Summary
Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH'ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.
Abstract
Hem mantar hem de bakteri hücrelerinden oluşan krallıklar arası biyofilmler, endodontik enfeksiyonlar, periodontit, mukozal enfeksiyonlar ve en önemlisi erken çocukluk çürükleri gibi çeşitli ağız hastalıklarında rol oynarlar. Tüm bu koşullarda, biyofilm matrisindeki pH mikrop-konak etkileşimlerini ve dolayısıyla hastalığın ilerlemesini etkiler. Bu protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerdeki pH dinamiklerini izlemek için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntemi tanımlamaktadır. Biyofilmlerin hücre dışı bölgelerindeki pH düşüşlerini belirlemek için pH bağımlı çift emisyon spektrumu ve oranmetrik probu C-SNARF-4'ün boyama özellikleri nden yararlanılır. Prob ile pH oranlı metritrinin kullanımı, görüntüleme parametrelerinin titiz bir şekilde seçilmesi, boyanın ayrıntılı bir kalibrasyonu ve görüntü verilerinin dikkatli, eşik tabanlı post-processing'i gerektirir. Doğru kullanıldığında, teknik bir biyofilmin farklı alanlarında hücre dışı pH'ın hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve böylece zaman içinde hem yatay hem de dikey pH degradelerinin izlenmesini sağlar. Konfokal mikroskopi nin kullanımı Z-profillemi 75 μm veya daha az ince biyofilmlerle sınırlarken, pH ratiometrisi kullanımı krallıklar arası biyofilmlerde önemli bir virülans faktörünün noninvaziv çalışması için idealdir.
Introduction
Hem mantar hem de bakteri türlerini içeren krallıklar arası biyofilmler oral kavitede çeşitli patolojik koşullarda yer almaktadır. Candida spp. sıklıkla endodontikenfeksiyonlardan izole edilmiş 1 ve periodontal lezyonlardan2,3. Mukozal enfeksiyonlarda, mitis grubundan streptokok türleri mantar biyofilm oluşumunu geliştirmek için gösterilmiştir, doku invazyonu, ve hem in vitro hem de murine modelleri yayma4,5,6,7. En ilginci, Candida spp oral taşıma. çocuklarda çürük yaygınlığı ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır8. Kemirgen modellerinde gösterildiği gibi, Streptococcus mutans ve Candidas albicans arasında simbiyotik bir ilişki hücre dışı polisakkaritüretimini artırır ve kalın ve daha karojenik biyofilm oluşumuna yol açar9,10.
Yukarıda bahsedilen tüm koşullarda, özellikle erken çocukluk çürükleri, biyofilm pH hastalığın ilerlemesi için önemlidir, ve asitojenik mikroortamların geliştirilmesi için biyofilm matris in güzide rolü11 devletler çapraz krallık biyofilm içinde pH değişiklikleri incelenmesine olanak sağlayan metodolojiler için çağırır. Bakteriyel12 ve mantar13 biyofilm içinde pH izlemek için basit ve doğru konfokal mikroskopi tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Oranmetrik boya C-SNARF-4 ve eşik tabanlı görüntü işleme sonrası, hücre dışı pH bir biyofilm14her üç boyutta gerçek zamanlı olarak belirlenebilir. Biyofilmlerde mikroskopise dayalı pH izleme için yayınlanan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, C-SNARF-4 ile pH oranlı metrisi basit ve ucuzdur, çünkü referans boya15 veya iki foton uyarma16içeren parçacık veya bileşiklerin sentezini gerektirmez. Sadece bir boya kullanımı prob bölümleme ile sorunları önler, floresan kanama-through, ve seçici ağartma16,17,18 hala hücre içi ve hücre dışı pH arasında güvenilir bir farklılaşma için izin verirken. Son olarak, boya ile kuluçka biyofilm büyüme sonra yapılır, hangi laboratuvar ve yerinde yetiştirilen biyofilmler hem de incelenmesine olanak sağlar.
Bu çalışmanın amacı, pH orantisi kullanımını genişletmek ve krallıklar arası biyofilmlerdeki pH değişikliklerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Kavram kanıtı olarak, yöntem glukoza maruz kalan S. mutanlar ve C. albicanlardan oluşan çift tür biyofilmlerinde pH'ı izlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tükürük toplama protokolü Aarhus İlçesi Etik Komitesi (M-20100032) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Krallıklar Arası Biyofilmlerin Yetiştirilmesi
- Aerobik koşullarda 37 °C'de kan agar plakaları üzerinde S. mutans DSM 20523 ve C. albicans NCPF 3179 yetiştirin.
- Her organizmanın tek kolonilerini 5 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) ile dolu test tüplerine aktarın. 37 °C'de aerobik koşullarda 18 saat büyüyün.
- 5 dk. 1.200 x g. Bir gecede kültürleri santrifüj, fizyolojik salin hücreleri resuspend ve C. albicans (~ 107 hücreleri / mL) ve S. mutans (~ 108 hücre / mL) için 0,5 OD550 nm ayarlayın. S. mutans süspansiyon seyreltmek 1:10 steril fizyolojik salin ile (~ 107 hücreleri / mL).
- Pipet 50 μL steril tükürük çözeltisi, de Jong ve ark.19yöntemine göre hazırlanan, mikroskopi için optik bir alt 96-iyi plaka kuyuları içine. 37 °C'de 30 dk kuluçka. Kuyuları 100 μL steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. Kuyuları boşaltın.
- Her kuyuya 100 μL C. albicans süspansiyon ekleyin. 90 dk. 3x steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın 37 °C'de kuluçka.
NOT: Yıkama sırasında kuyuları tamamen boşaltmayın. Aşırı kesme kuvvetini önlemek için 20°L'lik bir rezervuar bırakın. - Her kuyuya 100 μL ısı yalıtımlı fetal sığır serumu (56 °C'de 30 dakika için inaktive) ekleyin. 37 °C'de 2 saat boyunca inkübed. Steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. 20 μL'lik bir rezervuar bırakarak kuyuları boşaltın.
- Her kuyuya 100 μL S. mutans süspansiyon (adım 1.3'te hazırlanmış) ekleyin. % 5 sakaroz içeren BHI 150 μL ekleyin. 37 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın. Eski biyofilmleri yetiştirirken, orta günlük taze BHI değiştirin. Krallıklar arası biyofilm büyüme aşamasının sonunda steril fizyolojik salinle 5kat yıkayın.
2. Oranmetrik pH Görüntüleme
NOT:Biyofilm büyümesi tamamlandıktan hemen sonra oranmetrik pH görüntülemenin yapılması gerekmektedir.
- Oranmetrik pH görüntüleme için, 63x yağ veya su daldırma lensi, 543 nm lazer hattı ve spektral görüntüleme sistemi (yani META dedektörü) ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtmak için bir kuluçka makinesi kullanın.
- 576−608 nm'den yeşil floresan tespiti ve 629−661 nm'den kırmızı floresan'ın eş zamanlı olarak algılanmasını sağlamak için dedektörü ayarlayın. Uygun bir lazer gücü seçin ve aşırı ve az pozlama önlemek için kazanç.
NOT: Görüntülerin pozlanması en iyi palet görüntülerinde yanlış boyama ile görülür. - İğne deliği boyutunu 1 Havadar Ünite veya ~0,8 m'lik optik dilimolarak ayarlayın. Ortalama seçeneği kullanarak 2 satır ortalaması seçin.
NOT: Bir dizi denemenin başında, seçilen mikroskop ayarlarının bakteri hücreleri, mantar hücre duvarları, biyofilm matrisi ve mantar sitoplazması arasında net bir kontrast sağlayıp sağlamadığını kontrol edin. - 100 μL steril fizyolojik salin içeren hazırlayın 0.4% (w / v) glikoz, pH 7 titrated. C-SNARF-4 (dimetil sülfoksit 1 mM) bir stok çözeltisi hazırlayın. Boyayı 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.
DİkKAT: Oranmetrik boyayı kullanırken nitril eldiven takın. - 20 μL'lik bir rezervuar bırakarak, bir çapraz krallık biyofilm ile kuyulardan birini boşaltın. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve biyofilmi görüntülemeye başlayın.
- Biyofilmin farklı yerlerinde tek görüntü veya Z-yığınları edinin. Zaman içinde belirli görüş alanlarındaki pH değişikliklerini izlemek için mikroskop yazılımındaki X-Y konumunu işaretleyin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.
- Farklı bir kuyuda yetiştirilen her biyofilmin analizi için 2.4-2.6 adımlarını tekrarlayın.
3. Oranmetrik Boyanın Kalibrasyonu
NOT: Boyanın kalibrasyonu ve kalibrasyon eğrisinin montajı oranmetrik pH görüntülemeden farklı bir günde yapılabilir.
- 35 °C'de 0,2 pH birim adımlarla pH 4.0−7.8'e ayarlanmış 50 mM 2-morolinoetanesülfonik asit (MES) tamponu hazırlayın. Pipet 150 μL her tampon çözeltisi bir optik alt 96-iyi plaka kuyuları içine mikroskopi için.
- Boyayı 96 kuyulu plakanın tampon dolu kuyularına 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin. 5 dakika boyunca dengeleyelim.
- Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtın. Oranmetrik pH görüntüleme ile aynı mikroskop ayarlarını seçin. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Kuyuların dibine odaklan. Tüm tampon çözümleri için kuyunun alt kısmından 5 μm yukarıda iki görüntü (yeşil ve kırmızı kanal) edinin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.
- Kalibrasyon deneyini triplicate olarak gerçekleştirin.
- Tüm görüntüleri TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Bunları özel görüntü analizi yazılımına (yani ImageJ20'ye)aktarın. Lazerle çekilen görüntüleri, arabellek çözümlerinin ilgili görüntülerinden kapatarak İşleme' yi tıklatarak çıkarın | Görüntü Hesaplama | Çıkar ).
NOT: Gerekirse, Resim | Kırpma. - Yeşil kanal görüntülerini kırmızı kanal görüntüleri ne kadar bölve analiz et ' i tıklatarak ortaya çıkan görüntülerdeki ortalama floresan yoğunluklarını hesaplayın | Histogram.
- Üç aylık deneylerden, ortalama yeşil/kırmızı oranları pH'a göre çizin. Bir işlevi kalibrasyon verilerine (örneğin, MyCurveFit) sığdırmak için özel yazılım kullanın.
4. Dijital Görüntü Analizi
NOT:Dijital görüntü analizi boya ve oranmetrik pH görüntülemenin kalibrasyonundan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.
- Yeşil ve kırmızı kanallı biyofilm görüntülerini ayrı klasörlerde saklayın ve her iki dosya serisini sıralı sayılarla yeniden adlandırın (örneğin, GREEN_0001). Görüntüleri özel görüntü analizi yazılımına (örneğin, ImageJ) aktarın. Analiz Et ' i tıklatın | Histogram lazer kapalı çekilen görüntülerde ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek ve Süreç tıklayarak biyofilm görüntüleri değerini çıkarmak için | Matematik | Çıkar.
- 2 resim serisini özel görüntü analizi yazılımına (yani daime21)aktarın. Kırmızı kanal görüntülerinin eşiğe dayalı bölümlemesini gerçekleştirin (Segment | Otomatik segmentasyon | Özel eşik). Mantar sitoplazmasının floresan yoğunluğunun üzerindeki 'düşük' eşiği ve mantar hücre duvarlarının ve bakterilerin yoğunluğunun altındaki 'yüksek' eşiği ayarlayın.
NOT: Uygun eşikler seçildiğinde, yalnızca hücre dışı alanlar nesne olarak kabul edilir. - Parçalı görüntü serisinin nesne katmanını yeşil kanal görüntü serisine aktarın. Bunu yapmak için Segment | Nesne katmanını aktarın.
NOT: Hücre dışı alanlar ile mantar sitoplazması arasındaki kontrast tek tek renk kanallarında çok zayıfsa, Düzenleme 'yi tıklatarak segmentasyondan önce yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal serisine ekleyin | Görüntü hesap makinesi | Ek olarak. 4.2 altında açıklandığı şekilde segmentasyon gerçekleştirin ve parçalı görüntü serisinin nesne katmanını hem yeşil hem de kırmızı kanallı görüntü serisine aktarın. - Kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisindeki nesne olmayan pikselleri silmek için nesne düzenleyicisini çalıştırın (Visualizer | Nesne editörü | Tüm görüntülerde | Nesne olmayan pikselleri silin). Şimdi biyofilm görüntüleri hem bakteriyel hem de mantar hücrelerinden temizlenir. İşlenen görüntü serisini TIF dosyaları olarak dışa aktarın.
- Her iki resim serisini de ImageJ'e aktarın. ImageJ, nesne olmayan tüm piksellere 0 yoğunluğu atar. Kırmızı görüntü serisini (R1) kendi başına bölerek bu pikselleri kaldırın (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Böl; Resim 2: R1) ve ortaya çıkan görüntü serisini (R2) orijinal kırmızı görüntü serisiile çarpma (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Çarpma; Resim 2: R2). NaN'ın R1'de 0 şiddetinde tüm piksellere atanması dışında, R1 ile aynı olan üçüncü bir görüntü serisi (R3) oluşturulur. Yeşil görüntü serisi ile aynı şekilde devam edin.
- 'Ortalama' filtresini kullanın (İşlem | Filtreler | Ortalama | Yarıçap | 1 piksel) kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisi dedektör gürültü telafi etmek için. Yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal görüntü serisine böl (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: G3; İşlem: Böl; Resim 2: R3). Ortaya çıkan görüntü serisi (G3/R3), tüm nesne pikselleri için yeşil/kırmızı oranını gösterir.
- Her görüntü için ortalama oranı hesaplamak (Analiz | Histogram). Görüntülerdeki oranların daha iyi görsel gösterimi için yanlış boyama uygulayın (Resim | Arama Tabloları). Yeşil/kırmızı oranları 3,6'nın altına takılan işlevi kullanan pH değerlerine dönüştürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 saat ve 48 saat sonra, sağlam çapraz krallık biyofilmler kuyu plakaları geliştirdi. C. albicans ipliksi büyüme değişen derecelerde gösterdi ve S. mutans yüksekliği 35 μm kadar yoğun kümeler oluşturdu. Mantar hyphae etrafında gruplanmış Tek hücre ve S. mutan zincirleri ve büyük hücreler arası boşluklar hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir(Şekil S1).
Oranmetrik boyanın kalibrasyonu asimetrik sigmoidal eğri13,14verir. Biyofilmlerdeki hücre dışı pH, farklı mikroskobik görüş alanlarında farklı oranlarda glikoza maruz kaldıktan sonra ilk 5 dakika içinde hızlı bir şekilde düştü. Bundan sonra asitleşme yavaşlar ve genellikle 15 dakika dan sonra 5.5-5.8 değerlerine ulaşır (Şekil 1). Çoğaltma biyofilmler benzer bir davranış gösterdi, ortalama pH sadece hafif varyasyonları ile(Şekil S2).
pH hesaplamalarının doğruluğu, satın alma sırasında dikkatli bir görüntü ayarları seçimine bağlıdır. Söz konusu biyofilmler için, 0,8 μm'lik optik dilim, hücre dışı alanlar ile mantar sitoplazması arasında mümkün olan en iyi kontrastı elde etmek için ideal olduğunu kanıtlamıştır(Şekil S3). Ayrıca, piksel boyutu 0,28 μm(Şekil S4),102,4 μs(Şekil S5)piksel çalışma süresi ve 2(Şekil S6)satır ortalaması ~ 1 dk kabul edilebilir bir görüntü edinme süresi ile birlikte iyi bir kontrast sağladı. Görüntü sonrası işleme sırasında, tüm bakteri ve mantar hücreleri görüntülerden çıkarılırken, çevredeki hücre dışı alanların çoğu sonraki pH analizine dahil edildi. Görüntülerin parlaklığına bağlı olarak, farklı üst ve alt eşikler seçilmelidir (Şekil 2).
Şekil 1 ve Şekil S2'de gösterilen pH verileri biyofilm-substratum arabiriminden 5 μm olarak kaydedildi. Substrattan artan uzaklık ve biyofilmlerdeki hücre yoğunluğuna bağlı olarak floresan yoğunluğu azalır ve bu da hücreler ile matris arasında daha düşük bir kontrasta yol açmaktadır. Ancak, mevcut çalışmada yetiştirilen ince biyofilmlerde (~35 μm) biyofilmin üst kısmındaki kontrast güvenilir görüntü analizine olanaksağlamıştır (Şekil S7A).
Şekil 1: Glukoza maruz kalan krallıklar arası biyofilmlerde pH oranı nın kullanımı. (A) Lekeli bir biyofilmde görüş alanı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş ve oranmetrik analizden önce bakteriyel ve mantar hücrelerinin kapsadığı alan çıkarılmıştır. (B) Hücre dışı alandaki pH, bir arama tablosu (16 renk) kullanılarak hesaplandı ve görüntülendi. Ölçek çubukları = 20 μm. (C) 24 saat lik çapraz krallık biyofilmlerinde pH, farklı görüş alanlarında biraz farklı oranlarda glikoza maruz kaldıktan sonra hızla düştü. Hata çubukları = standart sapma (SD). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lekeli biyofilmlerin eşik tabanlı görüntü segmentasyonu. Lokal pH değişimleri nedeniyle biyofilmlerdeki floresan yoğunluğu zaman içinde değişir. (A) ve (B) sırasıyla 1 dakika ve 15 dk glukoza maruz kaldıktan sonra aynı mikroskobik görüş alanını gösterirler. Görüntü segmentasyonu sırasında, bakteri ve mantar hücrelerinin kapsadığı tüm alanları ortadan kaldırmak için yüksek ve düşük eşiklerin yeterli şekilde seçilmesi gerekir. (C) Mavi alanlar düşük eşik (40), kırmızı alanlar yüksek eşik (115) tarafından ortadan kaldırıldı. (D) Sadece hücre dışı alanlar nesne olarak kabul edildi (turuncu çizgilerle çevrili). (E) Mikrobiyal hücrelerin kapsadığı alanın ortadan kaldırılmasından sonra biyofilm matrisinde pH hesaplaması yapılabilir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S1: Tipik 24 saat çapraz krallık biyofilm oranlarımetrik boya ile boyanmıştır. Birçok C. albicans hücreleri ipliksi büyüme görüntülerken, S. mutans (sarı) hücreler yoğun kümeler oluşturdu veya tek hücre veya zincir olarak mantar hyphae etrafında lokalize. Büyük hücreler arası boşluklar hacimli bir biyofilm matrisinin varlığını gösteriyordu. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S2: Glukoza maruz kalan 24 saat lik krallık lar arası biyofilmlerde pH gelişimi. (A), (B), ve (C) PH, glikoza maruz kaldıktan sonra 15 dk boyunca üç kopya biyofilmde orantılı olarak belirlendi. İlk 5 dakika daki hızlı bir pH düşüşünden sonra asitleşme yavaşladı ve 15 dakika sonra 5.5−5.8 seviyelerine ulaşıldı. Oranmetrik probunun kalibrasyonu sadece bir kez yapıldı. Hata çubukları = SD. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S3: Optik dilim kalınlığının görüntü kontrastı üzerindeki etkisi. (A)2 Havadar Birim iğne deliği boyutu ve 1,6 μm optik dilim kalınlığı ve (B) 1 Havadar Birim ve 0,8 μm optik dilim ile boyanmış biyofilmlerin görüntüleri elde edilmiştir. 1 Havadar Birim'de görüntü edinimi için daha yüksek bir lazer gücü/kazancı na ihtiyaç vardı, ancak mantar sitoplazması ile hücre dışı alanlar arasındaki kontrast düzeldi. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S4: Çözünürlüğün görüntü kontrastı üzerindeki etkisi. Lekeli biyofilmlerin görüntüleri (A) 1,12 μm,(B) 0,56 μm,(C) 0,28 μm, (D) 0,14 μm ve (E) 0,11 μm. Piksel boyutunun 0,28 μm'nin altındaki küçültülmesi hücre dışı alanlar ile mantar kistoplamı arasındaki kontrastı artırmadı. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S5: Tetkik hızının görüntü kontrastı üzerindeki etkisi. (A ) 12.8 μs, (B) 25.6 μs, (D) 51.2 μs, (D) 102 μs ve (E) 164 μs. Piksel kullanım süresini 102 μs'ın üzerinde artırmak hücre dışı ve hücre içi alanlar arasındaki kontrastı artırmadı. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S6: Ortalama nın görüntü kontrastı üzerindeki etkisi. Lekeli biyofilmlerin görüntüleri (A) 1, (B) 2 ve (C) 4'ün çizgi ortalamaları (ortalama) ile elde edildi. 2 satır ortalaması kontrast ve edinme süresi arasında en iyi uzlaşmasağladı. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S7: Tamamen mantar biyofilmlerinde ve krallıklar arası biyofilmlerde görüntü kontrastı. (A) Lekeli bir çapraz krallık biyofilminin üst kısmı arayüzden 30 μm uzakta görüntülendi. Hücre dışı ve hücre içi alanlar arasındaki kontrast biyofilm tabanından daha düşük olmasına rağmen oranmetrik pH analizi için yeterliydi. (B) A C. albicans monotür biyofilm pH oranlı metritri için görüntülendi. Mantar hücre duvarları ve sitoplazma arasındaki kontrastı optimize etmek için lazer gücü/kazancı artırılabilir. (C) Krallıklar arası biyofilmlerde, parlak floresan bakteriler lazer gücünün/kazancının daha da artacağını önledi. Bu nedenle, mantar hücre duvarları ve sitoplazma arasındaki kontrast daha az tamamen mantar biyofilm daha belirgindir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. albicans ve Streptococcus spp içeren çapraz krallık biyofilmlerin ekimi için farklı protokoller. daha önce9,22,23,24,25açıklanmıştır . Ancak, mevcut kurulum basit büyüme koşulları, düzenli çalışma günleri ile uyumlu bir zaman çizelgesi, dengeli bir tür bileşimi ve hacimli biyofilm matris gelişimi üzerinde duruluyor. Ayrıca, 96-iyi plakalar bir ölçüde yapışma oral koşulları taklit etmek için tükürük çözeltisi ile kaplanmıştır.
C-SNARF-4 ile pH orantılarının kullanımı biyofilm pH hızlı ölçümleri için ucuz bir yöntemdir, avantajları ve dezavantajları ayrıntılı olarak ele alınmıştır12,26. Kısacası, teknik biyofilmler içinde farklı yerlerde pH değerlendirilmesi ve böylece yatay pH gradyanlarının ve zaman içinde pH gelişmelerin izlenmesi için izin verir27. Dikey pH profilleri de kaydedilebilir, ancak penetrasyon derinliği konfokal mikroskopi kullanımı ile sınırlıdır. Bu nedenle, pH ratiometri pH mikroelektrotlar için daha hızlı, daha çok yönlü ve daha az invaziv bir alternatif temsil eder, şu anda kalın biyofilmlerin Z-profilleme için tercih edilen yöntem28. Biyofilmlerde pH kayıtları için diğer mikroskopi bazlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, C-SNARF-4 ile pH oranlı metrisi sadece bir leke kullanma avantajına sahiptir. Bu nedenle, diferansiyel floresan davranış ve farklı boyalar arasındaki etkileşim ortaya çıkabilecek çeşitli sorunlar26atlatılır.
Krallıklar arası biyofilmlerde, mikrobiyal biyokütle ile hücre dışı alanlar arasındaki eşik tabanlı farklılaşma, sadece bakteriyel veya mantar hücrelerini oluşturan biyofilmlere kıyasla bazı sorunlar doğurmaktadır. Bakteri hücreleri oranmetrik boyayı içselleştirir ve biyofilm matrisine göre parlak floresan sinyali gösterirler, ama aynı zamanda mantar hücre duvarlarına göre. Mantar hücre duvarları biyofilm matrisinden biraz daha parlak görünür, bu da mantar sitoplazması daha yüksek floresan gösterir. Sadece mantar hücrelerinden oluşan biyofilmlerde, görüntüler yüksek lazer gücü/kazancı ile elde edilebilir, bu da biyofilm matrisi ile mantar sitoplazması arasında yeterli kontrastsağlar (Şekil S7B). Bakteriler mevcut olduğunda, bakteri hücrelerinin aşırı maruz kalmalarını önlemek için lazer gücü/kazancı azaltılmalıdır(Şekil S7C). Bu nedenle, mantar sitoplazması ve hücre dışı alanlar arasındaki kontrast belirgin değildir ve pinhole boyutu, piksel boyutu ve piksel-dolma süresi gibi görüntü ayarları oranmetrik analiz için büyük bir özenle seçilmelidir.
Tüm mikroskopi tabanlı tekniklere gelince, görüntü kalitesi ve edinim süresi ters orantılıdır. Mevcut krallıklar arası biyofilmlerde, sonraki pH analizi için uygun kaliteyi elde etmek için ~ 30 s, ideal 1 dk bir görüntüleme süresi gerekliydi. Buna karşılık, sadece bakteri barındıran biyofilmler 10 s veya daha az29yeterli kalitede görüntülenebilir. Biyofilm büyüme, yapı veya kompozisyon mikroskopisi analizleri için, 1 dk edinme süreleri bir sorun teşkil etmez ve birçok durumda, bu da pH kayıtları için geçerli olabilir. Ancak, glikoza maruz kaldıktan hemen sonra (ΔpH > 1 birim/dak) gözlenen hızlı asitleşme gibi aşırı pH değişikliklerini krallıklar arası biyofilmlerde izlemek zordur.
Bu çalışma, C-SNARF-4 ile orantılı pH kayıtlarının S. mutans ve C. albicanlardanoluşan krallıklar arası biyofilmlerde uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar, özellikle yerinde yetiştirilen biyofilmlerde (yani erken çocukluk çürükleri olan çocuklarda)30,daha fazla tür çeşitliliği ile krallıklar arası biyofilmlerdeki pH değişikliklerini analiz etme yöntemini kullanılabilir. Bu çalışmada, biyofilmlerdeki pH statik koşullarda ve glukoz darbesi sonrası sınırlı bir gözlem süresi için 15 dk olarak izlendi. Daha fazla gelişmeler daha yakından14,31,32yerinde koşullarda taklit etmek için bir sıvı akışı uygulaması içerebilir. Ayrıca, pH oranları çeşitli beslenme koşullarının krallıklar arası biyofilmlerdeki uzun süreli pH değişimleri üzerindeki etkisini incelemek ve biyofilm pH'sının altta yatan konak dokular üzerindeki etkisini nakışla aydınlatmak için kullanılabilir. Yine erken çocukluk döneminde diş minesinin demineralizasyonu önemli bir örnek teşkil edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Anette Aakjær Thomsen ve Javier E. Garcia mükemmel teknik destek için kabul edilmektedir. Yazarlar görüntü analizi üzerinde verimli tartışmalar için Rubens Spin-Neto teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H.
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P.
