Summary
Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all'interno di questi biofilm.
Abstract
I biofilm tra regni composti da cellule fungine e batteriche sono coinvolti in una varietà di malattie orali, come infezioni endodontiche, parodontite, infezioni mucosali e, in particolare, carie della prima infanzia. In tutte queste condizioni, il pH nella matrice del biofilm influisce sulle interazioni microbo-ospite e quindi sulla progressione della malattia. Il presente protocollo descrive un metodo confocale basato sulla microscopia per monitorare le dinamiche del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati che comprendono albicani Candida e mutans Streptococcus. Lo spettro a doppia emissione dipendente dal pH e le proprietà di colorazione della sonda ratiometrica C-SNARF-4 sono sfruttati per determinare le gocce di pH nelle aree extracellulari dei biofilm. L'uso di pH ratiometry con la sonda richiede una scelta meticolosa di parametri di imaging, una calibrazione completa del colorante e un'attenta post-elaborazione basata sulla soglia dei dati dell'immagine. Se utilizzata correttamente, la tecnica consente la valutazione rapida del pH extracellulare in diverse aree di un biofilm e quindi il monitoraggio dei gradienti di pH orizzontali e verticali nel tempo. Mentre l'uso di limiti di microscopia confocale per biofilm sottili di 75 m o meno, l'uso di pH ratiometry è ideale per lo studio non invasivo di un importante fattore di virulenza nei biofilm cross-kingdom.
Introduction
I biofilm tra regni incrociati che comprendono specie sia fungine che batteriche sono coinvolti in diverse condizioni patologiche nella cavità orale. Candida spp. sono stati spesso isolati da infezioni endodontiche1 e da lesioni parodontali2,3. Nelle infezioni mucosali, specie streptococcal del gruppo mitis hanno dimostrato di migliorare la formazione di biofilm fungini, l'invasione dei tessuti e la diffusione in entrambi i modelli in vitro e murini4,5,6,7. La cosa più interessante, il trasporto orale di Candida spp. è stato dimostrato di essere associato con la prevalenza di carie nei bambini8. Come mostrato nei modelli di roditori, una relazione simbiotica tra Streptococcus mutans e Candidas albicans aumenta la produzione di polisaccharides extracellulari e porta alla formazione di biofilm biogenici più spessi e cariogenici9,10.
In tutte le condizioni di cui sopra, in particolare le carie della prima infanzia, il pH del biofilm è importante per la progressione della malattia e il ruolo eminente della matrice dei biofilm per lo sviluppo di microambienti acidogenici11 richiede metodologie che consentano di studiare i cambiamenti del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati. Sono stati sviluppati approcci confocali a base di microscopia confocale semplici e accurati per monitorare il pH all'interno di biofilm batterici12 e13 fungini. Con il colorante ratiometrico C-SNARF-4 e la post-elaborazione dell'immagine basata sulla soglia, il pH extracellulare può essere determinato in tempo reale in tutte e tre le dimensioni di un biofilm14. Rispetto ad altre tecniche pubblicate per il monitoraggio del pH basato sulla microscopia nei biofilm, la pH ratiometry con C-SNARF-4 è semplice ed economica, perché non richiede la sintesi di particelle o composti che includono un colorante di riferimento15 o l'uso di eccitazione a due fotoni16. L'uso di un solo colorante previene problemi con la compartimentazione della sonda, il sanguinamento fluorescente e lo sbiancamento selettivo16,17,18 pur consentendo una differenziazione affidabile tra pH intra ed extracellulare. Infine, l'incubazione con il colorante viene eseguita dopo la crescita del biofilm, che consente di studiare sia i biofilm di laboratorio che quelli coltivati in situ.
L'obiettivo del presente lavoro è quello di estendere l'uso della pH ratiometry e fornire un metodo per studiare i cambiamenti di pH nei biofilm tra regni. Come prova di concetto, il metodo viene utilizzato per monitorare il pH in biofilm a doppia specie costituiti da S. mutans e C. albicans esposti al glucosio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo per la raccolta della saliva è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico della contea di Aarhus (M-20100032).
1. Coltivazione di Biofilm trasversali
- Crescere S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 su piastre di agar di sangue a 37 gradi centigradi in condizioni aerobiche.
- Trasferire colonie singole di ogni organismo a provette piene di 5 mL di infusione del cuore cerebrale (BHI). Coltivare per 18 h in condizioni aerobiche a 37 gradi centigradi.
- Centrifugare le colture notturne a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante, sospendere nuovamente le cellule in salina fisiologica e regolare l'OD550 nm a 0,5 per C. albicans (107 cellule /mL) e S. mutans (108 celle /mL). Diluire la sospensione S. mutans 1:10 con sterile salina fisiologica (107 cellule / mL).
- Pipette 50 -L di soluzione salivare sterile, preparata secondo il metodo di de Jong etal. Incubare per 30 min a 37 . Lavare i pozzi 3x con 100 gradi di salina fisiologica sterile. Svuotate i pozzi.
- Aggiungete 100 litri di c. albicans in ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi per 90 min. Lavare 3x con salina fisiologica sterile.
NOTA:Non svuotare completamente i pozzi durante il lavaggio. Lasciare un serbatoio di 20 l per evitare eccessive forze di taglio. - Aggiungete un'ol di siero bovino fetale inattivato dal calore (inattivato a 56 gradi centigradi per 30 minuti) a ciascuno di essi. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 h. Lavare 3x con salina fisiologica sterile. Svuotare i pozze, lasciando un serbatoio di 20 gradi l.
- Aggiungere 100 litri di sospensione S. mutans (preparata al punto 1.3) ad ogni pozzo. Aggiungete 150 l di BHI contenenti il 5% di saccarosio. Incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore o più. Quando si coltivano biofilm più vecchi, cambiare il mezzo quotidiano in BHI fresco. Alla fine della fase di crescita del biofilm tra regni, lavare 5 volte con salina fisiologica sterile.
2. Imaging pH ratiometrico
NOTA:L'imaging pH ratiometrico deve essere eseguito immediatamente dopo che la crescita del biofilm è stata completata.
- Per l'imaging pH ratiometrico, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertito con una lente ad immersione ad olio o acqua 63x, una linea laser da 543 nm e un sistema di imaging spettrale (ad esempio, un rilevatore META) per consentire l'imaging di segnali fluorescenti sovrapposti. Utilizzare un'incubatrice per riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi centigradi.
- Impostare il rivelatore per garantire il rilevamento della fluorescenza verde da 576,608 nm e il rilevamento simultaneo della fluorescenza rossa da 629-661 nm. Scegliere una potenza laser appropriata e guadagno per evitare eccesso e sottoesposizione.
NOTA: l'esposizione delle immagini è meglio visibile nelle immagini della tavolozza con falsi coloranti. - Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1 Unità Airy o su una fetta ottica di 0,8 m. Impostare le dimensioni dell'immagine su 512 x 512 pixel e la velocità di scansione su 2. Scegliere una media di linea di 2, utilizzando l'opzione media.
NOTA:All'inizio di una serie di esperimenti, verificare che le impostazioni del microscopio scelte forniscano un chiaro contrasto tra cellule batteriche, pareti cellulari fungine, matrice di biofilm e citoplasma fungino. - Preparare 100 l di salina fisiologica sterile contenente lo 0,4% (w/v) di glucosio, titolato a pH 7. Preparare una soluzione di stock di C-SNARF-4 (1 mM in solfuro dimetil). Aggiungere il tinrito ad una concentrazione finale di 30 M.
AVVISO: Indossare guanti nitrile durante la manipolazione del tintura ratiometrica. - Svuotare uno dei pozzi con un biofilm tra regno, lasciando un serbatoio di 20 .L. Aggiungere la salina sterile contenente glucosio e il coloranti ratiometrico. Posizionare la piastra da 96 pozzi sullo stadio del microscopio e iniziare a creare immagini del biofilm.
- Acquisire singole immagini o ze-stack in diverse posizioni del biofilm. Contrassegnare la posizione X-Y nel software del microscopio per seguire i cambiamenti di pH in particolari campi visivi nel tempo. A intervalli regolari, scattare immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore.
- Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,6 per l'analisi di ogni biofilm coltivato in un pozzo diverso.
3. Calibrazione del dye Ratiometric
NOTA: la calibrazione del tintura e il raccordo di una curva di calibrazione possono essere eseguite in un giorno diverso rispetto all'imaging del pH ratiometrico.
- Preparare una serie di 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) tonfolato a pH 4.0-7.8 in gradini di 0,2 pH unità a 35 . Pipette 150 L di ogni soluzione tampone nei pozze di una piastra da 96 pozzetto per la microscopia con fondo ottico.
- Aggiungere il coloranti nei pozzetto riempiti tampone della piastra da 96 pozzetto ad una concentrazione finale di 30 M. Lasciate espoli per 5 min.
- Riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi centigradi. Scegliere le stesse impostazioni del microscopio per l'imaging pH ratiometrico. Posizionare la piastra da 96 pozzi sullo stadio del microscopio. Concentrati sul fondo dei pozzi. Acquisire due immagini (canale verde e rosso) per tutte le soluzioni buffer, 5 m sopra la parte inferiore del pozzo. A intervalli regolari, scattare immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore.
- Eseguire l'esperimento di calibrazione in triplice copia.
- Esportare tutte le immagini come file TIF. Importarli in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, ImageJ20). Sottrarre le immagini scattate con il laser spento dalle rispettive immagini delle soluzioni buffer facendo clic su Processo . Calcolatore di immagini Sottrarre).
NOTA: se necessario, ritagliare le immagini per eliminare gli artefatti ai bordi dell'immagine eseguendo la selezione rettangolare utilizzando Immagine . Ritagliare. - Dividere le immagini del canale verde attraverso le immagini del canale rosso e calcolare le intensità medie di fluorescenza nelle immagini risultanti facendo clic su Analizza . Istogramma.
- Dagli esperimenti triplicati, tracciare i rapporti medio verde/rosso rispetto al pH. Utilizzare un software dedicato per adattare una funzione ai dati di calibrazione (ad esempio, MyCurveFit).
4. Analisi digitale delle immagini
NOTA:L'analisi digitale delle immagini può essere eseguita in qualsiasi momento dopo la calibrazione del tinrio e l'imaging pH ratiometrico.
- Memorizzare le immagini del biofilm del canale verde e rosso in cartelle separate e rinominare entrambe le serie di file con numeri sequenziali (ad esempio, GREEN_0001). Importare le immagini in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, ImageJ). Fare clic su Analizza . Istogramma per determinare l'intensità media di fluorescenza nelle immagini scattate con il laser spento e sottrarre il valore dalle immagini del biofilm facendo clic su Processo . Proprietà Math . Sottrarre.
- Importare la serie di 2 immagini in un software di analisi delle immagini dedicato (ad esempio, daime21). Eseguire una segmentazione basata sulla soglia delle immagini dei canali rossi (Segmento Segmentazione automatica Soglia personalizzata). Impostare la soglia "bassa" al di sopra dell'intensità di fluorescenza del citoplasma fungino e la soglia "alta" al di sotto dell'intensità delle pareti cellulari fungine e dei batteri.
NOTA:Quando sono state scelte le soglie appropriate, solo le aree extracellulari vengono riconosciute come oggetti. - Trasferire il livello oggetto della serie di immagini segmentate alla serie di immagini del canale verde. A tale scopo, fare clic su Segmento . Livello oggetto di trasferimento.
NOTA: se il contrasto tra aree extracellulari e citoplasma fungino è troppo debole nei singoli canali di colore, aggiungere la serie di immagini del canale verde alla serie di canali rossi prima della segmentazione facendo clic su Modifica . Calcolatore di immagini Addizione. Eseguite la segmentazione come descritto sotto 4.2 e trasferite il livello dell'oggetto della serie di immagini segmentate sia alla serie di immagini del canale verde che a quella rossa. - Utilizza l'editor di oggetti per eliminare i pixel non oggetto nella serie di immagini del canale rosso e verde(Visualizer Editor di oggetti : In tutte le immagini Eliminare i pixel non oggetto). Ora le immagini del biofilm vengono cancellate sia dalle cellule batteriche che da quella fungine. Esportare la serie di immagini elaborate come file TIF.
- Importare entrambe le serie di immagini in ImageJ. ImageJ assegna un'intensità pari a 0 a tutti i pixel non oggetto. Rimuovere i pixel dividendo la serie di immagini rosse (R1) per se stessa (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: R1; Operazione: Dividere; Immagine 2: R1) e moltiplicando la serie di immagini risultante (R2) con la serie di immagini rosse originale (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: R1; Operazione: Moltiplicare; Immagine 2: R2). Viene creata una terza serie di immagini (R3), identica a R1, ad eccezione del fatto che NaN viene assegnato a tutti i pixel con un'intensità di 0 in R1. Procedere allo stesso modo con la serie di immagini verdi.
- Utilizzare il filtro 'Mean'(Process Proprietà Filters . Proprietà Mean (Media) . Proprietà Radius . 1 pixel) sulla serie di immagini del canale rosso e verde per compensare il rumore del rivelatore. Dividere la serie di immagini del canale verde per la serie di immagini del canale rosso (Processo Calcolatore di immagini Immagine 1: G3; Operazione: Dividere; Immagine 2: R3). La serie di immagini risultanti (G3/R3) mostra il rapporto verde/rosso per tutti i pixel dell'oggetto.
- Calcolare il rapporto medio per ogni immagine (Analyze Istogramma). Applicare una colorazione falsa per una migliore rappresentazione visiva dei rapporti nelle immagini(Immagine Tabelle di ricerca). Convertire i rapporti verde/rosso in valori di pH utilizzando la funzione montata sotto 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo 24 h e 48 h, robusti biofilm tra regni si sono sviluppati nelle piastre del pozzo. C. albicans ha mostrato vari gradi di crescita filamentosa, e S. mutans formavano ammassi densi fino a 35 m di altezza. Singole cellule e catene di S. mutans raggruppate intorno alle iphae fungine, e ampi spazi intercellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa (Figura S1).
La calibrazione del tintura ratiometrica produce una curva sigmoidale asimmetrica13,14. Il pH extracellulare nei biofilm è sceso rapidamente nei primi 5 min dopo l'esposizione al glucosio a diversi tassi in diversi campi microscopici di vista. Successivamente, l'acidificazione ha rallentato, raggiungendo in genere valori di 5,5–5,8 dopo 15 min (Figura 1). I biofilm replicati hanno mostrato un comportamento simile, con solo lievi variazioni nel pH medio (Figura S2).
La precisione dei calcoli del pH dipende fortemente da un'attenta scelta delle impostazioni dell'immagine durante l'acquisizione. Per i biofilm in questione, una fetta ottica di 0,8 m si è dimostrata ideale per ottenere il miglior contrasto possibile tra aree extracellulari e citoplasma fungino (Figura S3). Inoltre, una dimensione in pixel di 0,28 m(Figura S4),un tempo di permane di 102,4 pollici (Figura S5) e una media di linea di 2 (Figura S6) hanno fornito un buon contrasto insieme a un tempo di acquisizione dell'immagine accettabile di 1 min. Durante la post-elaborazione delle immagini, tutte le cellule batteriche e fungine sono state rimosse dalle immagini, mentre la maggior parte delle aree extracellulari circostanti sono state incluse nella successiva analisi del pH. A seconda della luminosità delle immagini, è stato necessario scegliere diverse soglie superiori e inferiori(Figura 2).
I dati del pH illustrati nella Figura 1 e nella Figura S2 sono stati registrati a 5 m dall'interfaccia biofilm-substrato. Con l'aumentare della distanza dal substrato, e a seconda della densità cellulare nei biofilm, l'intensità della fluorescenza diminuisce, con conseguente contrasto inferiore tra le cellule e la matrice. Tuttavia, nei biofilm sottili (35 m) coltivati nel presente studio, il contrasto nella parte superiore del biofilm ha permesso un'analisi affidabile delle immagini (Figura S7A).
Figura 1: Uso di pH ratiometria in biofilm cross-kingdom esposti al glucosio. (A) Un campo visivo in un biofilm colorato è stato immaginato con microscopia confocale e l'area coperta da cellule batteriche e fungine è stata rimossa prima dell'analisi ratiometrica. (B) Il pH nello spazio extracellulare è stato calcolato e visualizzato utilizzando una tabella di ricerca (16 colori). Barre di scala - 20 m. (C) Il pH dei biofilm cross-kingdom da 24 h è sceso rapidamente dopo l'esposizione al glucosio a tassi leggermente diversi in diversi campi visivi. Barre di errore: deviazione standard (SD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: segmentazione dell'immagine basata su soglia dei biofilm macchiati. A causa dei cambiamenti del pH locale, l'intensità della fluorescenza nei biofilm cambia nel tempo. (A) e (B) mostrano lo stesso campo visivo microscopico dopo 1 min e 15 min di esposizione al glucosio, rispettivamente. Durante la segmentazione dell'immagine, le soglie alte e basse devono essere scelte in modo adeguato per eliminare tutte le aree coperte da cellule batteriche e fungine. (C) Le aree blu sono state eliminate con la soglia bassa (40), le aree rosse con la soglia alta (115). (D) Solo le aree extracellulari sono state riconosciute come oggetti (circondate da linee arancioni). (E) Dopo l'eliminazione dell'area coperta dalle cellule microbiche, il calcolo del pH potrebbe essere eseguito nella matrice del biofilm. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: Biofilm tipico 24 h cross-kingdom macchiato con il coloranti ratiometrico. Molte cellule C. albicans mostravano una crescita filamentosa, mentre le cellule S. mutans (giallo) formavano ammassi densi o localizzate intorno alle ife fungine come singole cellule o catene. Grandi spazi intercellulari indicavano la presenza di una matrice di biofilm voluminosa. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S2: Lo sviluppo del pH in biofilm cross-kingdom esposta al glucosio da 24 h. (A), (B) e (C) Il pH è stato determinato in modo proporzionale in tre biofilm replicanti per 15 min dopo l'esposizione al glucosio. Dopo un rapido calo del pH nei primi 5 min, l'acidificazione ha rallentato, e i livelli di 5,5-5,8 sono stati raggiunti dopo 15 min. Sono stati osservati tassi leggermente diversi in diversi campi microscopici di vista (ciascuno rappresentato da una linea). La calibrazione della sonda ratiometrica è stata eseguita una sola volta. Barre di errore - SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S3: Impatto dello spessore ottico della fetta sul contrasto dell'immagine. Le immagini di biofilm macchiati sono state acquisite con (A) una dimensione di foro stenopeico di 2 Unità Ariose e uno spessore ottico di fette di 1,6 m, e(B)1 Unità Ariosa e una fetta ottica di 0,8 m. A 1 Airy Unit, era necessaria una maggiore potenza/guadagno laser per l'acquisizione dell'immagine, ma il contrasto tra citoplasma fungino e aree extracellulari è migliorato. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S4: Impatto della risoluzione sul contrasto dell'immagine. Le immagini di biofilm macchiati sono state acquisite con dimensioni in pixel di (A) 1,12 m, (B) 0,56 m, (C) 0,28 m, (D) 0,14m, e (E) la riduzione della dimensione dei pixel al di sotto di 0,28 m non ha migliorato il contrasto tra le aree extracellulari e il citoplasma fungino. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S5: Impatto della velocità di scansione sul contrasto dell'immagine. Le immagini di biofilm macchiati sono state acquisite con tempi di abitatura dei pixel di (A) di 12,8 s, (B) 25,6 s, (C) 51,2 s, (D) 102s, e (E) 164 s. Aumentare il tempo di abitamento dei pixel oltre 102 s non ha migliorato il contrasto tra aree extracellulari e intracellulari. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S6: Impatto della media sul contrasto dell'immagine. Le immagini di biofilm macchiati sono state acquisite con medie di linea (media) di (A) 1, (B) 2 e (C) 4. Una media di linea pari a 2 ha fornito il miglior compromesso tra contrasto e tempo di acquisizione. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S7: Contrasto delle immagini in biofilm puramente fungini e biofilm tra regni incrociati. (A) La parte superiore di un biofilm colorato cross-kingdom è stata ripresa a 30 m dall'interfaccia. Il contrasto tra aree extracellulari e intracellulari è stato inferiore a quello della base del biofilm, ma ancora sufficiente per l'analisi del pH ratiometrico. (B) A C. albicans monospecie biofilm è stato immagine per pH ratiometry. Potenza/guadagno laser potrebbe essere aumentato per ottimizzare il contrasto tra pareti di cellule fungine e citoplasma. (C) Nei biofilm cross-kingdom, i batteri luminosamente fluorescenti precludevano un ulteriore aumento della potenza/guadagno del laser. Quindi, il contrasto tra le pareti delle cellule fungine e il citoplasma è meno pronunciato che nei biofilm puramente fungini. Barre di scala - 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diversi protocolli per la coltivazione di biofilm tra regni che coinvolgono C. albicans e Streptococcus spp. sono stati descritti in precedenza9,22,23,24,25. Tuttavia, l'attuale configurazione si concentra su condizioni di crescita semplici, un calendario compatibile con i normali giorni lavorativi, una composizione equilibrata delle specie e lo sviluppo di una matrice di biofilm voluminosi. Inoltre, le piastre di 96 pozze sono state rivestite con soluzione salivare per imitare le condizioni orali di adesione in una certa misura.
L'uso di pH ratiometry con C-SNARF-4 è un metodo economico per misurazioni rapide del biofilm pH, i cui vantaggi e svantaggi sono stati discussi in dettaglio altrove12,26. In breve, la tecnica consente la valutazione del pH in diverse posizioni all'interno dei biofilm e quindi il monitoraggio delle pendenze di pH orizzontali e degli sviluppi del pH nel tempo27. Anche i profili di pH verticale possono essere registrati, ma la profondità di penetrazione è limitata dall'uso della microscopia confocale. Quindi, la pH ratiometry rappresenta un'alternativa più veloce, più versatile e meno invasiva ai microelettrodi del pH, che sono attualmente il metodo di scelta per la profilazione a z di biofilm spessi28. Rispetto ad altri metodi basati sulla microscopia per le registrazioni del pH nei biofilm, la pH ratiometry con C-SNARF-4 ha il vantaggio di impiegare una sola macchia. Pertanto, diversi problemi che possono derivare dal comportamento fluorescente differenziale e l'interazione tra diversi coloranti sono aggirati26.
Nei biofilm del regno incrociato, la differenziazione basata sulle soglie tra biomassa microbica ed aree extracellulari pone alcuni problemi rispetto ai biofilm che comprendono solo cellule batteriche o fungine. Le cellule batteriche interiorizzano il colorante ratiometrico e mostrano un segnale fluorescente luminoso rispetto alla matrice del biofilm, ma anche rispetto alle pareti cellulari fungine. Le pareti cellulari fungine appaiono un po 'più luminose della matrice del biofilm, che a sua volta mostra una maggiore fluorescenza rispetto al citoplasma fungino. Nei biofilm che sono costituiti solo da cellule fungine, le immagini possono essere acquisite con un'elevata potenza/guadagno laser, il che si traduce in un contrasto sufficiente tra la matrice del biofilm e il citoplasma fungino (Figura S7B). Quando i batteri sono presenti, la potenza/guadagno del laser deve essere ridotta per evitare la sovraesposizione delle cellule batteriche (Figura S7C). Di conseguenza, il contrasto tra citoplasma fungino e aree extracellulari non è così pronunciato, e le impostazioni dell'immagine come la dimensione del foro stenopeico, la dimensione dei pixel e il tempo di permaneo dei pixel devono essere scelte con grande cura per l'analisi ratiometrica.
Per quanto riguarda tutte le tecniche basate sulla microscopia, la qualità dell'immagine e il tempo di acquisizione sono inversamente correlati. Negli attuali biofilm tra regni, era necessario un tempo di imaging di 30 dollari, idealmente 1 min, per ottenere una qualità adeguata per la successiva analisi del pH. In confronto, i biofilm che solo i batteri del porto possono essere immaginati con una qualità sufficiente in 10 s o meno29. Per le analisi microscopiche della crescita, struttura o composizione dei biofilm, i tempi di acquisizione di 1 min non rappresentano un problema e, in molti casi, ciò può valere anche per le registrazioni del pH. Tuttavia, i cambiamenti estremi del pH, come la rapida acidificazione osservata immediatamente dopo l'esposizione al glucosio (1 unità/min), sono difficili da monitorare nei biofilm cross-kingdom.
Il lavoro attuale dimostra che le registrazioni di pH ratiometrico con C-SNARF-4 sono realizzabili in biofilm cross-kingdom composti da S. mutans e C. albicans. Studi futuri possono utilizzare il metodo per analizzare i cambiamenti del pH nei biofilm tra regni con una maggiore diversità delle specie, in particolare nei biofilm coltivati in situ (cioè nei bambini con carie della prima infanzia)30. In questo studio, il pH nei biofilm è stato monitorato in condizioni statiche e per un tempo di osservazione limitato di 15 min, subito dopo un impulso di glucosio. Ulteriori progressi possono includere l'applicazione di un flusso di fluido per imitare le condizioni in situ più da vicino14,31,32. Inoltre, la pH ratiometria può essere utilizzata per studiare l'impatto di varie condizioni nutrizionali sui cambiamenti di pH a lungo termine nei biofilm cross-kingdom e contribuire a chiarire l'effetto del pH dei biofilm sui tessuti ospiti sottostanti. Anche in questo caso, la demineralizzazione dello smalto dentale nelle carie della prima infanzia può servire come un esempio prominente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Anette Aakjar Thomsen e Javier E. Garcia sono riconosciute per un eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano Rubens Spin-Neto per fruttuose discussioni sull'analisi delle immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H.
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P.
