Summary
이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.
Abstract
곰팡이 와 세균성 세포로 구성된 크로스 킹덤 생물막은 엔도돈증 감염, 치주염, 점막 감염 및 특히 어린 시절 충치와 같은 다양한 구강 질환에 관여합니다. 이러한 모든 조건에서, 생물막 매트릭스내의 pH는 미생물-숙주 상호작용 및 따라서 질병 진행에 영향을 미친다. 본 프로토콜은 칸디다 알비칸스 및 연쇄상 구균 뮤탄을 포함하는 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 역학을 모니터링하는 공초점 현미경 기반 방법을 기술한다. pH 의존적 이중 방출 스펙트럼 및 비메트릭 프로브 C-SNARF-4의 염색 특성은 생물막의 세포외 영역에서 pH의 하락을 결정하기 위해 이용된다. 프로브와 pH 비율 측정을 사용하려면 이미징 매개 변수의 세심한 선택, 염료의 철저한 교정, 이미지 데이터의 신중한 임계값 기반 사후 처리가 필요합니다. 올바르게 사용될 때, 기술은 생물막의 다른 지역에 있는 세포외 pH의 급속한 평가를 허용하고 따라서 시간 지남에 따라 수평 및 수직 pH 구배 둘 다의 감시를 허용합니다. 공초점 현미경 검사법의 사용은 Z 프로파일링을 75 μm 이하의 얇은 바이오필름으로 제한하지만, pH 비율 측정법의 사용은 왕국 간 생물막에서 중요한 독성 계수의 비침습적 연구에 이상적입니다.
Introduction
곰팡이와 세균성 종을 모두 포함하는 크로스 킹덤 생물막은 구강내 여러 병리학 적 조건에 관여합니다. 칸디다 spp. 빈번 하 게 에서 분리 된 endodontic 감염1 그리고 치 주 변 병 변에서2,3. 점막 감염에서, 기염 단에서 연쇄상 구균 종은 시험관 내 및 murine 모형4,5,6,7둘 다에 있는 곰팡이 생물막 대형, 조직 침략 및 보급을 강화하기 위하여 보였습니다. 가장 흥미롭게도, 칸디다 종의 구강 마차는어린이8에서 우식증의 보급과 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 설치류 모델에서 도시된 바와 같이, 연쇄상 구균 뮤탄스와 칸디다스 알비칸스 사이의 공생 관계는 세포외 다당류의 생산을 증가시키고 더 두껍고 더 많은 카리오제닉 생물막의 형성을 이끈다,10.
위에서 언급한 모든 조건에서, 특히, 생물막 pH는 질병 진행에 매우 중요하며, 산성미세환경(11)의 개발을 위한 생물막 매트릭스의 탁월한 역할은 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 변화를 연구할 수 있는 방법론을 요구한다. 세균12 및 곰팡이13 생물막 내부의 pH를 모니터링하는 간단하고 정확한 공초점 현미경 기반 접근법이 개발되었습니다. 비측정 염료 C-SNARF-4 및 임계값 기반 이미지 후처리를 통해, 세포외 pH는생물막(14)의모든 3차원에서 실시간으로 결정될 수 있다. 생물막에서 현미경 기반 pH 모니터링을 위한 다른 공표된 기술에 비해, C-SNARF-4를 사용한 pH 비측정법은 기준염료(15) 또는 2광자인용(16)의사용을 포함하는 입자 또는 화합물의 합성을 필요로 하지 않기 때문에 간단하고 저렴하다. 단 하나의 염료를 사용하면 프로브 구획화, 형광 피,선택적 표백16,17,18의 문제를 방지하면서 세포 내 pH와 세포 외 pH 간의 신뢰할 수있는 분화를 허용합니다. 마지막으로, 염료를 가진 배양은 실험실과 그(것)들 성장한 생물막에서 둘 다 공부하는 것을 허용하는 생물막 성장 후에 행해줍니다.
본 연구의 목적은 pH 비측정법의 사용을 확장하고 왕국 간 생물막에서 pH 변화를 연구하는 방법을 제공하는 것이다. 개념의 증거로서, 이 방법은 포도당에 노출된 S. 뮤탄및 C. 알비칸스로 구성된 이중 종 생물막에서 pH를 모니터링하는 데 사용된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
타액 수집프로토콜은 오르후스 카운티 윤리위원회(M-20100032)에 의해 검토및 승인되었습니다.
1. 크로스 킹덤 바이오필름 재배
- S. 뮤탄스 DSM 20523 및 C. 알비칸스 NCPF 3179를 에어로빅 조건하에서 37°C에서 혈액 한천 플레이트에 성장시다.
- 각 유기체의 단일 식민지를 뇌 심장 주입 (BHI)의 5 mL로 채워진 시험관으로 옮니다. 37 °C에서 에어로빅 조건하에서 18 시간 동안 자랍니다.
- 1,200 x g에서 5 분 동안 하룻밤 배양. 상류를 버리고 생리식염수로 세포를 다시 중단하고 C. albicans (~ 107 세포 / mL) 및 S. 뮤탄 (~108 세포 / mL)에 대해 OD550 nm을 0.5로 조정하십시오. S. 뮤탄스 현탁액을 멸균 생리식염수(~10 7세포/mL)로 희석합니다.
- 피펫 50 μL의 멸균 침 액은, de Jong et al.19의방법에 따라 제조되어, 현미경 검사법용 광학 바닥 96-웰 플레이트의 우물내로. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 멸균 생리식염수 100 μL로 우물을 3배 씻으소서. 우물을 비웁습니다.
- 각 우물에 100 μL의 C. 알비칸스 서스펜션을 추가하십시오. 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
참고: 세척 중에 우물을 완전히 비우지 마십시오. 과도한 전단력을 피하기 위해 20 μL의 저장소를 둡니다. - 열불활성화된 태아 소 혈청 100 μL(56°C에서 30분 동안 불활성화)을 각 우물에 넣습니다. 37°C에서 2시간 동안 배양하여 멸균 생리식염수로 3x 세척합니다. 20 μL의 저수지를 떠나, 우물을 비웁니다.
- 100 μL의 S. 뮤탄스 서스펜션(1.3단계에서 제조)을 각 웰에 첨가합니다. 5% 자당을 함유한 BHI 150 μL을 첨가합니다. 37°C에서 24시간 이상 배양합니다. 오래된 생물막을 재배할 때, 매일 배지를 신선한 BHI로 바꾸라. 크로스 킹덤 생물막 성장 기의 끝에서 멸균 생리식염수로 5배를 씻으십시오.
2. 비율 메트릭 pH 이미징
참고: 비율 측정 pH 화상 진찰은 생물막 성장이 완료된 후에 즉시 수행될 필요가 있습니다.
- 비메트릭 pH 이미징의 경우 63x 오일 또는 수지 침지 렌즈, 543nm 레이저 라인 및 스펙트럼 이미징 시스템(즉, META 검출기)을 사용하여 겹치는 형광 신호의 이미징을 허용합니다. 인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 35°C로 데우다.
- 검출기를 설정하여 576-608 nm에서 녹색 형광을 검출하고 629-661 nm에서 적색 형광을 동시에 감지합니다. 적절한 레이저 파워를 선택하고 과다 노출과 노출을 피하기 위해 게인을 선택하십시오.
참고: 이미지 노출은 잘못된 색상이 있는 팔레트 이미지에서 가장 잘 볼 수 있습니다. - 핀홀 크기를 1 Airy Unit 또는 ~0.8 μm의 광학 슬라이스로 설정합니다. 이미지 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 2로 설정합니다. 평균 옵션을 사용하여 선 평균을 2로 선택합니다.
참고 : 일련의 실험의 시작 부분에서 선택한 현미경 설정이 박테리아 세포, 곰팡이 세포벽, 생물 막 매트릭스 및 곰팡이 세포질 사이의 명확한 대비를 제공하는지 확인하십시오. - pH 7에 적정된 포도당 0.4%(w/v)를 함유한 멸균 생리식염수 100 μL을 준비합니다. C-SNARF-4 (디메틸 설폭사이드의 1 mMM)의 재고 용액을 준비하십시오. 염료를 30 μM의 최종 농도에 첨가합니다.
주의: 비율측정 염료를 취급할 때 니트릴 장갑을 착용하십시오. - 20 μL의 저장소를 떠나, 크로스 킹덤 생물 막 우물 중 하나를 비우고, 포도당과 비측정 염료를 포함하는 멸균 식염수를 추가합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓고 생물막을 이미징시작하십시오.
- 생물막의 다른 위치에서 단일 이미지 또는 Z 스택을 획득합니다. 현미경 소프트웨어에서 X-Y 위치를 표시하여 시간이 지남에 따라 특정 시야에서 pH 변화를 따릅니다. 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 가져가 검출기 오프셋을 보정합니다.
- 다른 우물에서 자란 각 생물막의 분석을 위해 2.4-2.6 단계를 반복합니다.
3. 비율 측정 염료의 교정
참고: 염료의 교정 및 교정 곡선의 피팅은 비율메트릭 pH 이미징과는 다른 날에 수행될 수 있습니다.
- 35°C에서 0.2 pH 단위의 단계에서 pH 4.0-7.8로 적정된 50 mM 2-모르폴리노에탄설포닉산(MES) 완충제를 준비한다. 각 완충액의 피펫 150 μL을 현미경 검사법용 광학 바닥 96웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
- 96웰 플레이트의 완충충전 웰에 염료를 30 μM의 최종 농도에 첨가한다. 5 분 동안 균형을 보자.
- 현미경 단계를 35 °C로 데우다. 비율메트릭 pH 이미징과 동일한 현미경 설정을 선택합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓습니다. 우물의 바닥에 초점을 맞춥니다. 모든 버퍼 솔루션에 대해 두 개의 이미지(녹색 및 빨간색 채널)를 획득합니다(웰 하단 의 5 μm). 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 가져가 검출기 오프셋을 보정합니다.
- 교정 실험을 삼중으로 수행합니다.
- 모든 이미지를 TIF 파일로 내보냅니다. 전용 이미지 분석 소프트웨어(즉, ImageJ20)로가져옵니다. 프로세스를 클릭하여 버퍼 솔루션의 각 이미지에서 레이저로 촬영한 이미지를 뺍니다. 이미지 계산기 | )를 뺍니다.
참고: 필요한 경우 이미지를 사용하여 직사각형 선택을 수행하여 이미지 테두리에서 아티팩트를 제거하기 위해 이미지를 자르세요 | 자르기. - 빨간색 채널 이미지를 통해 녹색 채널 이미지를 분할하고 분석 |를 클릭하여 결과 이미지의 평균 형광 강도를 계산합니다. 히스토그램.
- 삼중항 실험에서 pH에 대한 평균 녹색/빨간색 비율을 플로팅합니다. 전용 소프트웨어를 사용하여 교정 데이터(예: MyCurveFit)에 함수를 맞춥니다.
4. 디지털 이미지 분석
참고: 디지털 이미지 분석은 염료 및 비메트릭 pH 이미징의 교정 후 언제든지 수행할 수 있습니다.
- 녹색 및 빨간색 채널 바이오필름 이미지를 별도의 폴더에 저장하고 순차적인 숫자(예: GREEN_0001)가 있는 두 파일 의 이름을 바꿉니다. 이미지를 전용 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)로 가져옵니다. 분석 | 클릭 히스토그램은 레이저를 끄고 촬영한 이미지의 평균 형광 강도를 확인하고 프로세스를 클릭하여 생물막 이미지에서 값을 뺍니다 | 수학 | 을 뺍니다.
- 2개의 이미지 계열을 전용 이미지 분석 소프트웨어(즉, 다이메21)로가져옵니다. 빨간색 채널 이미지의 임계값 기반 세분화 수행(세그먼트 | 자동 세분화 | 사용자 정의 임계값). 곰팡이 세포질의 형광 강도 와 곰팡이 세포벽 및 박테리아의 강도 이하의 '높은' 임계값을 '낮음' 임계값이상으로 설정합니다.
참고: 적절한 임계값을 선택한 경우 세포외 영역만 개체로 인식됩니다. - 분할된 이미지 계열의 오브젝트 레이어를 녹색 채널 이미지 계열로 전송합니다. 이렇게 하려면 세그먼트를 클릭합니다 | 개체 레이어를 전송합니다.
참고: 셀라탈 영역과 곰팡이 세포질 간의 대비가 개별 색상 채널에서 너무 약한 경우 편집을 클릭하여 세분화하기 전에 녹색 채널 이미지 시리즈를 빨간색 채널 계열에 추가 | 이미지 계산기 | 추가. 4.2 아래에 설명된 대로 세분화를 수행하고 세그먼트화된 이미지 계열의 오브젝트 레이어를 녹색 및 빨간색 채널 이미지 시리즈로 전송합니다. - 오브젝트 편집기를 사용하여 빨간색 및 녹색 채널 이미지시리즈(Visualizer | 개체 편집기 | 모든 이미지에서 | 개체가 아닌 픽셀을 삭제합니다). 이제 생물막 이미지는 세균세포와 곰팡이 세포 모두에서 지워집니다. 처리된 이미지 계열을 TIF 파일로 내보냅니다.
- 두 이미지 계열을 ImageJ로 가져옵니다. ImageJ는 오브젝트가 아닌 모든 픽셀에 0의 강도를 할당합니다. 빨간색 이미지 시리즈(R1)를 자체적으로 나누어 해당 픽셀을 제거합니다(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: R1; 작업: 분할; 이미지 2: R1)결과 이미지 시리즈(R2)에 원본 빨간색 이미지시리즈(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: R1; 작업: 곱하기; 이미지 2: R2). R1에서 강도가 0인 모든 픽셀에 NaN이 할당된다는 점을 제외하면 세 번째 이미지 계열(R3)이 R1과 동일하게 작성됩니다. 녹색 이미지 시리즈와 동일한 방식으로 진행합니다.
- '평균' 필터 사용(프로세스 | 필터 | 평균 | 반경 | 1 픽셀) 적색 및 녹색 채널 이미지 시리즈에서 감지기 노이즈를 보정합니다. 녹색 채널 이미지 시리즈를 빨간색 채널 이미지 시리즈로 나눕니다(프로세스 | 이미지 계산기 | 이미지 1: G3; 작업: 분할; 이미지 2: R3). 결과 이미지 계열(G3/R3)은 모든 오브젝트 픽셀에 대한 녹색/빨간색 비율을 표시합니다.
- 각 이미지의 평균 비율 계산(분석 | 히스토그램)을참조하십시오. 이미지의 비율의 더 나은 시각적 표현을 위해 거짓 색칠을 적용(이미지 | 조회 테이블). 녹색/빨간색 비율을 3.6 아래에 장착된 함수를 사용하여 pH 값으로 변환합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 시간 및 48 시간 후, 우물 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. C. albicans는 필라멘트 성장의 다양한 정도를 보여주었고, S. 뮤탄은 높이가 최대 35 μm의 조밀 한 클러스터를 형성했습니다. 단일 세포 및 S. 뮤탄의 사슬은 곰팡이 하이페 주위에 그룹화되고, 큰 세포 간 공간은 볼륨감 있는 매트릭스의 존재를 나타냈다(도S1).
비대칭 염료의 보정은 비대칭 시그모이드 곡선13,14를산출한다. 생물막에 있는 세포외 pH는 보기의 다른 현미경 필드에 있는 다른 비율로 포도당에 노출 후에 처음 5 분에서 빨리 떨어졌습니다. 그 후, 산성화는 둔화, 일반적으로 15 분 후 5.5-5.8의 값에 도달(그림 1). 복제 생물막은 평균 pH에서 약간의 변화만을 가진 유사한 거동을 나타내보였다(도2).
pH 계산의 정확도는 수집 하는 동안 이미지 설정을 신중 하 게 선택에 크게 의존 한다. 문제의 생물막의 경우, 0.8 μm의 광학 슬라이스는 세포외 영역과 곰팡이 세포질 사이의 최상의 대비를 얻는 데 이상적인 것으로 입증되었습니다(그림S3). 또한 픽셀 크기는 0.28 μm(그림S4),픽셀 거주 시간 102.4 μs(그림S5)및 선 평균 2(그림S6)는허용 가능한 이미지 수집 시간과 함께 ~1분의 허용 가능한 대비를 제공했습니다. 심상 후 처리 도중, 모든 세균및 곰팡이 세포는 심상에서 제거되고, 주변 세포외 지역의 대부분은 후속 pH 분석에 포함되었다. 이미지의 밝기에 따라 상한 및 하한 임계값을 선택해야했습니다(그림 2).
도 1 및 도 2에 도시된 pH 데이터는 생물막-지층 계면으로부터 5 μm를 기록하였다. 기판으로부터의 거리가 증가하고 생물막의 세포 밀도에 따라 형광 강도가 감소하여 세포와 매트릭스 사이의 대비가 낮아집니다. 그러나, 본 연구에서 성장한 얇은 바이오필름(~35 μm)에서, 생물막의 상단에 있는 대조는 신뢰할 수 있는 이미지 분석을허용했다(도 S7A).
그림 1: 포도당에 노출된 크로스 킹덤 생물막에서 pH 비측정기의 사용. (a)염색된 생물막의 시야를 공초점 현미경으로 이미지화하고 세균 및 곰팡이 세포로 덮인 부위를 비메트릭 분석 전에 제거하였다. (B)세포외 공간에서의 pH를 조회 테이블(16색)을 사용하여 계산하고 시각화하였다. 스케일 바 = 20 μm.(C)24시간 크로스 킹덤 바이오필름의 pH는 서로 다른 시야에서 약간 다른 속도로 포도당에 노출될 때 급격히 떨어졌다. 오류 막대 = 표준 편차(SD)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스테인드 생물막의 임계값 기반 이미지 세분화. 국소 pH 변화로 인해 생물막의 형광 강도는 시간이 지남에 따라 변합니다. (A)및(B)는각각 포도당에 노출된 1분 및 15분 후에 동일한 현미경 시야를 보여준다. 이미지 세분화 도중, 높고 낮은 임계값은 세균성 및 곰팡이 세포에 의해 엄호된 모든 지역을 제거하기 위하여 적당하게 선택될 필요가 있습니다. (c)청색 영역은 낮은 임계값(40),빨간색 영역이 높은 임계값(115)에 의해 제거되었다. (D)세포외 영역만 개체로 인식되었습니다(주황색 선으로 둘러싸여 있음). (e)미생물 세포에 의해 커버되는 영역의 제거 후, pH 계산은 생물막 매트릭스에서 수행될 수 있었다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S1: 비메트릭 염료로 염색된 전형적인 24시간 크로스 킹덤 바이오필름. 많은 C. albicans 세포는 필라멘트 성장을 표시, S. 뮤탄스 동안 (노란색) 세포는 조밀 한 클러스터를 형성하거나 단일 세포 또는 체인으로 곰팡이 hyphae 주위에 국한. 큰 세포 간 공간은 볼륨감 있는 생물막 매트릭스의 존재를 나타냈다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 S2: 포도당에 노출된 24시간 크로스 킹덤 바이오필름의 pH 개발. (A),(B),및(C)pH는 포도당에 노출된 후 15분 동안 3개의 복제 생물막에서 비측정적으로 결정하였다. 처음 5분 동안 급속한 pH 강하 후, 산성화가 느려지고, 15분 후에 5.5-5.8의 수준에 도달하였다. 비메트릭 프로브의 캘리브레이션은 단 한 번만 수행하였다. 오류 막대 = SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3: 광학 슬라이스 두께가 이미지 대비에 미치는 영향입니다. 스테인드 생물막의 이미지는(A)핀홀 크기 2 에어리 유닛 및 광학 슬라이스 두께 1.6 μm, 및(B)1 Airy Unit 및 0.8 μm의 광학 슬라이스로 획득하였다. 1 Airy Unit에서 이미지 수집을 위해 더 높은 레이저 파워/게인이 필요했지만 곰팡이 세포질과 세포외 영역 간의 대비가 향상되었습니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S4: 해상도가 이미지 대비에 미치는 영향입니다. 염색된 생물막의 이미지는(A)1.12 μm,(B)0.56 μm,(C)0.28 μm,(D)0.14 μm, 및(E)0.11μm 이하의 픽셀 크기의 감소로 획득하였고, 0.28 μm 이하의 픽셀 크기는 세포외 영역과 재미있는 실라의 대비를 개선하지 못했다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S5: 스캔 속도가 이미지 대비에 미치는 영향입니다. 염색된 생물막의 이미지는(A)12.8 μs,(B)25.6 μs,(C)51.2 μs,(D)102 μs 및(E)164 μs의 픽셀 거주 시간으로 획득하였으며, 102 μs를 초과하는 픽셀 거주 시간을 증가시키지 못하였고 세포내 영역과 세포내 영역 사이의 대비를 개선하지 못했다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S6: 이미지 대비에 대한 평균화의 영향입니다. 스테인드 생물막의 이미지는(A)1,(B)2 및(C)4의 라인 평균(평균)으로 획득하였다. 라인 평균이 2인 경우 대비와 수집 시간 간에 최상의 절충안을 제공했습니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S7: 순수곰팡이 생물막 및 크로스 킹덤 바이오필름의 이미지 대비. (a)염색된 크로스 킹덤 생물막의 상부는 계면에서 30 μm로 이미지화되었다. 세포외 영역과 세포내 영역 간의 대비는 생물막 염기보다 낮았지만 여전히 비측정 pH 분석을 위해 충분했습니다. (B) C. 알비칸스 단종 생물막은 pH 비측정을 위해 이미지화되었다. 레이저 전력/이득 곰 팡이 세포 벽과 세포 질 사이의 대비를 최적화 하기 위해 증가 될 수 있습니다. (C)크로스 킹덤 생물막에서, 밝은 형광 박테리아는 레이저 파워 / 이득의 추가 증가를 배제. 따라서 곰팡이 세포벽과 세포질 사이의 대비는 순전히 곰팡이 생물막보다 덜 두드러집니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. 알비칸스 및 연쇄상 구균 spp를 포함하는 크로스 킹클크로스 킹에 대한 상이한 프로토콜은 이전에9,22,23,24,25를기술되었다. 그러나, 현재설정은 단순 성장 조건, 정규 근무일과 호환되는 시간 일정, 균형 잡힌 종 조성 및 방대한 생물막 매트릭스 의 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 96웰 플레이트는 어느 정도 접착의 경구 조건을 모방하기 위해 타액용액으로 코팅되었다.
C-SNARF-4를 이용한 pH 비측정법의 사용은 바이오필름 pH의 신속한 측정을 위한 저렴한 방법이며, 그 중 장점과 단점은다른 곳에서 12,26에서상세히 논의되고 있다. 간단히 말해서, 이 기술은 생물막 내부의 상이한 위치에서 pH의 평가를 허용하고 따라서 시간이 지남에 따라 수평 pH 그라데이션 및 pH 개발의모니터링27. 수직 pH 프로파일도 기록할 수 있지만 공초점 현미경 검사법 사용으로 침투 깊이가 제한됩니다. 따라서, pH 비측정법은 pH 마이크로전극에 대한 더 빠르고, 더 다재다능하고, 덜 침습적인 대안을 나타내며, 이는 현재 두꺼운생물막(28)의Z 프로파일링을 위한 선택방법이다. 생물막에서 pH 기록을 위한 다른 현미경 계검사 방법에 비해, C-SNARF-4를 이용한 pH 비측정법은 하나의 얼룩만을 채용하는 장점이 있다. 따라서, 차등 형광 거동및 상이한 염료 들 간의 상호작용으로부터 발생할 수 있는 몇 가지 문제점은26을우회한다.
크로스 킹덤 생물막에서, 미생물 바이오매스와 세포 외 영역 사이의 임계값 기반 분화는 박테리아 또는 곰팡이 세포만을 포함하는 생물막과 비교할 때 몇 가지 문제를 제기합니다. 세균 세포는 비율 염료를 내면화하고 생물막 매트릭스에 비해 밝은 형광 신호를 표시하지만, 또한 곰팡이 세포벽에 비해. 곰팡이 세포벽은 생물막 매트릭스보다 다소 밝게 나타나며, 이는 곰팡이 세포질보다 더 높은 형광을 보여줍니다. 곰팡이 세포로만 구성된 생물막에서 이미지는 높은 레이저 파워/게인으로 획득할 수 있으며, 이로 인해 생물막 매트릭스와 곰팡이 세포질(그림S7B)의대비가 충분합니다. 박테리아가 존재할 때, 레이저 힘/이득은 세균성 세포의 과다 노출을 피하기 위하여 감소되어야 합니다(그림 S7C). 따라서 곰팡이 세포질과 세포외 영역 간의 대비는 뚜렷하지 않으며 핀홀 크기, 픽셀 크기 및 픽셀 거주 시간과 같은 이미지 설정을 비율 메트릭 분석에 세심한 주의를 기울여 선택해야 합니다.
모든 현미경 검사법 기반 기술에 관해서는, 이미지 품질 및 수집 시간은 반비례합니다. 본 크로스 킹덤 바이오필름에서, ~30s의 이미징 시간, 이상적으로 는 1 분, 후속 pH 분석을 위한 적절한 품질을 얻기 위해 필요하였다. 이에 비해, 항만박테리아만이 있는 생물막은 10초이하29에서충분한 품질로 영상을 촬영할 수 있다. 생물막 성장, 구조 또는 조성의 현미경 분석의 경우, 1분의 획득 시간은 문제를 제기하지 않으며, 많은 경우에, 이것은 또한 pH 기록에 적용될 수 있다. 그러나 포도당에 노출된 직후관찰되는 급속한 산성화(ΔpH > 1 단위/분)와 같은 극단적인 pH 변화는 왕국 간 생물막에서 모니터링하기 가 어렵습니다.
본 작품은 C-SNARF-4를 가진 비율 메트릭 pH 기록이 S. 뮤탄과 C. 알비칸스로구성된 크로스 킹덤 바이오필름에서 가능하다는 것을 보여준다. 향후 연구는 더 큰 종 다양성을 가진 크로스 킹덤 생물막의 pH 변화를 분석하는 방법을 채택할 수 있으며, 특히 소자(즉, 유아우식 우식을 가진 어린이)에서 자란 생물막에서30. 본 연구에서, 생물막내의 pH는 정적 조건 하에서 그리고 포도당 펄스 직후15분의 제한된 관찰 시간 동안 모니터링되었다. 추가의 발전은14,31,32보다밀접하게 상태 조건에서 모방하는 유체 흐름의 적용을 포함할 수 있다. 더욱이, pH 비측정은 크로스 킹덤 생물막의 장기 pH 변화에 대한 다양한 영양 조건의 영향을 연구하고 근본적인 숙주 조직에 대한 생물막 pH의 효과를 해명하는 데 기여할 수 있다. 다시 말하지만, 어린 시절 충치에서 치과 법랑질의 탈염은 눈에 띄는 예가 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
아네트 아크예르 톰슨과 하비에르 E. 가르시아는 뛰어난 기술 지원을 인정받고 있습니다. 저자는 이미지 분석에 대한 유익한 토론에 대한 루벤스 스핀 네토 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H.
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P.
