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Immunology and Infection

कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक्स्ट्रासेलुलर पीएच की निगरानी

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60270
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

Summary

प्रोटोकॉल कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती का वर्णन करता है और इन बायोफिल्म्स के अंदर एक्स्सेल्युलर पीएच की निगरानी के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

फंगल और बैक्टीरियल कोशिकाओं दोनों से मिलकर क्रॉस-किंगडम बायोफिल्मएं विभिन्न प्रकार की मौखिक बीमारियों में शामिल होती हैं, जैसे एंडोडोटिक संक्रमण, पीरियोडोंटाइटिस, म्यूकोसल संक्रमण और, सबसे विशेष रूप से, बचपन की मिर्च। इन सभी स्थितियों में, बायोफिल्म मैट्रिक्स में पीएच माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन को प्रभावित करता है और इस प्रकार रोग प्रगति करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में कैंडिडा एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि का वर्णन किया गया है। पीएच-निर्भर दोहरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और रेशियोमेट्रिक जांच सी-SNARF-4 के धुंधला गुणों का शोषण बायोफिल्मों के बाह्य क्षेत्रों में पीएच में बूंदों का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। जांच के साथ पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग के लिए इमेजिंग पैरामीटर, रंग का पूरी तरह से अंशांकन, और छवि डेटा के सावधानीपूर्वक, सीमा आधारित पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता होती है। जब सही ढंग से उपयोग किया जाता है, तो तकनीक बायोफिल्म के विभिन्न क्षेत्रों में बाह्य पीएच के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार समय के साथ क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ग्रेडिएंट दोनों की निगरानी करती है। जबकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग जेड-प्रोफाइलिंग को 75 माइक्रोन या उससे कम की पतली बायोफिल्मों तक सीमित करता है, पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग आदर्श रूप से क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक महत्वपूर्ण उग्रता कारक के नॉनइनवेसिव अध्ययन के लिए अनुकूल है।

Introduction

फंगल और बैक्टीरियल दोनों प्रजातियों को शामिल क्रॉस-किंगडम बायोफिल्ममौखिक गुहा में कई पैथिक स्थितियों में शामिल हैं। कैंडिडा spp. अक्सर एंडोडोन्टिक संक्रमण1 से अलग किया गया है और पीरियोडोन्टल घावों2,3से । म्यूकोसल संक्रमणों में, मिटिस समूह से स्ट्रेप्टोकोकल प्रजातियों को इन विट्रो और म्यूरन मॉडल4,5,6,7दोनों में फंगल बायोफिल्म गठन, ऊतक आक्रमण और प्रसार को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। सबसे दिलचस्प बात यह है कि कैंडिडा पीपी की मौखिक गाड़ी8बच्चों में क्षरण की व्यापकता से जुड़ी हुई साबित हुई है । जैसा कि कृंतक मॉडलों में दिखाया गया है, स्ट्रेप्टोकोकस म्यूटन और कैंडिडास एल्बिकान के बीच एक सहजीवी संबंध एक्स्ट्रासेलुलर पॉलीसैकराइड्स के उत्पादन को बढ़ाता है और मोटा और अधिक कैरिओजेनिक बायोफिल्म्स9,10के गठन की ओर जाता है।

उपर्युक्त सभी स्थितियों में, विशेष रूप से प्रारंभिक बाल्यावस्था क्षरण, रोग प्रगति के लिए बायोफिल्म पीएच का महत्व है, और एसिडोजेनिक माइक्रोवातावरण के विकास के लिए बायोफिल्म मैट्रिक्स की प्रख्यात भूमिका11 उन पद्धतियों के लिए कॉल करती है जो क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स के अंदर पीएच परिवर्तन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। बैक्टीरियल12 और फंगल13 बायोफिल्म्स के अंदर पीएच की निगरानी के लिए सरल और सटीक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। रेशियोमेट्रिक डाइ सी-SNARF-4 और दहलीज आधारित छवि पोस्ट प्रसंस्करण के साथ, एक्स्ट्रासेलुलर पीएच एक बायोफिल्म14के सभी तीन आयामों में वास्तविक समय में निर्धारित किया जा सकता है । बायोफिल्म्स में माइक्रोस्कोपी आधारित पीएच-मॉनिटरिंग के लिए अन्य प्रकाशित तकनीकों की तुलना में, सी-SNARF-4 के साथ पीएच रेशियोमेट्री सरल और सस्ता है, क्योंकि इसमें कणों या यौगिकों के संश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है जिसमें संदर्भडाइ15 या दो-फोटॉन उत्तेजना16का उपयोग शामिल है। सिर्फ एक रंग का उपयोग जांच के साथ समस्याओं को रोकता है, फ्लोरोसेंट खून के माध्यम से, और चयनात्मक ब्लीचिंग16,17,18 जबकि अभी भी अंतर और बाह्य शिक्की पीएच के बीच एक विश्वसनीय भेदभाव के लिए अनुमति देता है । अंत में, बायोफिल्म विकास के बाद डाइ के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जो प्रयोगशाला और सीटू-ग्रोन बायोफिल्म्स दोनों का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

वर्तमान कार्य का उद्देश्य पीएच रेशियोमेट्री के उपयोग का विस्तार करना और क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। अवधारणा के सबूत के रूप में, विधि का उपयोग दोहरी प्रजातियों की जैव फिल्मों में पीएच की निगरानी के लिए किया जाता है जिसमें एस म्यूटन और सी एल्बिकान होते हैं जो ग्लूकोज के संपर्क में होते हैं।

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Protocol

लार संग्रह के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की और Aarhus काउंटी (एम-२०१०००३२) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती

  1. एरोबिक परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर ब्लड एगर प्लेटों पर एस म्यूटियंस डीएसएम 20523 और सी एल्बिकान एनसीपीएफ 3179 उगाएं।
  2. मस्तिष्क हृदय जलसेक (बीएचआई) के 5 mL से भरी ट्यूबों का परीक्षण करने के लिए प्रत्येक जीव की एकल कालोनियों को स्थानांतरित करें। एरोबिक स्थितियों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए बढ़ें।
  3. 5 मिन के लिए १,२०० x ग्राम पर रातोंरात संस्कृतियों को अपकेंद्रित ्रित करें । अतिशयोक्ति को त्यागें, शारीरिक खारा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सी एल्बिकान (~ 107 कोशिकाओं/mL) और एस म्यूटन (~ 108 कोशिकाओं/mL) के लिए 0.5 के लिए ओडी550 एनएम समायोजित करें। एस म्यूटन निलंबन 1:10 बाँझ शारीरिक खारा (~ 107 कोशिकाओं/mL) के साथ पतला ।
  4. बाँझ लार समाधान के पिपेट 50 μL, डी जोंग एट अल19की विधि के अनुसार तैयार, माइक्रोस्कोपी के लिए एक ऑप्टिकल नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में। 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। बाँझ शारीरिक खारा के 100 μL के साथ कुओं 3x धोलें। कुएं खाली कर दें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से सी एल्बिकान निलंबन के 100 μL जोड़ें। 90 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें बाँझ शारीरिक नमकीन से 3x धोएं।
    नोट- धुलाई के दौरान कुओं को पूरी तरह खाली न करें। अत्यधिक कतरनी ताकतों से बचने के लिए 20 माइक्रोन का जलाशय छोड़ दें।
  6. प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन ऑफ हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम (30 मिन के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय) जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट बाँझ शारीरिक खारा के साथ 3x धोएं। कुओं को खाली कर दें, जिससे 20 माइक्रोन का जलाशय जा रहा है।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से एस म्यूटंस निलंबन (चरण 1.3 में तैयार) के 100 माइक्रोन जोड़ें। 5% सुक्रोज युक्त भि के 150 माइक्रोन जोड़ें। 24 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पुरानी बायोफिल्म्स की खेती करते समय, मीडियम को रोजाना फ्रेश बीआई में बदल ें । क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म ग्रोथ फेज के अंत में, बाँझ शारीरिक नमकीन के साथ 5x धोएं।

2. रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग

नोट: बायोफिल्म विकास पूरा होने के तुरंत बाद रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग को करने की आवश्यकता है।

  1. रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग के लिए, 63x तेल या पानी विसर्जन लेंस, 543 एनएम लेजर लाइन, और एक स्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम (यानी, मेटा डिटेक्टर) के साथ एक उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ताकि अतिव्यापी फ्लोरोसेंट संकेतों की इमेजिंग के लिए अनुमति दी जा सके। माइक्रोस्कोप चरण को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए इनक्यूबेटर का उपयोग करें।
  2. 576−608 एनएम से हरी फ्लोरेसेंस का पता लगाने और 629−661 एनएम से लाल फ्लोरेसेंस का एक साथ पता लगाने के लिए डिटेक्टर सेट करें। अधिक और अंडरएक्सपोजर से बचने के लिए एक उपयुक्त लेजर शक्ति चुनें और लाभ।
    नोट: छवियों का एक्सपोजर झूठे रंग के साथ पैलेट छवियों में सबसे अच्छा देखा जाता है।
  3. पिनहोल का आकार 1 हवादार यूनिट या ~0.8 माइक्रोन का ऑप्टिकल स्लाइस सेट करें। इमेज साइज को 512 x 512 पिक्सल और स्कैन स्पीड को 2 पर सेट करें। मतलब विकल्प का उपयोग करके, 2 की एक लाइन औसत चुनें।
    नोट: प्रयोगों की एक श्रृंखला की शुरुआत में, जांच करें कि चुने हुए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स बैक्टीरियल कोशिकाओं, फंगल सेल दीवारों, बायोफिल्म मैट्रिक्स और फंगल साइटोप्लाज्म के बीच एक स्पष्ट विपरीत प्रदान करता है।
  4. ग्लूकोज के 0.4% (w/v) युक्त बाँझ शारीरिक नमकीन के 100 μL तैयार करें, पीएच 7 को titrated। सी-SNARF-4 (डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड में 1 mM) का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। 30 μM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए रंगे जोड़ें।
    सावधानी: रेशियोमेट्रिक डाये को संभालते समय निट्रिल दस्ताने पहनें।
  5. क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म वाले कुओं में से एक को खाली करें, जिससे 20 माइक्रोन का जलाशय छोड़ दिया जा सके। ग्लूकोज और रेशियोमेट्रिक डाइज युक्त बाँझ खारा जोड़ें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर 96-वेल प्लेट रखें और बायोफिल्म इमेजिंग शुरू करें।
  6. बायोफिल्म के विभिन्न स्थानों में एकल छवियों या जेड-स्टैक प्राप्त करें। समय के साथ देखने के विशेष क्षेत्रों में पीएच परिवर्तन का पालन करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में एक्स-वाई स्थिति को चिह्नित करें। नियमित अंतराल पर, लेजर के साथ छवियों को ले डिटेक्टर ऑफसेट के लिए सही करने के लिए बंद कर दिया ।
  7. एक अलग अच्छी तरह से उगाई गई प्रत्येक बायोफिल्म के विश्लेषण के लिए चरण 2.4-2.6 दोहराएं।

3. रेशियोमेट्रिक डाये का अंशांकन

नोट: रंग का अंशांकन और एक अंशांकन वक्र की फिटिंग रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग की तुलना में एक अलग दिन पर किया जा सकता है।

  1. 0.2 पीएच इकाइयों के चरणों में पीएच 4.0−7.8 को 35 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएम 2-मॉर्फोलिनेथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस) बफर टिटेड की एक श्रृंखला तैयार करें। माइक्रोस्कोपी के लिए ऑप्टिकल-बॉटम 96-वेल प्लेट के कुओं में प्रत्येक बफर समाधान का पिपेट 150 माइक्रोन।
  2. 30 μM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली के बफर से भरे कुओं में रंगे जोड़ें । 5 मिन के लिए समतुल्य चलो।
  3. माइक्रोस्कोप स्टेज को 35 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग के लिए समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स चुनें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर 96-वेल प्लेट रखें। कुओं के नीचे पर ध्यान दें। सभी बफर समाधानों के लिए दो छवियों (हरे और लाल चैनल) प्राप्त करें, जो कुएं के नीचे 5 माइक्रोन है। नियमित अंतराल पर, लेजर के साथ छवियों को ले डिटेक्टर ऑफसेट के लिए सही करने के लिए बंद कर दिया ।
  4. ट्रिपलिकेट में अंशांकन प्रयोग करें।
  5. सभी छवियों को टीएफ फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें। उन्हें समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, इमेजजे20)में आयात करें। लेजर के साथ ली गई छवियों को घटाएं प्रक्रिया पर क्लिक करके बफर समाधान की संबंधित छवियों से बंद कर दिया । इमेज कैलकुलेटर । घटाना)।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो छवि का उपयोग करआयताकार चयन करके छवि सीमाओं पर कलाकृतियों को खत्म करने के लिए छवियों को फसल । फसल।
  6. लाल चैनल छवियों के माध्यम से हरे चैनल छवियों को विभाजित करें और विश्लेषण पर क्लिक करके परिणामस्वरूप छवियों में औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करें। हिस्टोग्राम।
  7. त्रिपाणि प्रयोगों से पीएच के विरुद्ध औसत हरे/लाल अनुपात की साजिश करें । अंशांकन डेटा (यानी, MyCurveFit) के लिए एक समारोह फिट करने के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

4. डिजिटल छवि विश्लेषण

नोट: डिजिटल छवि विश्लेषण रंग और रेशियोमेट्रिक पीएच इमेजिंग के अंशांकन के बाद किसी भी समय बिंदु पर किया जा सकता है।

  1. हरे और लाल चैनल बायोफिल्म छवियों को अलग फ़ोल्डर्स में स्टोर करें और अनुक्रमिक संख्या (जैसे, GREEN_0001) के साथ फ़ाइलों की दोनों श्रृंखला का नाम बदलें। छवियों को समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, इमेजजे) में आयात करें। क्लिक करें विश्लेषण करें । हिस्टोग्राम लेजर ऑफ के साथ ली गई छवियों में औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता निर्धारित करने और प्रक्रिया पर क्लिक करके बायोफिल्म छवियों से मूल्य घटाना । गणित । घटाना।
  2. समर्पित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (यानी, daime21)में 2 छवि श्रृंखला आयात करें । लाल चैनल छवियों का एक सीमा आधारित विभाजन करें(सेगमेंट। स्वचालित विभाजन । कस्टम दहलीज)। कवक साइटोप्लाज्म की फ्लोरेसेंस तीव्रता और फंगल सेल दीवारों और बैक्टीरिया की तीव्रता से नीचे 'उच्च' सीमा के ऊपर 'कम' सीमा सेट करें।
    नोट: जब उचित थ्रेसहोल्ड चुने गए हैं, तो केवल बाह्युशिकी क्षेत्रों को वस्तुओं के रूप में पहचाना जाता है।
  3. खंडित छवि श्रृंखला की ऑब्जेक्ट लेयर को ग्रीन चैनल इमेज श्रृंखला में स्थानांतरित करें। ऐसा करने के लिए, सेगमेंट पर क्लिक करें । ऑब्जेक्ट लेयर ट्रांसफरकरें ।
    नोट: यदि अलग-अलग रंग चैनलों में बाह्युशिकी क्षेत्रों और फंगल साइटोप्लाज्म के बीच विपरीत बहुत कमजोर है, तो एडिट पर क्लिक करके विभाजन से पहले लाल चैनल श्रृंखला में ग्रीन चैनल छवि श्रृंखला जोड़ें। इमेज कैलकुलेटर । इसके अलावा। विभाजन को 4.2 के तहत वर्णित करें और खंडित छवि श्रृंखला की ऑब्जेक्ट लेयर को हरे और लाल चैनल छवि श्रृंखला दोनों में स्थानांतरित करें।
  4. लाल और हरे चैनल छवि श्रृंखला(विजुअलाइजर) में गैर वस्तु पिक्सेल को हटाने के लिए ऑब्जेक्ट संपादक को नियोजित करें। ऑब्जेक्ट एडिटर । सभी छवियों में । नॉन-ऑब्जेक्ट पिक्सल हटाएं)। अब बायोफिल्म छवियों को बैक्टीरियल और फंगल दोनों कोशिकाओं से साफ कर दिया जाता है। प्रोसेस्ड इमेज सीरीज को टीआईएफ फाइल्स के रूप में एक्सपोर्ट करें।
  5. इमेजजे में दोनों इमेज सीरीज आयात करें। इमेजजे सभी गैर-ऑब्जेक्ट पिक्सेल को 0 की तीव्रता प्रदान करता है। लाल छवि श्रृंखला (R1) को स्वयं विभाजित करके उन पिक्सेल को हटा दें(प्रक्रिया। इमेज कैलकुलेटर । छवि 1: R1; ऑपरेशन: विभाजन; छवि 2: R1)और मूल लाल छवि श्रृंखला(प्रक्रिया) के साथ परिणामस्वरूप छवि श्रृंखला (R2) गुणा । इमेज कैलकुलेटर । छवि 1: R1; ऑपरेशन: गुणा; छवि 2: R2)। एक तीसरी छवि श्रृंखला (R3) बनाया गया है, R1 के समान, इस तथ्य को छोड़कर कि NaN R1 में 0 की तीव्रता के साथ सभी पिक्सल को सौंपा गया है । हरे रंग की छवि श्रृंखला के साथ उसी तरह आगे बढ़ें।
  6. 'मतलब' फिल्टर का उपयोग करें (प्रक्रिया। फिल्टर्स । मतलब है । त्रिज्या । 1 पिक्सेल) डिटेक्टर शोर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए लाल और हरे चैनल छवि श्रृंखला पर। लाल चैनल छवि श्रृंखला द्वारा ग्रीन चैनल छवि श्रृंखला विभाजित(प्रक्रिया । इमेज कैलकुलेटर । छवि 1: G3; ऑपरेशन: विभाजन; छवि 2: R3)। परिणामस्वरूप छवि श्रृंखला (G3/R3) सभी वस्तु पिक्सल के लिए हरे/लाल अनुपात से पता चलता है ।
  7. प्रत्येक छवि के लिए औसत अनुपात की गणना करें (विश्लेषण करें । हिस्टोग्राम)। छवियों में अनुपात के बेहतर दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए झूठी रंग लागू करें(छवि । लुकअप टेबल्स)। हरे/लाल अनुपात को पीएच मूल्यों में परिवर्तित करें जो 36 के अंतर्गत लगे कार्य को नियोजित करते हैं।

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Representative Results

24 एच और 48 घंटे के बाद, अच्छी प्लेटों में मजबूत क्रॉस-किंगडम बायोफिल्मविकसित हुई। सी एल्बिकान ने तंतुओं के विकास की अलग-अलग डिग्री दिखाई, और एस म्यूटन ने ऊंचाई में 35 माइक्रोन तक के घने समूहों का गठन किया। एस म्यूटन की एकल कोशिकाओं और श्रृंखलाओं को फंगल हाइफे के चारों ओर समूहीकृत किया गया, और बड़े अंतरकोशिकीय स्थानों ने भारी-भरकम मैट्रिक्स(चित्रा S1)की उपस्थिति का संकेत दिया।

रेशियोमेट्रिक डाये के अंशांकन से विषम सिग्मोइडल वक्र13,14होता है . बायोफिल्म्स में एक्सट्रासेलुलर पीएच देखने के विभिन्न सूक्ष्म क्षेत्रों में विभिन्न दरों पर ग्लूकोज के संपर्क के बाद पहले 5 मिन में जल्दी से गिरा दिया । इसके बाद, एसिडिफिकेशन धीमा हो गया, आमतौर पर 15 मिन(चित्रा 1)के बाद 5.5-5.8 के मूल्यों तक पहुंच गया। बायोफिल्म्स को दोहराने से एक समान व्यवहार दिखाया गया, जिसमें औसत पीएच(चित्रा S2)में केवल मामूली भिन्नताएं थीं।

पीएच गणना की सटीकता दृढ़ता से अधिग्रहण के दौरान छवि सेटिंग्स के एक सावधान विकल्प पर निर्भर है। प्रश्न में बायोफिल्म्स के लिए, 0.8 माइक्रोन का एक ऑप्टिकल टुकड़ा एक्स्ट्रासेलुलर क्षेत्रों और फंगल साइटोप्लाज्म(चित्रा S3)के बीच सर्वोत्तम संभव विपरीत प्राप्त करने के लिए आदर्श साबित हुआ। इसके अलावा, 0.28 माइक्रोन(चित्रा S4),एक पिक्सेल का एक पिक्सेल आकार 102.4 μs(चित्रा S5)का समय है, और 2(चित्रा S6)की एक लाइन औसत ~ 1 मिन के एक स्वीकार्य छवि अधिग्रहण समय के साथ एक अच्छा विपरीत प्रदान की है। इमेज पोस्ट-प्रोसेसिंग के दौरान, सभी बैक्टीरियल और फंगल कोशिकाओं को छवियों से हटा दिया गया था, जबकि आसपास के अधिकांश बाह्य क्षेत्रों को बाद के पीएच विश्लेषण में शामिल किया गया था। छवियों की चमक के आधार पर, विभिन्न ऊपरी और निचले थ्रेसहोल्ड को चुना जाना था(चित्रा 2)।

फिगर 1 और फिगर एस2 में दिखाए गए पीएच डेटा को बायोफिल्म-सबस्ट्रेटम इंटरफेस से 5 माइक्रोन दर्ज किया गया था । सब्सट्रेट से बढ़ती दूरी के साथ, और बायोफिल्म्स में सेल घनत्व के आधार पर, फ्लोरेसेंस तीव्रता कम हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं और मैट्रिक्स के बीच कम विपरीत होता है। हालांकि, वर्तमान अध्ययन में उगाई गई पतली बायोफिल्म (~ 35 माइक्रोन) में, बायोफिल्म के शीर्ष पर इसके विपरीत विश्वसनीय छवि विश्लेषण(चित्रा S7A)की अनुमति दी गई।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लूकोज के संपर्क में आने वाली क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग। (क)एक दाग बायोफिल्म में देखने के एक क्षेत्र को फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया गया था और जीवाणु और फंगल कोशिकाओं द्वारा कवर क्षेत्र को रेशियोमेट्रिक विश्लेषण से पहले हटा दिया गया था । (ख)एक्सट्रासेलुलर स्पेस में पीएच की गणना और एक लुकअप टेबल (16 रंग) का उपयोग करके कल्पना की गई थी। स्केल बार = 20 माइक्रोन (सी)24 एच क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच देखने के विभिन्न क्षेत्रों में थोड़ा अलग दरों पर ग्लूकोज के संपर्क में तेजी से गिरा। त्रुटि सलाखों = मानक विचलन (एसडी) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दाग बायोफिल्म्स की दहलीज आधारित छवि विभाजन। स्थानीय पीएच परिवर्तन के कारण, बायोफिल्मों में फ्लोरेसेंस तीव्रता समय के साथ बदलती है। (ए)और(बी)क्रमशः 1 मिन और ग्लूकोज के संपर्क में 15 मिन के बाद देखने का एक ही सूक्ष्म क्षेत्र दिखाते हैं । छवि विभाजन के दौरान, बैक्टीरियल और फंगल कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए सभी क्षेत्रों को खत्म करने के लिए उच्च और निम्न थ्रेसहोल्ड को पर्याप्त रूप से चुनने की आवश्यकता होती है। (ग)नीले क्षेत्रों को कम दहलीज (४०), उच्च दहलीज (११५) द्वारा लाल क्षेत्रों द्वारा समाप्त कर दिया गया था । (D)केवल बाह्युशिकीक्षेत्रों को वस्तुओं (नारंगी रेखाओं से घिरा हुआ) के रूप में पहचाना जाता था। (ई)माइक्रोबियल कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए क्षेत्र को समाप्त करने के बाद, पीएच गणना बायोफिल्म मैट्रिक्स में किया जा सकता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 1
चित्रा S1: ठेठ 24 घंटे पार किंगडम बायोफिल्म ratiometric डाइई के साथ दाग । कई सी एल्बिकान कोशिकाओं ने तंतुओं में वृद्धि प्रदर्शित की, जबकि एस म्यूटान (पीली) कोशिकाओं ने घने समूहों का गठन किया या एक कोशिकाओं या श्रृंखलाओं के रूप में फंगल हाइफे के आसपास स्थानीयकृत किया। बड़े इंटरसेलुलर रिक्त स्थान एक मोटा बायोफिल्म मैट्रिक्स की उपस्थिति का संकेत दिया। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 2
चित्रा S2: ग्लूकोज के संपर्क में 24 घंटे पार किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच विकास । (ए),(बी),और(सी)पीएच ग्लूकोज के संपर्क में आने के बाद 15 मिन के लिए तीन दोहराने वाली बायोफिल्म्स में अनुपात निर्धारित किया गया था । पहले 5 मिन में तेजी से पीएच ड्रॉप के बाद, एसिडिफिकेशन धीमा हो गया, और 15 मिन के बाद 5.5−5.8 का स्तर पहुंच गया। विभिन्न सूक्ष्म क्षेत्रों (प्रत्येक में एक लाइन द्वारा प्रतिनिधित्व) में थोड़ी अलग-अलग दरें देखी गईं। रेशियोमेट्रिक जांच का अंशांकन केवल एक बार किया गया था । त्रुटि सलाखों = एसडी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 3
चित्रा S3: छवि विपरीत पर ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई का प्रभाव । दाग बायोफिल्मों की छवियां(ए)2 हवादार इकाइयों के एक पिनहोल आकार और 1.6 माइक्रोन की ऑप्टिकल स्लाइस मोटाई, और(बी)1 हवादार इकाई और 0.8 माइक्रोन का एक ऑप्टिकल टुकड़ा के साथ अधिग्रहीत की गई थीं। 1 हवादार इकाई में, छवि अधिग्रहण के लिए एक उच्च लेजर शक्ति/लाभ की आवश्यकता थी, लेकिन कवक साइटोप्लाज्म और बाह्य क्षेत्रों के बीच इसके विपरीत में सुधार हुआ । स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 4
चित्रा S4: छवि विपरीत पर संकल्प का प्रभाव । दाग ित बायोफिल्मों की छवियां पिक्सेल आकारों(ए)1.12 माइक्रोन,(बी)0.56 माइक्रोन,(सी)0.28 माइक्रोन,(डी)0.14 माइक्रोन, और(ई)0.11 माइक्रोन के साथ अधिग्रहीत की गई थीं। 0.28 माइक्रोन से नीचे के पिक्सेल आकार में कमी से एक्स्सेलुलर क्षेत्रों और फंगल साइटोप्लाज्म के बीच विपरीत में सुधार नहीं हुआ। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 5
चित्रा S5: छवि विपरीत पर स्कैन गति का प्रभाव । दाग ित बायोफिल्मों की छवियां पिक्सेल निवास समय(ए)12.8 माइक्रोन,(बी)25.6 μs,(C)51.2 μs,(D)102 μs, और(ई)164 μs के साथ अधिग्रहीत की गई थी। 102 माइक्रोन से परे पिक्सेल निवास समय बढ़ाने से अतिरिक्त कोशिकीय और इंट्रासेलर क्षेत्रों के बीच इसके विपरीत में सुधार नहीं हुआ। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 6
चित्रा S6: छवि विपरीत पर औसत का प्रभाव । दाग बायोफिल्मों की छवियां लाइन औसत (मतलब)(ए)1,(बी)2, और(C)4 के साथ अधिग्रहीत की गई थीं । 2 की एक लाइन औसत इसके विपरीत और अधिग्रहण समय के बीच सबसे अच्छा समझौता प्रदान की है । स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Supplemental Figure 7
चित्रा S7: विशुद्ध रूप से कवक बायोफिल्म्स और क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में छवि विपरीत। (क)एक दाग पार किंगडम बायोफिल्म के शीर्ष इंटरफेस से 30 μm छवि था । एक्स्ट्रासेलुलर और इंट्रासेल्युलर क्षेत्रों के बीच विपरीत बायोफिल्म आधार की तुलना में कम था लेकिन अभी भी रेशियोमेट्रिक पीएच विश्लेषण के लिए पर्याप्त था। (ख)पीएच रेशियोमेट्री के लिए ए सी एल्बिकान मोनोस्पीस बायोफिल्म की इमेजिंग की गई थी । कवक कोशिका दीवारों और साइटोप्लाज्म के बीच इसके विपरीत को अनुकूलित करने के लिए लेजर पावर/गेन बढ़ाया जा सकता है । (ग)क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में चमकीले फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया ने लेजर पावर/गेन को और बढ़ा दिया । इसलिए, कवक सेल दीवारों और साइटोप्लाज्म के बीच विपरीत विशुद्ध रूप से फंगल बायोफिल्म्स की तुलना में कम स्पष्ट है। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सी एल्बिकान और स्ट्रेप्टोकोकस एसपीपी से जुड़ी क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स की खेती के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल पहले9,22,23,24,25वर्णित किए गए हैं । हालांकि, वर्तमान सेटअप सरल विकास की स्थिति, नियमित कार्य दिवसों, एक संतुलित प्रजातियों की संरचना, और एक भारी जैव फिल्म मैट्रिक्स के विकास के साथ संगत एक समय अनुसूची पर केंद्रित है। इसके अलावा, 96-अच्छी प्लेटों को कुछ हद तक आसंजन की मौखिक स्थितियों की नकल करने के लिए लार समाधान के साथ लेपित किया गया था।

सी-SNARF-4 के साथ पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग बायोफिल्म पीएच के तेजी से माप के लिए एक सस्ती विधि है, जिसके फायदे और नुकसान पर विस्तार से चर्चा की गई है12,26। संक्षेप में, तकनीक बायोफिल्म्स के अंदर विभिन्न स्थानों में पीएच के मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार27समय के साथ क्षैतिज पीएच ग्रेडिएंट और पीएच विकास की निगरानी करती है। ऊर्ध्वाधर पीएच प्रोफाइल भी दर्ज किया जा सकता है, लेकिन प्रवेश गहराई कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग से सीमित है। इसलिए, पीएच रेशियोमेट्री पीएच माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए एक तेज, अधिक बहुमुखी और कम आक्रामक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, जो वर्तमान में मोटीबायोफिल्म्स 28की जेड-प्रोफाइलिंग के लिए पसंद की विधि है। बायोफिल्म्स में पीएच रिकॉर्डिंग के लिए अन्य माइक्रोस्कोपी आधारित तरीकों की तुलना में, सी-SNARF-4 के साथ पीएच रेशियोमेट्री को केवल एक दाग को नियोजित करने का लाभ है। इसलिए, अंतर फ्लोरोसेंट व्यवहार और विभिन्न रंगों के बीच बातचीत से उत्पन्न होने वाली कई समस्याएं26को दरकिनार कर दी जाती हैं।

क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में, माइक्रोबियल बायोमास और एक्स्ट्रासेलुलर क्षेत्रों के बीच सीमा आधारित भेदभाव बायोफिल्म्स की तुलना में कुछ समस्याएं बन गई हैं जिनमें केवल बैक्टीरियल या फंगल कोशिकाएं शामिल हैं। बैक्टीरियल कोशिकाएं रेशियोमेट्रिक डाइको इंटरलाइज करती हैं और बायोफिल्म मैट्रिक्स की तुलना में एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रदर्शित करती हैं, लेकिन फंगल सेल दीवारों की तुलना में भी। कवक सेल दीवारें बायोफिल्म मैट्रिक्स की तुलना में कुछ उज्जवल दिखाई देती हैं, जो बदले में फंगल साइटोप्लाज्म की तुलना में अधिक फ्लोरेसेंस दिखाती है। बायोफिल्मों में, जिसमें केवल फंगल कोशिकाएं शामिल हैं, छवियों को उच्च लेजर पावर/लाभ के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बायोफिल्म मैट्रिक्स और फंगल साइटोप्लाज्म(चित्रा S7B)के बीच पर्याप्त विपरीत होता है। जब बैक्टीरिया मौजूद होते हैं, तो बैक्टीरियल कोशिकाओं(चित्रा S7C)के ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए लेजर पावर/गेन को कम किया जाना चाहिए । इसलिए, फंगल साइटोप्लाज्म और एक्सट्रासेलुलर क्षेत्रों के बीच विपरीत उतना स्पष्ट नहीं है, और पिनहोल आकार, पिक्सेल आकार और पिक्सेल-निवास समय जैसी छवि सेटिंग्स को रेशियोमेट्रिक विश्लेषण के लिए बड़ी सावधानी से चुना जाना चाहिए।

सभी माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीकों के लिए, छवि की गुणवत्ता और अधिग्रहण का समय उलटा सहसंबद्ध है। वर्तमान क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में, बाद के पीएच विश्लेषण के लिए उचित गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए ~ 30 एस, आदर्श रूप से 1 मिन का इमेजिंग समय आवश्यक था। इसकी तुलना में, बायोफिल्म्स जो केवल बैक्टीरिया को आश्रय देते हैं, उन्हें 10 एस या उससे कम29में पर्याप्त गुणवत्ता के साथ चित्रित किया जा सकता है। बायोफिल्म विकास, संरचना या संरचना के माइक्रोस्कोपी विश्लेषणों के लिए, 1 मिन के अधिग्रहण के समय में समस्या उत्पन्न नहीं होती है, और कई उदाहरणों में, यह पीएच रिकॉर्डिंग पर भी लागू हो सकता है। हालांकि, चरम पीएच परिवर्तन, जैसे कि ग्लूकोज (1 यूनिट/मिन) के संपर्क में आने के तुरंत बाद देखा गया रैपिड एसिडिफिकेशन, क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में निगरानी करना मुश्किल है।

वर्तमान कार्य दर्शाता है कि सी-SNARF-4 के साथ रेशियोमेट्रिक पीएच रिकॉर्डिंग एस म्यूटन और सी एल्बिकानसे बनी क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में व्यवहार्य हैं। भविष्य के अध्ययनों से अधिक प्रजातियों की विविधता के साथ क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में पीएच परिवर्तनों का विश्लेषण करने की विधि को नियोजित किया जा सकता है, विशेष रूप से सीटू में उगाई जाने वाली बायोफिल्मों में (यानी बचपन की मिर्च वाले बच्चों में)30। इस अध्ययन में, बायोफिल्मों में पीएच स्थिर परिस्थितियों के तहत और 15 मिन के सीमित अवलोकन समय के लिए निगरानी की गई थी, सही एक ग्लूकोज पल्स के बाद । इसके अलावा प्रगति में सीटू की स्थिति में नकल करने के लिए तरल प्रवाह का अनुप्रयोग अधिक बारीकी से14,31,32शामिल हो सकता है । इसके अलावा, पीएच रेशियोमेट्री का उपयोग क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में दीर्घकालिक पीएच परिवर्तनों पर विभिन्न पोषण संबंधी स्थितियों के प्रभाव का अध्ययन करने और अंतर्निहित मेजबान ऊतकों पर बायोफिल्म पीएच के प्रभाव को स्पष्ट करने में योगदान करने के लिए किया जा सकता है। फिर, बचपन की क्षय में दंत तामचीनी का विखनिजीकरण एक प्रमुख उदाहरण के रूप में काम कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

Anette Aakjær थॉमसन और जेवियर ई. गार्सिया उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं । लेखक छवि विश्लेषण पर उपयोगी चर्चाके लिए रूबेन्स स्पिन-नेटो का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

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References

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कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके क्रॉस-किंगडम बायोफिल्म्स में एक्स्ट्रासेलुलर पीएच की निगरानी
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Schlafer, S., Frost Kristensen, M.… More

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

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