Summary
El protocolo describe el cultivo de biopelículas entre reinos consistentes en Candida albicans y Streptococcus mutans y presenta un método basado en microscopía confocal para el monitoreo del pH extracelular dentro de estas biopelículas.
Abstract
Las biopelículas entre reinos que consisten en células fúngicas y bacterianas están involucradas en una variedad de enfermedades bucales, como infecciones endodónticas, periodontitis, infecciones mucosas y, sobre todo, caries en la primera infancia. En todas estas condiciones, el pH en la matriz de biopelícula afecta las interacciones microbio-huésped y, por lo tanto, la progresión de la enfermedad. El presente protocolo describe un método basado en microscopía confocal para monitorear la dinámica de pH dentro de biopelículas entre reinos que comprenden Candida albicans y Streptococcus mutans. El espectro de doble emisión dependiente del pH y las propiedades de tinción de la sonda ratiométrica C-SNIF-4 se explotan para determinar las caídas de pH en áreas extracelulares de las biopelículas. El uso de la ratiometría de pH con la sonda requiere una elección meticulosa de parámetros de imagen, una calibración exhaustiva del tinte y un procesamiento posterior cuidadoso y basado en umbrales de los datos de la imagen. Cuando se utiliza correctamente, la técnica permite la evaluación rápida del pH extracelular en diferentes áreas de una biopelícula y, por lo tanto, el seguimiento de los gradientes de pH horizontales y verticales a lo largo del tiempo. Mientras que el uso de microscopía confocal limita el perfilado Z a biopelículas delgadas de 75 m o menos, el uso de ratiometría de pH es ideal para el estudio no invasivo de un factor de virulencia importante en biopelículas entre reinos.
Introduction
Las biopelículas entre reinos que comprenden especies fúngicas y bacterianas están involucradas en varias condiciones patológicas en la cavidad oral. Candida spp. se han aislado con frecuencia de infecciones endodónticas1 y de lesiones periodontales2,3. En las infecciones mucosas, se ha demostrado que las especies estreptocócicas del grupo de mitis mejoran la formación de biopelículas fúngicas, la invasión de tejidos y la diseminación tanto en los modelos in vitro como murinos4,5,6,7. Lo más interesante es que el transporte oral de Candida spp. ha demostrado estar asociado con la prevalencia de caries en niñosde 8años. Como se muestra en los modelos de roedores, una relación simbiótica entre Streptococcus mutans y Candidas albicans aumenta la producción de polisacáridos extracelulares y conduce a la formación de biopelículas más gruesas y cariogénicas9,10.
En todas las condiciones antes mencionadas, la caries de la primera infancia en particular, el pH de biopelícula es importante para la progresión de la enfermedad, y el papel eminente de la matriz de biopelículas para el desarrollo de microambientes acidogénicos11 requiere metodologías que permitan estudiar los cambios de pH dentro de las biopelículas entre reinos. Se han desarrollado enfoques simples y precisos basados en microscopía confocal para controlar el pH dentro de las biopelículas bacterianas12 y13 fúngicas. Con el tinte ratiométrico C-SNARF-4 y el postprocesamiento de imágenes basado en umbrales, el pH extracelular se puede determinar en tiempo real en las tres dimensiones de un biofilm14. En comparación con otras técnicas publicadas para el monitoreo de pH basado en microscopía en biopelículas, la ratiometría de pH con C-SNARF-4 es simple y barata, ya que no requiere la síntesis de partículas o compuestos que incluyan un tinte de referencia15 o el uso de la excitación de dos fotones16. El uso de un solo tinte evita problemas con la compartimentación de la sonda, el sangrado fluorescente y el blanqueo selectivo16,17,18, al tiempo que permite una diferenciación fiable entre el pH intra y extracelular. Finalmente, la incubación con el tinte se realiza después del crecimiento del biofilm, lo que permite estudiar tanto biopelículas cultivadas en laboratorio como in situ.
El objetivo del presente trabajo es ampliar el uso de la ratiometría de pH y proporcionar un método para estudiar los cambios de pH en las biopelículas entre reinos. Como prueba de concepto, el método se utiliza para monitorear el pH en biopelículas de dos especies compuestas por S. mutans y C. albicans expuestos a la glucosa.
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Protocol
El protocolo para la recolección de saliva fue revisado y aprobado por el Comité de ética del condado de Aarhus (M-20100032).
1. Cultivo de Biopelículas entre reinos
- Cultivar S. mutans DSM 20523 y C. albicans NCPF 3179 en placas de agar en sangre a 37 oC en condiciones aeróbicas.
- Transfiera colonias individuales de cada organismo a tubos de ensayo llenos de 5 ml de infusión cardíaca cerebral (BHI). Crecer durante 18 h en condiciones aeróbicas a 37oC.
- Centrifugar los cultivos nocturnos a 1.200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en salina fisiológica y ajuste la DO550 nm a 0,5 para C. albicans (107 células/ml) y S. mutans (108 celdas/ml). Diluir la suspensión de S. mutans 1:10 con solución salina fisiológica estéril (107 células/ml).
- Pipetear 50 l de solución salival estéril, preparada según el método de Jong et al.19, en los pozos de una placa óptica inferior de 96 pocillos para microscopía. Incubar durante 30 min a 37oC. Lavar los pozos 3 veces con 100 ml de solución salina fisiológica estéril. Vacíe los pozos.
- Añadir 100 l de suspensión de C. albicans a cada poca. Incubar a 37oC durante 90 min. Lavar 3x con solución salina fisiológica estéril.
NOTA:No vacíe los pozos completamente durante el lavado. Deje un depósito de 20 l para evitar fuerzas de cizallamiento excesivas. - Añadir 100 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (inactivado a 56 oC durante 30 min) a cada pocal. Incubar a 37oC durante 2 h. Lavar 3x con solución salina fisiológica estéril. Vacíe los pozos, dejando un depósito de 20 l.
- Añadir 100 l de suspensión de S. mutans (preparado en el paso 1.3) a cada poca. Añadir 150 s l de BHI que contenga 5% de sacarosa. Incubar a 37oC durante 24 h o más. Cuando se cultivan biopelículas más antiguas, cambie el medio diario a BHI fresco. Al final de la fase de crecimiento del biofilm entre reinos, lavar 5 veces con solución salina fisiológica estéril.
2. Imágenes de pH ratiométrica
NOTA:Las imágenes de pH de la relación de datos deben realizarse inmediatamente después de que se haya completado el crecimiento del biofilm.
- Para obtener imágenes de pH ratiométricas, utilice un microscopio de exploración láser confocal invertido con una lente de inmersión de agua o aceite de 63x, una línea láser de 543 nm y un sistema de imágenes espectrales (es decir, detector META) para permitir la toma de imágenes de señales fluorescentes superpuestas. Utilice una incubadora para calentar la etapa del microscopio a 35 oC.
- Ajuste el detector para asegurar la detección de fluorescencia verde de 576 a 608 nm y la detección simultánea de fluorescencia roja de 629 a 661 nm. Elija una potencia láser y ganancia apropiadas para evitar la sobreexposición y la subexposición.
NOTA: La exposición de las imágenes se ve mejor en imágenes de paletas con coloración falsa. - Establezca el tamaño del agujero en 1 unidad ventilada o una rebanada óptica de 0,8 m. Establezca el tamaño de la imagen en 512 x 512 píxeles y la velocidad de escaneado en 2. Elija un promedio de línea de 2, utilizando la opción media.
NOTA:Al comienzo de una serie de experimentos, compruebe que la configuración del microscopio elegida proporciona un claro contraste entre las células bacterianas, las paredes celulares de hongos, la matriz de biopelícula y el citoplasma de hongos. - Preparar 100 ml de solución salina fisiológica estéril que contenga 0,4% (p/v) de glucosa, valorada a pH 7. Preparar una solución en stock de C-SNARF-4 (1 mM en sulfóxido de dimetil). Añadir el tinte a una concentración final de 30 m.
ADVERTENCIA: Use guantes de nitrilo al manipular el tinte ratiométrico. - Vacíe uno de los pozos con una biopelícula entre reinos, dejando un depósito de 20 l. Añadir la solución salina estéril que contiene glucosa y el tinte ratiométrico. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa del microscopio y comience a tomar imágenes de la biopelícula.
- Adquirir imágenes individuales o pilas Z en diferentes lugares de la biopelícula. Marque la posición X-Y en el software del microscopio para seguir los cambios de pH en campos de visión particulares a lo largo del tiempo. A intervalos regulares, tome imágenes con el láser apagado para corregir el desplazamiento del detector.
- Repita los pasos 2.4–2.6 para el análisis de cada biopelícula cultivada en un pozo diferente.
3. Calibración del tinte ratiométrico
NOTA: La calibración del tinte y el ajuste de una curva de calibración se pueden realizar en un día diferente a la imagen de pH ratiométrica.
- Preparar una serie de 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) tampón valorado a pH 4.0-7.8 en pasos de 0,2 unidades de pH a 35 oC. Pipetear 150 l de cada solución tampón en los pocillos de una placa óptica de 96 pocillos para microscopía.
- Añadir el tinte a los pozos llenos de tampón de la placa de 96 pocillos a una concentración final de 30 m. Deje equilibrar durante 5 min.
- Caliente la etapa del microscopio a 35 oC. Elija la misma configuración del microscopio que para las imágenes de pH ratiométricas. Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa del microscopio. Concéntrese en la parte inferior de los pozos. Adquiera dos imágenes (canal verde y rojo) para todas las soluciones de búfer, 5 m por encima de la parte inferior del pozo. A intervalos regulares, tome imágenes con el láser apagado para corregir el desplazamiento del detector.
- Realice el experimento de calibración en triplicado.
- Exporte todas las imágenes como archivos TIF. Impórtelos en software de análisis de imágenes dedicado (es decir, ImageJ20). Restar las imágenes tomadas con el láser apagado de las imágenes respectivas de las soluciones de búfer haciendo clic en Proceso . Calculadora de imágenes ? Restar).
NOTA: Si es necesario, recorte las imágenes para eliminar los artefactos en los bordes de la imagen mediante la realización de la selección rectangular con La imagen . Recortar. - Divida las imágenes del canal verde a través de las imágenes del canal rojo y calcule las intensidades medias de fluorescencia en las imágenes resultantes haciendo clic en Analizar . Histograma.
- A partir de los experimentos triplicados, trazar las proporciones medias verde/roja contra el pH. Utilice un software dedicado para ajustar una función a los datos de calibración (es decir, MyCurveFit).
4. Análisis de imágenes digitales
NOTA:El análisis de imágenes digitales se puede realizar en cualquier momento después de la calibración del tinte y la imagen de pH ratiométrica.
- Almacene las imágenes de biofilm de canal verde y rojo en carpetas separadas y cambie el nombre de ambas series de archivos con números secuenciales (por ejemplo, GREEN_0001). Importe las imágenes en un software de análisis de imágenes dedicado (es decir, ImageJ). Haga clic en Analizar (Analizar) Histograma para determinar la intensidad media de la fluorescencia en las imágenes tomadas con el láser apagado y restar el valor de las imágenes de biopelícula haciendo clic en Proceso . Matemáticas ? Restar.
- Importe la serie de 2 imágenes en un software de análisis de imágenes dedicado (es decir, daime21). Realizar una segmentación basada en umbrales de las imágenes de canal rojo (Segmento ? Segmentación automática ? Umbral personalizado). Establezca el umbral "bajo" por encima de la intensidad de fluorescencia del citoplasma fúngico y el umbral "alto" por debajo de la intensidad de las paredes celulares de los hongos y las bacterias.
NOTA:Cuando se han elegido los umbrales adecuados, solo se reconocen como objetos las áreas extracelulares. - Transfiera la capa de objetos de la serie de imágenes segmentadas a la serie de imágenes de canal verde. Para ello, haga clic en Segmentar (Segment) Transferir capa de objetos.
NOTA: Si el contraste entre las áreas extracelulares y el citoplasma fúngico es demasiado débil en los canales de color individuales, añada la serie de imágenes de canal verde a la serie de canales rojos antes de la segmentación haciendo clic en Editar . Calculadora de imágenes ? Adición. Realice la segmentación como se describe en 4.2 y transfiera la capa de objetos de la serie de imágenes segmentadas a la serie de imágenes de canal verde y rojo. - Emplear el editor de objetos para eliminar píxeles que no sean de objeto en la serie de imágenes de canal rojo y verde (Visualizador . Editor de objetos ? En todas las imágenes ? Eliminar píxeles que no sean de objeto). Ahora las imágenes de biopelículas se borran de las células bacterianas y fúngicas. Exporte la serie de imágenes procesadas como archivos TIF.
- Importe ambas series de imágenes a ImageJ. ImageJ asigna una intensidad de 0 a todos los píxeles que no son de objeto. Elimine esos píxeles dividiendo la serie de imágenes rojas (R1) por sí mismo( Calculadora de imágenes ? Imagen 1: R1; Operación: Dividir; Imagen 2: R1) y multiplicando la serie de imágenes resultante (R2) con la serie de imágenes rojas originales (Proceso ? Calculadora de imágenes ? Imagen 1: R1; Operación: Multiplicar; Imagen 2: R2). Se crea una tercera serie de imágenes (R3), idéntica a R1, excepto por el hecho de que NaN se asigna a todos los píxeles con una intensidad de 0 en R1. Proceda de la misma manera con la serie de imágenes verdes.
- Utilice el filtro 'Media' (Proceso ? Filtros ? Significación de la Radio de radio ? 1 píxel) en la serie de imágenes de canal rojo y verde para compensar el ruido del detector. Dividir la serie de imágenes de canal verde por la serie de imágenes de canal rojo (Proceso ? Calculadora de imágenes ? Imagen 1: G3; Operación: Dividir; Imagen 2: R3). La serie de imágenes resultante (G3/R3) muestra la relación verde/roja para todos los píxeles de objeto.
- Calcular la relación media para cada imagen (Analizar ? Histograma). Aplicar coloración falsa para una mejor representación visual de las proporciones en las imágenes (Imagen ? Tablas de búsqueda). Convierta las relaciones verde/roja en valores de pH empleando la función ajustada por debajo de 3.6.
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Representative Results
Después de 24 h y 48 h, robustas biopelículas entre reinos desarrolladas en las placas de pozo. C. albicans mostró diferentes grados de crecimiento filamentoso, y S. mutans formó racimos densos de hasta 35 m de altura. Células y cadenas de S. mutans agrupadas alrededor de hifas fúngicas, y grandes espacios intercelulares indicaron la presencia de una matriz voluminosa(Figura S1).
La calibración del tinte ratiométrico produce una curva sigmoidal asimétrica13,14. El pH extracelular en las biopelículas disminuyó rápidamente en los primeros 5 minutos después de la exposición a la glucosa a diferentes velocidades en diferentes campos microscópicos de visión. A partir de entonces, la acidificación se desaceleró, alcanzando típicamente valores de 5.5–5.8 después de 15 min(Figura 1). Las biopelículas replicadas mostraron un comportamiento similar, con sólo ligeras variaciones en el pH promedio(Figura S2).
La precisión de los cálculos de pH depende en gran medida de una cuidadosa elección de la configuración de la imagen durante la adquisición. Para las biopelículas en cuestión, una rebanada óptica de 0,8 m demostró ser ideal para obtener el mejor contraste posible entre las áreas extracelulares y el citoplasma fúngico(Figura S3). Por otra parte, un tamaño de píxel de 0,28 m(Figura S4), un tiempo de permanencia de píxeles de 102,4 s(Figura S5) y un promedio de línea de 2(Figura S6) proporcionaba un buen contraste junto con un tiempo de adquisición de imagen aceptable de 1 min. Durante el postprocesamiento de la imagen, todas las células bacterianas y fúngicas fueron eliminadas de las imágenes, mientras que la mayoría de las áreas extracelulares circundantes se incluyeron en el análisis de pH posterior. Dependiendo del brillo de las imágenes, se tuvieron que elegir diferentes umbrales superior e inferior(Figura 2).
Los datos de pH que se muestran en la Figura 1 y la Figura S2 se registraron a 5 m de la interfaz biopelícula-sustrato. Con el aumento de la distancia desde el sustrato, y dependiendo de la densidad celular en las biopelículas, la intensidad de la fluorescencia disminuye, lo que resulta en un menor contraste entre las células y la matriz. Sin embargo, en las biopelículas delgadas (35 m) cultivadas en el presente estudio, el contraste en la parte superior de la biopelícula permitió un análisis de imagen fiable(Figura S7A).
Figura 1: Uso de ratiometría de pH en biopelículas entre reinos expuestas a la glucosa. (A) Se realizó una imagen de campo de visión en una biopelícula manchada con microscopía confocal y se eliminó el área cubierta por células bacterianas y fúngicas antes del análisis ratiométrico. (B) El pH en el espacio extracelular se calculó y visualizó utilizando una tabla de búsqueda (16 colores). Barras de escala a 20 m. (C) El pH de las 24 h de biopelículas entre reinos disminuyó rápidamente al exponerse a la glucosa a tasas ligeramente diferentes en diferentes campos de visión. Barras de error: desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Segmentación de imágenes basada en umbrales de biopelículas manchadas. Debido a los cambios locales en el pH, la intensidad de la fluorescencia en las biopelículas cambia con el tiempo. (A) y (B) muestran el mismo campo de visión microscópico después de 1 min y 15 min de exposición a la glucosa, respectivamente. Durante la segmentación de la imagen, es necesario elegir adecuadamente los umbrales altos y bajos para eliminar todas las áreas cubiertas por células bacterianas y fúngicas. (C) Las zonas azules fueron eliminadas por el umbral bajo (40), las áreas rojas por el umbral alto (115). (D) Sólo las áreas extracelulares fueron reconocidas como objetos (rodeadas de líneas naranjas). (E) Después de la eliminación del área cubierta por células microbianas, el cálculo del pH podría realizarse en la matriz de biopelículas. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: Biopelícula típica de 24 h entre reinos manchada con el tinte ratiométrico. Muchas células de C. albicans mostraron crecimiento filamentoso, mientras que las células de S. mutans (amarillas) formaron racimos densos o localizados alrededor de hifas fúngicas como células individuales o cadenas. Grandes espacios intercelulares indicaron la presencia de una matriz de biopelícula voluminosa. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S2: El desarrollo del pH en biopelículas entre reinos de 24 h expuestas a la glucosa. (A), (B) y (C) El pH se determinó de forma ratiométrica en tres biopelículas de réplica durante 15 minutos después de la exposición a la glucosa. Después de una rápida caída del pH en los primeros 5 min, la acidificación se desaceleró, y se alcanzaron niveles de 5,5 a 5,8 después de 15 minutos. Se observaron tasas ligeramente diferentes en diferentes campos de visión microscópicos (cada uno representado por una línea). La calibración de la sonda ratiométrica sólo se realizó una vez. Barras de error: SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S3: Impacto del grosor de la rebanada óptica en el contraste de la imagen. Las imágenes de biopelículas teñidas se adquirieron con (A) un tamaño de agujero de 2 unidades ventiladas y un espesor de rebanada óptica de 1,6 m, y (B) 1 unidad ventilada y una rebanada óptica de 0,8 m. En 1 Unidad Airy, se necesitaba una mayor potencia/ganancia láser para la adquisición de imágenes, pero el contraste entre el citoplasma fúngico y las áreas extracelulares mejoró. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S4: Impacto de la resolución en el contraste de la imagen. Las imágenes de biopelículas manchadas se adquirieron con tamaños de píxeles de (A) 1,12 m, (B) 0,56 ám, (C) 0,28 m, (D) 0,14 m, y (E) 0,11 m. Reducción del tamaño de píxel por debajo de 0,28 m no mejoró el contraste entre las áreas extracelulares y el citoplasma fúngico. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S5: Impacto de la velocidad de escaneo en el contraste de la imagen. Las imágenes de biopelículas manchadas se adquirieron con tiempos de permanencia de píxeles de (A) 12,8 s, (B) 25,6 s, (C) 51,2 s, (D) 102 s, y (E) 164 s. Aumentar el tiempo de permanencia de píxeles más allá de 102 s no mejoró el contraste entre áreas extracelulares e intracelulares. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S6: Impacto del promedio en el contraste de la imagen. Las imágenes de biopelículas manchadas se adquirieron con promedios de línea (media) de (A) 1, (B) 2, y (C) 4. Un promedio de línea de 2 proporcionó el mejor compromiso entre el contraste y el tiempo de adquisición. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S7: Contraste de imagen en biopelículas puramente fúngicas y biopelículas entre reinos. (A) La parte superior de una biopelícula interreino manchada se imageó a 30 m de la interfaz. El contraste entre áreas extracelulares e intracelulares fue menor que en la base del biofilm, pero aún así suficiente para el análisis de pH ratiométrico. (B) Se ha indicado una biopelícula monoespecie de C. albicans para la ratiometría de pH. La potencia/ganancia láser podría aumentarse para optimizar el contraste entre las paredes celulares de los hongos y el citoplasma. (C) En las biopelículas entre reinos, las bacterias brillantemente fluorescentes impedían un mayor aumento de la potencia/ganancia del láser. Por lo tanto, el contraste entre las paredes celulares de hongos y el citoplasma es menos pronunciado que en biopelículas puramente fúngicas. Barras de escala de 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Diferentes protocolos para el cultivo de biopelículas entre reinos con C. albicans y Streptococcus spp. han sido descritos previamente9,22,23,24,25. Sin embargo, la configuración actual se centra en condiciones de crecimiento simples, un cronograma compatible con días laborables regulares, una composición equilibrada de especies y el desarrollo de una matriz de biopelícula voluminosa. Además, las placas de 96 pocillos fueron recubiertas con solución salival para imitar las condiciones orales de adhesión hasta cierto punto.
El uso de la ratiometría de pH con C-SNARF-4 es un método económico para mediciones rápidas del pH de biopelícula, las ventajas y desventajas de las cuales se han discutido en detalle en otros lugares12,26. En resumen, la técnica permite la evaluación del pH en diferentes lugares dentro de las biopelículas y, por lo tanto, el seguimiento de gradientes de pH horizontales y desarrollos de pH a lo largo del tiempo27. También se pueden registrar perfiles de pH verticales, pero la profundidad de penetración está limitada por el uso de microscopía confocal. Por lo tanto, la ratiometría de pH representa una alternativa más rápida, más versátil y menos invasiva a los microelectrodos de pH, que actualmente son el método de elección para la elaboración de perfiles Z de biopelículas gruesas28. En comparación con otros métodos basados en microscopía para grabaciones de pH en biopelículas, la ratiometría de pH con C-SNARF-4 tiene la ventaja de emplear sólo una mancha. Por lo tanto, se eluden varios problemas que pueden surgir del comportamiento fluorescente diferencial y la interacción entre diferentes colorantes26.
En las biopelículas entre reinos, la diferenciación basada en umbrales entre la biomasa microbiana y las áreas extracelulares plantea algunos problemas en comparación con las biopelículas que sólo comprenden células bacterianas o fúngicas. Las células bacterianas interiorizan el tinte ratiométrico y muestran una señal fluorescente brillante en comparación con la matriz de biopelícula, pero también en comparación con las paredes celulares de hongos. Las paredes celulares fúngicas parecen algo más brillantes que la matriz de biopelícula, que a su vez muestra una fluorescencia más alta que el citoplasma fúngico. En las biopelículas que sólo consisten en células fúngicas, las imágenes se pueden adquirir con una alta potencia/ganancia láser, lo que resulta en suficiente contraste entre la matriz de biopelícula y el citoplasma fúngico(Figura S7B). Cuando las bacterias están presentes, la potencia/ganancia del láser debe reducirse para evitar la sobreexposición de las células bacterianas(Figura S7C). Por lo tanto, el contraste entre el citoplasma fúngico y las áreas extracelulares no es tan pronunciado, y la configuración de la imagen, como el tamaño del agujero, el tamaño de píxel y el tiempo de permanencia de píxeles, debe elegirse con mucho cuidado para el análisis ratiométrico.
En cuanto a todas las técnicas basadas en microscopía, la calidad de imagen y el tiempo de adquisición están correlacionados inversamente. En las presentes biopelículas entre reinos, era necesario un tiempo de imagen de 30 s, idealmente 1 min, para obtener una calidad adecuada para el posterior análisis de pH. En comparación, las biopelículas que sólo albergan bacterias se pueden crear imágenes con calidad suficiente en 10 s o menos29. Para los análisis de microscopía de crecimiento, estructura o composición de biopelículas, los tiempos de adquisición de 1 min no plantean un problema, y en muchos casos, esto también puede aplicarse a las grabaciones de pH. Sin embargo, los cambios extremos de pH, como la acidificación rápida observada inmediatamente después de la exposición a la glucosa (pH > 1 unidad/min), son difíciles de controlar en las biopelículas entre reinos.
El presente trabajo demuestra que las grabaciones de pH ratiométricas con C-SNARF-4 son factibles en biopelículas entre reinos compuestas por S. mutans y C. albicans. Estudios futuros pueden emplear el método para analizar los cambios de pH en las biopelículas entre reinos con mayor diversidad de especies, especialmente en biopelículas cultivadas in situ (es decir, en niños con caries en la primera infancia)30. En este estudio, el pH en las biopelículas fue monitoreado en condiciones estáticas y durante un tiempo de observación limitado de 15 min, justo después de un pulso de glucosa. Otros avances pueden incluir la aplicación de un flujo de fluido para imitar condiciones in situ más de cerca14,31,32. Además, la relación pH puede utilizarse para estudiar el impacto de diversas condiciones nutricionales en los cambios de pH a largo plazo en las biopelículas entre reinos y contribuir a dilucidar el efecto del pH de biopelícula en los tejidos huésped subyacentes. Una vez más, la desmineralización del esmalte dental en la caries de la primera infancia puede servir como un ejemplo prominente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Anette Aakjor Thomsen y Javier E. García son reconocidos por su excelente soporte técnico. Los autores agradecen a Rubens Spin-Neto sus fructíferas discusiones sobre el análisis de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
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