Summary
O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.
Abstract
Biofilmes transversais que consistem em células fúngicas e bacterianas estão envolvidos em uma variedade de doenças bucais, como infecções endodônticas, periodontite, infecções mucosas e, mais notavelmente, cárinos da primeira infância. Em todas essas condições, o pH na matriz biofilme impacta as interações microbe-hospedeiros e, portanto, a progressão da doença. O protocolo atual descreve um método confocal baseado em microscopia para monitorar a dinâmica do PH dentro de biofilmes entre reinos compostos por candida albicans e streptococcus mutans. O espectro de emissão dupla dependente de pH e as propriedades de coloração da sonda ratiométrica C-SNARF-4 são explorados para determinar quedas no pH em áreas extracelulares dos biofilmes. O uso de ratiometria pH com a sonda requer uma escolha meticulosa de parâmetros de imagem, uma calibração completa do tintura e pós-processamento cuidadoso e baseado em limiar dos dados de imagem. Quando utilizada corretamente, a técnica permite a rápida avaliação do pH extracelular em diferentes áreas de um biofilme e, portanto, o monitoramento de gradientes pH horizontais e verticais ao longo do tempo. Embora o uso de microscopia confocal limite o perfil z a biofilmes finos de 75 μm ou menos, o uso de ratiometria pH é idealmente adequado para o estudo não invasivo de um importante fator de virulência em biofilmes entre reinos.
Introduction
Biofilmes entre reinos compostos por espécies fúngicas e bacterianas estão envolvidos em várias condições patológicas na cavidade oral. Candida spp. tem sido frequentemente isolada de infecções endodônticas1 e de lesões periodontais2,3. Em infecções mucosas, espécies estreptocócicas do grupo de áciculos têm sido mostradas para melhorar a formação fungal de biofilme, invasão de tecidos e disseminação nos modelos in vitro e murina4,5,6,7. Mais interessante, o transporte oral de Candida spp. tem sido comprovado estar associado à prevalência de cáios em crianças8. Como mostrado nos modelos de roedores, uma relação simbiótica entre mutanos streptococcus e candidas albicans aumenta a produção de polissacarídeos extracelulares e leva à formação de biofilmes mais grossos e cariogênicos9,10.
Em todas as condições acima mencionadas, as cárinas da primeira infância, em particular, o pH biofilme é importante para a progressão da doença, e o papel eminente da matriz biocinematográfica para o desenvolvimento de microambientes acidogênicos11 exige metodologias que permitam estudar mudanças de pH dentro de biofilmes transfronteiriços. Abordagens simples e precisas baseadas em microscopia confocal para monitorar pH dentro de biofilmes bacterianos12 e fúngicos13 foram desenvolvidas. Com o dye ratiométrico C-SNARF-4 e o pós-processamento de imagem baseado em limiares, o pH extracelular pode ser determinado em tempo real em todas as três dimensões de um biofilme14. Em comparação com outras técnicas publicadas para monitoramento de pH baseado em microscopia em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 é simples e barata, pois não requer a síntese de partículas ou compostos que incluem um tintura de referência15 ou o uso de excitação de dois fótons16. O uso de apenas um corante evita problemas com compartimentação de sondas, sangramento fluorescente e branqueamento seletivo16,17,18, enquanto ainda permite uma diferenciação confiável entre pH intra e extracelular. Finalmente, a incubação com o tintura é realizada após o crescimento do biofilme, que permite estudar tanto laboratório quanto em biofilmes cultivados no situ.
O objetivo do presente trabalho é ampliar o uso da ratiometria de pH e fornecer um método para estudar mudanças de pH em biofilmes inter-reinos. Como prova de conceito, o método é usado para monitorar pH em biofilmes de espécies duplas compostas por s. mutans e c. albicans expostos à glicose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo para coleta de saliva foi revisto e aprovado pelo Comitê de Ética do Condado de Aarhus (M-20100032).
1. Cultivo de Biofilmes transfronteiriços
- Grow S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 em placas de agar de sangue a 37 °C em condições aeróbicas.
- Transfira colônias individuais de cada organismo para testar tubos preenchidos com 5 mL de infusão cardíaca cerebral (BHI). Cresça por 18 h em condições aeróbicas a 37 °C.
- Centrífuga as culturas durante a noite em 1.200 x g por 5 min. Descarte o supernatante, resuspenda as células em soro fisiológico e ajuste o OD550 nm a 0,5 para C. albicans (~107 células/mL) e S. mutanos (~108 células/mL). Diluir a suspensão s. mutans 1:10 com soro fisiológico estéril (~107 células/mL).
- Pipette 50 μL de solução salivar estéril, preparada de acordo com o método de Jong et al.19, nos poços de uma placa inferior óptica 96-poço para microscopia. Incubar por 30 min a 37 °C. Lave os poços 3x com 100 μL de soro fisiológico estéril. Esvazie os poços.
- Adicione 100 μL de suspensão C. albicans a cada poço. Incubar a 37 °C por 90 min. Lave 3x com soro fisiológico estéril.
NOTA:Não esvazie completamente os poços durante a lavagem. Deixe um reservatório de 20 μL para evitar forças excessivas de cisalhamento. - Adicione 100 μL de soro bovino fetal inativado pelo calor (inativado a 56 °C por 30 min) a cada poço. Incubar a 37 °C por 2 h. Lave 3x com soro fisiológico estéril. Esvazie os poços, deixando um reservatório de 20 μL.
- Adicione 100 μL de suspensão s. mutans (preparado na etapa 1.3) a cada poço. Adicione 150 μL de BHI contendo 5% de sacarose. Incubar a 37 °C por 24 h ou mais. Ao cultivar biofilmes mais antigos, mude o meio diário para o BHI fresco. No final da fase de crescimento biofilme entre reinos, lave 5x com soro fisiológico estéril.
2. Imagem de pH ratiométrica
NOTA:A imagem de pH ratiométrica precisa ser realizada imediatamente após a conclusão do crescimento do biofilme.
- Para imagens de pH ratiométricas, use um microscópio de varredura a laser confocal invertido com uma lente de imersão de óleo ou água de 63x, uma linha laser de 543 nm e um sistema de imagem espectral (ou seja, detector DE META) para permitir a imagem de sinais fluorescentes sobrepostos. Use uma incubadora para aquecer o estágio do microscópio a 35 °C.
- Defina o detector para garantir a detecção de fluorescência verde de 576-608 nm e detecção simultânea de fluorescência vermelha de 629-661 nm. Escolha um poder laser apropriado e ganhe para evitar excesso e subexposição.
NOTA: A exposição das imagens é melhor vista em imagens de paleta com coramento falso. - Defina o tamanho do pinhole para 1 Unidade Arejada ou uma fatia óptica de ~0,8 μm. Defina o tamanho da imagem para 512 x 512 pixels e a velocidade de varredura para 2. Escolha uma média de linha de 2, usando a opção média.
NOTA: No início de uma série de experimentos, verifique se as configurações do microscópio escolhido fornecem um claro contraste entre células bacterianas, paredes fúngicas, matriz de biofilme e citoplasma fúngico. - Prepare 100 μL de soro fisiológico estéril contendo 0,4% (w/v) de glicose, titulado a pH 7. Prepare uma solução de estoque de C-SNARF-4 (1 mM em sulfoxida de dimetil). Adicione o tinantes a uma concentração final de 30 μM.
ATENÇÃO: Use luvas de nitrilo ao manusear o tye ratiométrico. - Esvazie um dos poços com um biofilme transmal, deixando um reservatório de 20 μL. Adicione o soro fisiológico estéril contendo glicose e o tye ratiométrico. Coloque a placa de 96 poços no palco do microscópio e comece a fotografar o biofilme.
- Adquirir imagens únicas ou pilhas Z em diferentes locais do biofilme. Marque a posição X-Y no software de microscópio para seguir mudanças de pH em determinados campos de visão ao longo do tempo. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir a compensação do detector.
- Repita as etapas 2.4-2.6 para a análise de cada biofilme cultivado em um poço diferente.
3. Calibração do Tye Ratiométrico
NOTA: A calibração do corno e a montagem de uma curva de calibração podem ser realizadas em um dia diferente da imagem pH ratiométrica.
- Prepare uma série de 50 mM 2-morpholinoesulfonic acid (MES) tampão titado para pH 4.0-7,8 em etapas de 0,2 pH unidades a 35 °C. Pipette 150 μL de cada solução tampão nos poços de uma placa de 96 poços de fundo óptico para microscopia.
- Adicione o tinantes aos poços cheios de tampão da placa de 96 poços a uma concentração final de 30 μM. Deixe equilibrar por 5 min.
- Aqueça o estágio do microscópio a 35 °C. Escolha as mesmas configurações de microscópio como para imagens de pH ratiométricas. Coloque a placa de 96 poços no palco do microscópio. Concentre-se na parte inferior dos poços. Adquirir duas imagens (canal verde e vermelho) para todas as soluções tampão, 5 μm acima da parte inferior do poço. Em intervalos regulares, tire imagens com o laser desligado para corrigir a compensação do detector.
- Realize o experimento de calibração em triplicado.
- Exporte todas as imagens como arquivos TIF. Importe-os em software dedicado de análise de imagem (ou seja, ImageJ20). Subtraia as imagens tiradas com o laser desligado das respectivas imagens das soluções tampão clicando no Processo | Calculadora de Imagem | Subtrair).
NOTA: Se necessário, corte as imagens para eliminar artefatos nas bordas da imagem realizando seleção retangular usando Imagem | Crop. - Divida as imagens do canal verde através das imagens do canal vermelho e calcule as intensidades médias de fluorescência nas imagens resultantes clicando | Histograma.
- A partir dos experimentos triplicados, plote as proporções médias verde/vermelha sem o pH. Use software dedicado para se adequar a uma função aos dados de calibração (ou seja, MyCurveFit).
4. Análise de Imagem Digital
NOTA:A análise de imagem digital pode ser realizada a qualquer momento após a calibração do dine e da imagem de pH ratiométrica.
- Armazene as imagens de biofilme do canal verde e vermelho em pastas separadas e renomeie ambas as séries de arquivos com números sequenciais (por exemplo, GREEN_0001). Importe as imagens em um software dedicado de análise de imagens (ou seja, ImageJ). Clique em Analisar | Histograma para determinar a intensidade média de fluorescência nas imagens tiradas com o laser desligado e subtrair o valor das imagens de biofilme clicando Processo | Matemática | Subtrair.
- Importe a série de 2 imagens em software dedicado de análise de imagens (ou seja, daime21). Realize uma segmentação baseada em limiares das imagens do canal vermelho (Segmento | Segmentação automática | Limiar personalizado). Coloque o limiar 'baixo' acima da intensidade de fluorescência do citoplasma fúngico e o limiar 'alto' abaixo da intensidade das paredes fúngicas e das bactérias.
NOTA:Quando os limiares apropriados foram escolhidos, apenas áreas extracelulares são reconhecidas como objetos. - Transfira a camada de objeto da série de imagens segmentada para a série de imagens do canal verde. Para isso, clique em Segmento | Camada de objeto de transferência.
NOTA: Se o contraste entre áreas extracelulares e citoplasma fúngico for muito fraco nos canais de cores individuais, adicione a série de imagens do canal verde à série do canal vermelho antes da segmentação clicando em Editar | Calculadora de imagem | Adição. Realize a segmentação conforme descrito abaixo de 4.2 e transfira a camada de objeto da série de imagens segmentada para a série de imagens verde e do canal vermelho. - Empregue o editor de objetos para excluir pixels não-objetos na série de imagens do canal vermelho e verde (Visualizer | Editor de objetos | Em todas as imagens | Exclua pixels não-objetos). Agora as imagens de biofilme são limpas de células bacterianas e fúngicas. Exporte a série de imagens processada como arquivos TIF.
- Importe ambas as séries de imagem para ImageJ. ImageJ atribui uma intensidade de 0 a todos os pixels não-objetos. Remova esses pixels dividindo a série de imagem vermelha (R1) por si só (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: R1; Operação: Dividir; Imagem 2: R1) e multiplicando a série de imagens resultante (R2) com a série original de imagem vermelha (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: R1; Operação: Multiplique; Imagem 2: R2). Uma terceira série de imagens (R3) é criada, idêntica à R1, exceto pelo fato de que a NaN é atribuída a todos os pixels com uma intensidade de 0 no R1. Prossiga da mesma forma com a série de imagem verde.
- Use o filtro 'Mean' (Processo | Filtros | Média | Raio | 1 pixel) na série de imagens do canal vermelho e verde para compensar o ruído do detector. Divida a série de imagens do canal verde pela série de imagens do canal vermelho (Processo | Calculadora de imagem | Imagem 1: G3; Operação: Dividir; Imagem 2: R3). A série de imagens resultante (G3/R3) mostra a relação verde/vermelho para todos os pixels de objeto.
- Calcule a proporção média para cada imagem (Analisar | Histograma). Aplicar coloração falsa para melhor representação visual das proporções nas imagens (Imagem | Mesas de Mirantes). Converta as proporções verde/vermelha em valores pH empregando a função instalada abaixo de 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após 24h e 48 h, biofilmes robustos de cross-kingdom se desenvolveram nas placas de poço. Os albicanos mostraram diferentes graus de crescimento de filamentous, e os mutanos formaram aglomerados densos de até 35 μm de altura. Células únicas e correntes de s. mutanos agrupados em torno de hífofas fúngicas, e grandes espaços intercelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa (Figura S1).
A calibração do tye ratiométrico produz uma curva sigmoidal assimétrica13,14. O pH extracelular nos biofilmes caiu rapidamente nos primeiros 5 minutos após a exposição à glicose em diferentes taxas em diferentes campos de visão microscópicos. Depois disso, a acidificação desacelerou, atingindo valores tipicamente de 5,5-5,8 após 15 min (Figura 1). Os biofilmes replicados mostraram um comportamento semelhante, com apenas pequenas variações na média do pH (Figura S2).
A precisão dos cálculos do pH depende fortemente de uma escolha cuidadosa de configurações de imagem durante a aquisição. Para os biofilmes em questão, uma fatia óptica de 0,8 μm provou ser ideal para obter o melhor contraste possível entre áreas extracelulares e citoplasma fúngico (Figura S3). Além disso, um tamanho de pixel de 0,28 μm (Figura S4), um tempo de 102,4 μs(Figura S5),e uma média de linha de 2(Figura S6) forneceram um bom contraste junto com um tempo aceitável de aquisição de imagem de ~1 min. Durante o pós-processamento da imagem, todas as células bacterianas e fúngicas foram removidas das imagens, enquanto a maioria das áreas extracelulares circundantes foram incluídas na análise subsequente do PH. Dependendo do brilho das imagens, diferentes limiares superiores e inferiores tiveram que ser escolhidos (Figura 2).
Os dados do pH mostrados na Figura 1 e na Figura S2 foram registrados 5 μm da interface biofilme-substrato. Com a crescente distância do substrato, e dependendo da densidade celular nos biofilmes, a intensidade da fluorescência diminui, resultando em um menor contraste entre células e matriz. No entanto, nos biofilmes finos (~35 μm) cultivados no presente estudo, o contraste no topo do biofilme permitiu uma análise de imagem confiável(Figura S7A).
Figura 1: Uso de pH ratiometry em biofilmes transmexados expostos à glicose. (A) Um campo de visão em um biofilme manchado foi imageed com microscopia confocal e a área coberta por células bacterianas e fúngicas foi removida antes da análise ratiométrica. (B) O pH no espaço extracelular foi calculado e visualizado utilizando uma mesa de lookup (16 cores). Barras de escala = 20 μm.(C) O pH nos biofilmes de 24 h cross-kingdom caiu rapidamente após a exposição à glicose a taxas ligeiramente diferentes em diferentes campos de visão. Barras de erro = desvio padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Segmentação de imagens baseada em limiar de biofilmes manchados. Devido às mudanças locais de pH, a intensidade da fluorescência nos biofilmes muda com o tempo. (A) e(B) mostram o mesmo campo de visão microscópico após 1 min e 15 min de exposição à glicose, respectivamente. Durante a segmentação de imagens, limiares altos e baixos precisam ser escolhidos adequadamente para eliminar todas as áreas cobertas por células bacterianas e fúngicas. (C) As áreas azuis foram eliminadas pelo limiar baixo (40), áreas vermelhas pelo limiar elevado (115). (D) Apenas áreas extracelulares foram reconhecidas como objetos (cercadas por linhas laranjas). (E) Após a eliminação da área coberta por células microbianas, o cálculo do pH poderia ser realizado na matriz biofilme. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S1: Típico 24 h biofilme cross-kingdom manchado com o tintura ratiométrico. Muitas células c. albicans apresentaram crescimento filamentous, enquanto as células s. mutanos (amarelo) formaram aglomerados densos ou localizadas ao redor de hifae fúngica como células ou correntes únicas. Grandes espaços intercelulares indicaram a presença de uma volumosa matriz biofilme. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S2: O desenvolvimento do pH em biofilmes transfronteiriços de 24 h expostos à glicose. (A), (B) e (C) O pH foi determinado ratiometricamente em três biofilmes de replicação por 15 min após exposição à glicose. Após uma rápida queda de pH nos primeiros 5 min, a acidificação desacelerou, e os níveis de 5,5-5,8 foram atingidos após 15 min. Taxas ligeiramente diferentes foram observadas em diferentes campos de visão microscópicos (cada um representado por uma linha). A calibração da sonda ratiométrica só foi realizada uma vez. Barras de erro = SD. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S3: Impacto da espessura da fatia óptica no contraste da imagem. Imagens de biofilmes manchados foram adquiridas com (A) um tamanho de pinhole de 2 Unidades Arejadas e uma espessura de fatia óptica de 1,6 μm, e (B) 1 Unidade Arejada e uma fatia óptica de 0,8 μm. Na Unidade Aérea 1, era necessário um maior poder/ganho a laser para aquisição de imagens, mas o contraste entre citoplasma fúngico e áreas extracelulares melhorou. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S4: Impacto da resolução no contraste de imagem. Imagens de biofilmes manchados foram adquiridas com tamanhos de pixelde (A) 1,12 μm,(B) 0,56 μm,(C) 0,28 μm,(D) 0,14 μm, e(E)0,11 μm. A redução do tamanho do pixel abaixo de 0,28 μm não melhorou o contraste entre áreas extracelulares e citoplasma fúngico. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S5: Impacto da velocidade de varredura no contraste da imagem. Imagens de biofilmes manchados foram adquiridas com tempos de pixel dwell de (A) 12,8 μs,(B) 25,6 μs,(C) 51,2 μs,(D) 102 μs, e(E)164 μs. Aumentar o tempo de crescimento do pixel além de 102 μs não melhorou o contraste entre áreas extracelulares e intracelulares. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S6: Impacto da média no contraste de imagem. Imagens de biofilmes manchados foram adquiridas com médias de linha (média) de (A) 1,(B) 2, e(C) 4. Uma média de linha de 2 proporcionou o melhor compromisso entre o tempo de contraste e aquisição. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura S7: Contraste de imagem em biofilmes puramente fúngicos e biofilmes transversais. (A)O topo de um biofilme manchado de reino cruzado foi imagem a 30 μm da interface. O contraste entre áreas extracelulares e intracelulares foi menor do que na base de biofilme, mas ainda suficiente para análise de pH ratiométrica. (B)Um biofilme monoespécie c. albicans foi imaged para pH ratiometry. O poder/ganho a laser poderia ser aumentado para otimizar o contraste entre paredes fúngicas e citoplasma. (C) Nos biofilmes transversais, as bactérias brilhantemente fluorescentes impediram um aumento ainda maior do poder/ganho a laser. Assim, o contraste entre paredes fúngicas e citoplasma é menos pronunciado do que em biofilmes puramente fúngicos. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diferentes protocolos para o cultivo de biofilmes transcionais envolvendo C. albicans e Streptococcus spp. foram descritos anteriormente9,22,23,24,25. No entanto, a configuração atual se concentra em condições simples de crescimento, um cronograma compatível com dias de trabalho regulares, uma composição de espécies equilibradas e o desenvolvimento de uma volumosa matriz biofilme. Além disso, 96 placas de poço foram revestidas com solução salivar para imitar as condições orais de adesão até certo ponto.
O uso de ratiotrytry pH com C-SNARF-4 é um método barato para medições rápidas de pH biofilme, as vantagens e desvantagens dos quais foram discutidos em detalhes em outros lugares12,26. Em resumo, a técnica permite a avaliação de pH em diferentes locais dentro de biofilmes e, assim, o monitoramento de gradientes horizontais de pH e desenvolvimentos pH ao longo do tempo27. Perfis verticais de pH também podem ser registrados, mas a profundidade de penetração é limitada pelo uso de microscopia confocal. Assim, a ratiometria pH representa uma alternativa mais rápida, mais versátil e menos invasiva aos microeletrodos pH, que atualmente são o método de escolha para o perfil Z de biofilmes espessos28. Em comparação com outros métodos baseados em microscopia para gravações de pH em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 tem a vantagem de empregar apenas uma mancha. Portanto, vários problemas que podem surgir do comportamento fluorescente diferencial e da interação entre diferentes corantes são contornados26.
Nos biofilmes transversais, a diferenciação baseada em limiares entre biomassa microbiana e áreas extracelulares representa alguns problemas quando comparadas a biofilmes que compreendem apenas células bacterianas ou fúngicas. As células bacterianas internalizam o corante ratiométrico e exibem um sinal fluorescente brilhante em comparação com a matriz biofilme, mas também comparadas com paredes celulares fúngicas. Paredes fúngicas parecem um pouco mais brilhantes do que a matriz biofilme, que por sua vez mostra maior fluorescência do que a citoplasma fúngica. Em biofilmes que consistem apenas em células fúngicas, as imagens podem ser adquiridas com alto poder/ganho a laser, o que resulta em contraste suficiente entre a matriz biofilme e a citoplasma fúngica (Figura S7B). Quando as bactérias estão presentes, o poder/ganho a laser deve ser reduzido para evitar a superexposição de células bacterianas (Figura S7C). Assim, o contraste entre citoplasma fúngico e áreas extracelulares não é tão pronunciado, e configurações de imagem como tamanho pinhole, tamanho do pixel e tempo de pixel-dwell devem ser escolhidos com muito cuidado para análise ratiométrica.
Quanto a todas as técnicas baseadas em microscopia, a qualidade da imagem e o tempo de aquisição estão inversamente correlacionados. Nos atuais biofilmes transfronteiriços, foi necessário um tempo de imagem de ~30 s, idealmente 1 min, para obter uma qualidade adequada para análise subsequente de pH. Em comparação, biofilmes que apenas abrigam bactérias podem ser imagens com qualidade suficiente em 10 ou menos29. Para análises de microscopia de crescimento, estrutura ou composição de biofilmes, os tempos de aquisição de 1 min não representam um problema, e em muitos casos, isso também pode se aplicar a gravações de pH. No entanto, mudanças extremas de pH, como a acidificação rápida observada imediatamente após a exposição à glicose (ΔpH > 1 unidade/min), são difíceis de monitorar em biofilmes transfronteiriços.
O presente trabalho demonstra que as gravações de pH ratiométricas com C-SNARF-4 são viáveis em biofilmes transversais compostos por s. mutans e C. albicans. Estudos futuros podem empregar o método para analisar mudanças de pH em biofilmes transversais com maior diversidade de espécies, especialmente em biofilmes cultivados em situ (ou seja, em crianças com cárinos da primeira infância)30. Neste estudo, o pH nos biofilmes foi monitorado em condições estáticas e por um tempo de observação limitado de 15 min, logo após um pulso de glicose. Outros avanços podem incluir a aplicação de um fluxo de fluido para imitar em condições situ mais de perto14,31,32. Além disso, a ratiometria de pH pode ser usada para estudar o impacto de várias condições nutricionais em mudanças de pH de longo prazo em biofilmes transfronteiriços e contribuir para elucidar o efeito do pH biofilme nos tecidos hostados subjacentes. Mais uma vez, a desmineralização do esmalte dentário nas cárie da primeira infância pode servir como um exemplo proeminente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Anette Aakjær Thomsen e Javier E. Garcia são reconhecidos por excelente suporte técnico. Os autores agradecem a Rubens Spin-Neto por discussões frutíferas sobre análise de imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H.
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P.
