容可能な画像取得時間〜1minと良好なコントラストを示した。画像後処理の間、すべての細菌および真菌細胞が画像から除去され、周囲の細胞外領域のほとんどはその後のpH分析に含まれていた。画像の明るさに応じて、上下のしきい値を選択する必要がありました (図 2)。
図1および図S2に示すpHデータを、バイオフィルム-サブストラタム界面から5μm記録した。基質からの距離が増加すると、バイオフィルム中の細胞密度に依存して、蛍光強度が低下し、細胞とマトリックスとの間のコントラストが低くなる結果となる。しかし、本研究で成長した薄いバイオフィルム(〜35μm)では、バイオフィルムの上部でのコントラストは信頼性の高い画像解析を可能にした(図S7A)。
図1:グルコースに曝露されたクロスキングバイオフィルムにおけるpHレシオメトリーの使用(A)染色されたバイオフィルム中の視野を共焦点顕微鏡で画像化し、細菌および真菌細胞で覆われた領域をレシオメトリック分析の前に除去した。(B) 細胞外空間のpHをルックアップテーブル(16色)を用いて算出・可視化した。スケールバー = 20 μm. (C) 24 時間のクロスキングバイオフィルムの pH は、異なる視野でわずかに異なる速度でグルコースに曝露すると急速に低下した。誤差範囲 = 標準偏差 (SD)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:染色されたバイオフィルムの閾値ベースの画像セグメンテーション。局所的なpH変化により、バイオフィルムの蛍光強度は時間の経過とともに変化します。(A)及び(B)は、それぞれグルコースへの暴露の1分および15分後に同じ顕微鏡視野を示す。画像セグメンテーション中、細菌および真菌細胞で覆われたすべての領域を排除するために、高閾値と低閾値を適切に選択する必要があります。(C)青の領域は低い閾値(40)によって排除され、赤色の領域は高い閾値(115)によって排除された。(D)細胞外領域のみがオブジェクトとして認識されました (オレンジ色の線で囲まれています)。(E) 微生物細胞で覆われた領域を排除した後、pH計算をバイオフィルムマトリックスで行うことができる。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S1:レシオメトリック色素で染色された典型的な24時間のクロスキング・バイオフィルム。多くのC.アルビカン細胞は糸状増殖を示し、S.ミュータン(黄色)細胞は単一細胞または鎖として真菌ヒパエの周りに密なクラスターまたは局在を形成した。大きな細胞間空間は、ボリュームのあるバイオフィルムマトリックスの存在を示した。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図S2:グルコースに曝露した24時間のクロスキングバイオフィルムにおけるpHの開発。(A) (B) および (C) pHは、グルコースに曝露した後、15分間のバイオフィルムを3回複製して比を測定した。最初の5分で急速なpH低下が起き、酸性化が遅くなり、15分後に5.5-5.8のレベルに達した。レシオメトリックプローブの較正は一度だけ行った。エラー バー = SD.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 S3: 光学スライスの厚さが画像コントラストに及ぼす影響染色されたバイオフィルムの画像は、(A)2エアリーユニットのピンホールサイズと1.6μmの光学スライス厚さ、(B)1エアリーユニット、光学スライス0.8μmで取得した。1 Airy Unitでは、画像取得に高いレーザーパワー/ゲインが必要でしたが、真菌細胞質と細胞外領域のコントラストが向上しました。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 S4: 解像度が画像のコントラストに与える影響染色されたバイオフィルムの画像は、ピクセルサイズ(A)1.12μm、(B)0.56μm、(C)0.28μm、(D)0.14μm、(E)0.11μm未満のピクセルサイズの減少で得られたが、細胞外領域と真菌性細胞質とのコントラストは改善しなかった。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 S5: 画像のコントラストに対するスキャン速度の影響染色されたバイオフィルムの画像は、ピクセルドウェル時間(A)12.8μs、(B)25.6μs、(C)51.2μs、(D)102μs、および(E)164μsのピクセルドウェル時間を増加させることで、細胞外と細胞内領域のコントラストを改善しなかった。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 S6: 平均化が画像のコントラストに与える影響染色されたバイオフィルムの画像は、(A)1、(B)2、及び(C)4の線平均(平均)で取得した。ライン平均 2 は、コントラストと取得時間の間で最適な妥協点を提供しました。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 S7: 純粋に真菌バイオフィルムとクロスキングダムバイオフィルムにおける画像コントラスト(A)染色されたクロスキングダムバイオフィルムの上部を、界面から30μmで画像化した。細胞外と細胞内の領域のコントラストは、バイオフィルムベースよりも低かったが、レシオメトリックpH分析には依然として十分であった。(B) A C. アルビカンスモノ種バイオフィルムを pH レシオレシオメトリー用に画像化した。レーザーパワー/ゲインを増加させ、真菌細胞壁と細胞質のコントラストを最適化することができます。(C) クロスキングダムバイオフィルムでは、明るく蛍光性の細菌がレーザーパワー/ゲインのさらなる増加を妨げた。したがって、真菌細胞壁と細胞質の対比は、純粋に真菌バイオフィルムよりも顕著ではない。スケールバー = 20 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
C.アルビカンスとストレプトコッカスSppを含むクロスキングダムバイオフィルムの栽培のための異なるプロトコルは、以前に説明されている9、22、23、24、25。しかし、本セットアップでは、単純な成長条件、通常の営業日と互換性のあるタイムスケジュール、バランスのとれた種組成、および膨大なバイオフィルムマトリックスの開発に焦点を当てています。さらに、96ウェルプレートは、ある程度接着の口腔条件を模倣するために唾液溶液でコーティングされた。
C-SNARF-4によるpHレシオメトリーの使用は、バイオフィルムpHの迅速な測定のための安価な方法であり、その利点と欠点は、他の場所で詳細に議論されている12、26である。簡単に言えば、この技術は、バイオフィルム内の異なる場所でのpHの評価を可能にし、したがって、時間27の間に水平pH勾配およびpHの発達の監視を可能にする。垂直pHプロファイルも記録できますが、浸透深さは共焦点顕微鏡の使用によって制限されます。したがって、pHレシオメトリーは、pH微小電極に対するより速く、より汎用性の高い、かつ侵襲性の低い代替を表し、現在、厚いバイオフィルム28のZプロファイリングのための選択の方法である。バイオフィルムにおけるpH記録のための他の顕微鏡ベースの方法と比較して、C-SNARF-4によるpHレシオメトリーは、1つの染色のみを採用するという利点を有する。したがって、異なる色素間の差動蛍光挙動および相互作用から生じる可能性のあるいくつかの問題は、26を回避する。
クロスキングダムバイオフィルムでは、微生物バイオマスと細胞外領域の間の閾値ベースの分化は、細菌または真菌細胞のみを含むバイオフィルムと比較していくつかの問題を提起する。細菌細胞は、レシオメトリック色素を内在化し、バイオフィルムマトリックスと比較して明るい蛍光シグナルを表示するが、真菌細胞壁と比較した。真菌細胞壁は、バイオフィルムマトリックスよりもやや明るく見え、これは真菌細胞質よりも高い蛍光を示す。真菌細胞のみで構成されるバイオフィルムでは、高いレーザーパワー/ゲインで画像を取得でき、バイオフィルムマトリックスと真菌細胞質との間に十分なコントラストが得られます(図S7B)。細菌が存在する場合、細菌細胞の過度の露出を避けるためにレーザーパワー/ゲインを低減する必要があります(図S7C)。したがって、真菌細胞質と細胞外領域のコントラストは顕著ではなく、ピンホールサイズ、ピクセルサイズ、ピクセルドウェル時間などの画像設定は、レシオメトリック分析に細心の注意を払って選択する必要があります。
すべての顕微鏡ベースの技術に関しては、画像の品質と取得時間は逆相関しています。本界クロスキングバイオフィルムでは、撮像時間が〜30s、理想的には1分間、その後のpH分析に適した品質を得る必要があった。これに対し、細菌を抱えるだけのバイオフィルムは、10s以下29で十分な品質で画像化することができる。バイオフィルムの成長、構造、または組成の顕微鏡分析では、1分の取得時間は問題を引き起こすものではなく、多くの場合、これはpH記録にも当てはまるかもしれません。しかし、グルコースへの曝露直後の急速な酸性化(ΔpH>1単位/分)のような極端なpH変化は、界を越えたバイオフィルムでは監視することが困難である。
本研究は、C-SNARF-4とのレシオメトリックpH記録が、S.ミュータンとC.アルビカンスから構成されるクロスキングダムバイオフィルムにおいて実現可能であることを示している。今後の研究では、特に、その場所で成長したバイオフィルム(すなわち幼児のうがいの小児)において、より大きな種の多様性を有する異種の生物膜におけるpH変化を分析する方法を採用することができる。本研究では、バイオフィルム中のpHを、グルコースパルス直後の15分間の静的条件下および限られた観察時間でモニタリングした。さらなる進歩は、より密接に14、31、32のその位置条件で模倣する流体流れの適用を含んでいてもよい。さらに、pHレシオメトリーは、様々な栄養条件がクロスキングドバイオフィルムの長期的なpH変化に及ぼす影響を調べ、基礎となる宿主組織に対するバイオフィルムpHの影響を解明するために使用することができる。繰り返しますが、幼児期の齲蝕における歯のエナメル質の脱塩は顕著な例として役立つ。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
アネット・アクジャル・トムセンとハビエル・E・ガルシアは、優れた技術サポートを受けています。著者らは、画像解析に関する実りある議論に対するルーベンス・スピン・ネトに感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
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