Summary
Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.
Abstract
Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële cellen zijn betrokken bij een verscheidenheid aan orale ziekten, zoals endodontische infecties, parodontitis, mucosale infecties en, met name, vroege kindercariës. In al deze omstandigheden beïnvloedt de pH in de biofilmmatrix microbe-host interacties en dus de progressie van de ziekte. Het huidige protocol beschrijft een confocale microscopiegebaseerde methode om de pH-dynamiek te monitoren in cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutanen. Het pH-afhankelijke dual-emissiespectrum en de kleureigenschappen van de ratiometrische sonde C-SNARF-4 worden benut om druppels pH te bepalen in extracellulaire gebieden van de biofilms. Het gebruik van pH-ratiometrie met de sonde vereist een zorgvuldige keuze van imaging parameters, een grondige kalibratie van de kleurstof, en zorgvuldige, drempel-gebaseerde nabewerking van de beeldgegevens. Bij correct gebruik maakt de techniek een snelle beoordeling van extracellulaire pH mogelijk in verschillende gebieden van een biofilm en dus de monitoring van zowel horizontale als verticale pH-gradiënten in de tijd. Hoewel het gebruik van confocale microscopie Z-profilering beperkt tot dunne biofilms van 75 μm of minder, is het gebruik van pH-ratiometrie bij uitstek geschikt voor de niet-invasieve studie van een belangrijke virulentiefactor in cross-kingdom biofilms.
Introduction
Langlaufbiofilms bestaande uit zowel schimmel- als bacteriële soorten zijn betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen in de mondholte. Candida spp. zijn vaak geïsoleerd van endodontische infecties1 en van parodontale laesies2,3. Bij slijmvliesinfecties is aangetoond dat streptokokkensoorten uit de mitisgroep de vorming van schimmels biofilm, weefselinvasie en verspreiding in zowel in vitro als murinemodellen4,5,6,7verbeteren. Het meest interessant, mondelinge vervoer van Candida spp. is bewezen te worden geassocieerd met de prevalentie van cariës bij kinderen8. Zoals blijkt uit knaagdiermodellen, verhoogt een symbiotische relatie tussen Streptococcus mutans en Candidas albicans de productie van extracellulaire polysachariden en leidt tot de vorming van dikkere en meer cariogene biofilms9,10.
In alle bovengenoemde omstandigheden, met name voor jonge kinderen, is de pH van de biofilm van belang voor de progressie van de ziekte, en de eminente rol van de biofilmmatrix voor de ontwikkeling van acidogene microomgevingen11 vraagt om methodologieën die het bestuderen van pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms mogelijk maken. Eenvoudige en nauwkeurige confocale microscopiegebaseerde benaderingen om pH in bacteriële12 en schimmel13 biofilms te monitoren zijn ontwikkeld. Met de ratiometrische kleurstof C-SNARF-4 en op drempels gebaseerde beeldnabewerking kan extracellulaire pH in real-time worden bepaald in alle drie de dimensies van een biofilm14. In vergelijking met andere gepubliceerde technieken voor op microscopie gebaseerde pH-monitoring in biofilms is pH-ratiometrie met C-SNARF-4 eenvoudig en goedkoop, omdat het niet de synthese vereist van deeltjes of verbindingen die een referentiekleurstof15 of het gebruik van tweefotonexcitatie16bevatten . Het gebruik van slechts een kleurstof voorkomt problemen met sonde compartimentering, fluorescerende bleed-through, en selectief bleken16,17,18 terwijl nog steeds rekening houdend met een betrouwbare differentiatie tussen intra- en extracellulaire pH. Ten slotte wordt incubatie met de kleurstof uitgevoerd na de groei van de biofilm, waardoor zowel laboratorium als in situ-gekweekte biofilms kunnen worden bestudeerd.
Het doel van het huidige werk is om het gebruik van pH-ratiometrie uit te breiden en een methode te bieden om pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms te bestuderen. Als proof of concept wordt de methode gebruikt om pH te monitoren in biofilms van twee soorten bestaande uit S. mutanen en C. albicans die aan glucose zijn blootgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor speekselafname werd herzien en goedgekeurd door de Ethische Commissie van Aarhus County (M-20100032).
1. Teelt van biofilms over het koninkrijk sekoninkrijk
- Kweek S. mutans DSM 20523 en C. albicans NCPF 3179 op bloedagarplaten bij 37 °C onder aërobe omstandigheden.
- Breng enkele kolonies van elk organisme over naar reageerbuizen gevuld met 5 mL hersenhartinfusie (BHI). Groei 18 uur onder aërobe omstandigheden bij 37 °C.
- Centrifugeer de nachtculturen op 1.200 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg, bredig de cellen in fysiologische zoutvastheid opnieuw op en pas de OD550 nm aan 0,5 aan voor C. albicans (~107 cellen/mL) en S. mutans (~108 cellen/mL). Verdun de S. mutans suspensie 1:10 met steriele fysiologische zout (~107 cellen/mL).
- Pipette 50 μL steriele speekseloplossing, bereid volgens de methode van de Jong et al.19,in de putten van een optische bodem 96-put plaat voor microscopie. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C. Was de putten 3x met 100 μL steriele fysiologische zoutlijn. Maak de putten leeg.
- Voeg 100 μL C. albicans vering toe aan elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 90 min. Was 3x met steriele fysiologische zoutlijn.
LET OP: Maak de putten niet volledig leeg tijdens het wassen. Laat een reservoir van 20 μL achter om overmatige afschuifkrachten te voorkomen. - Voeg 100 μL warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min) toe aan elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Was 3x met steriele fysiologische zoutlijn. Maak de putten leeg en laat een reservoir van 20 μL achter.
- Voeg 100 μL S. mutans suspensie (voorbereid in stap 1.3) toe aan elke put. Voeg 150 μL BHI met 5% sacharose toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur of langer. Bij het cultiveren van oudere biofilms, verander het medium dagelijks in verse BHI. Aan het einde van de langlauffase was 5x met steriele fysiologische zoutlijn.
2. Ratiometrische pH-beeldvorming
OPMERKING: Ratiometrische pH-beeldvorming moet onmiddellijk worden uitgevoerd nadat de groei van de biofilm is voltooid.
- Gebruik voor ratiometrische pH-beeldvorming een omgekeerde confocale laserscanningmicroscoop met een 63x olie- of wateronderdompelingslens, een 543 nm-laserlijn en een spectralimagingsysteem (d.w.z. META-detector) om de beeldvorming van overlappende fluorescente signalen mogelijk te maken. Gebruik een couveuse om het microscoopstadium op te warmen tot 35 °C.
- Stel de detector in om de detectie van groene fluorescentie van 576−608 nm en gelijktijdige detectie van rode fluorescentie van 629−661 nm te garanderen. Kies een geschikte laserkracht en gain om over- en onderbelichting te voorkomen.
OPMERKING: Belichting van de afbeeldingen is het best te zien in paletafbeeldingen met valse kleuren. - Stel de pinholegrootte in op 1 Airy Unit of een optisch segment van ~0,8 μm. Stel de afbeeldingsgrootte in op 512 x 512 pixels en de scansnelheid op 2. Kies een lijngemiddelde van 2, met de gemiddelde optie.
OPMERKING: Controleer aan het begin van een reeks experimenten of de gekozen microscoopinstellingen een duidelijk contrast bieden tussen bacteriële cellen, schimmelcelwanden, biofilmmatrix en schimmelcytoplasma. - Bereid 100 μL steriele fysiologische zoutoplossing voor die 0,4% (w/v) glucose bevat, getitreerd tot pH 7. Bereid een voorraadoplossing van C-SNARF-4 (1 mM in dimethylsulfoxide). Voeg de kleurstof toe aan een eindconcentratie van 30 μM.
LET OP: Draag nitrilhandschoenen bij het hanteren van de ratiometrische kleurstof. - Leeg een van de putten met een cross-kingdom biofilm, waardoor een reservoir van 20 μL. Voeg de steriele zoutoplossing met glucose en de ratiometrische kleurstof. Plaats de 96-put plaat op de microscoop podium en beginnen met het beeld van de biofilm.
- Verwerf enkele afbeeldingen of Z-stacks op verschillende locaties van de biofilm. Markeer de X-Y-positie in de microscoopsoftware om pH-veranderingen in bepaalde gezichtsvelden in de loop van de tijd te volgen. Neem regelmatig foto's met de laser uitgeschakeld om te corrigeren voor detectoroffset.
- Herhaal stap 2.4–2.6 voor de analyse van elke biofilm die in een andere put wordt geteeld.
3. Kalibratie van de ratiometrische kleurstof
OPMERKING: Kalibratie van de kleurstof en de montage van een kalibratiecurve kan worden uitgevoerd op een andere dag dan ratiometrische pH-beeldvorming.
- Bereid een serie van 50 mM 2-morfolinoethaanzuur (MES) buffer getitreerd tot pH 4.0−7.8 in stappen van 0,2 pH-eenheden bij 35 °C. Pipetteer 150 μL van elke bufferoplossing in de putten van een optische bodem 96-put plaat voor microscopie.
- Voeg de kleurstof toe aan de met buffer gevulde putten van de 96-putplaat tot een eindconcentratie van 30 μM. Laat 5 min equilibrate.
- Verwarm het microscoopstadium tot 35 °C. Kies dezelfde microscoopinstellingen als voor ratiometrische pH-beeldvorming. Plaats de 96-put plaat op de microscoop podium. Focus op de bodem van de putten. Verwerf twee afbeeldingen (groen en rood kanaal) voor alle bufferoplossingen, 5 μm boven de onderkant van de put. Neem regelmatig foto's met de laser uitgeschakeld om te corrigeren voor detectoroffset.
- Voer het kalibratie-experiment uit in drievoud.
- Exporteer alle afbeeldingen als TIF-bestanden. Importeer ze in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. ImageJ20). Trek de foto's die met de laser zijn gemaakt af van de respectievelijke afbeeldingen van de bufferoplossingen door op Proces te klikken | Afbeeldingsrekenmachine | Aftrekken).
OPMERKING: Snijd indien nodig de afbeeldingen bij om artefacten aan de afbeeldingsranden te elimineren door rechthoekige selectie uit te voeren met Afbeelding | Bijsnijden. - Verdeel de groene kanaalafbeeldingen door de rode kanaalafbeeldingen en bereken de gemiddelde fluorescentieintensiteiten in de resulterende afbeeldingen door op Analyseren te klikken | Histogram.
- Uit de drievoudexperimenten, plot de gemiddelde groen /rode verhoudingen tegen de pH. Gebruik speciale software om een functie aan de kalibratiegegevens te passen (d.w.z. MyCurveFit).
4. Digitale beeldanalyse
OPMERKING: Digitale beeldanalyse kan op elk moment worden uitgevoerd na kalibratie van de pH-beeldvorming van de kleurstof en ratiometrische pH.
- Bewaar de groene en rode kanaalbiofilmafbeeldingen in afzonderlijke mappen en wijzig de naam van beide reeksen bestanden met sequentiële nummers (bijvoorbeeld GREEN_0001). Importeer de afbeeldingen in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. ImageJ). Klik op Analyseren | Histogram om de gemiddelde fluorescentieintensiteit in de genomen beelden te bepalen en de waarde van de biofilmbeelden af te trekken door op Proces te klikken | Wiskunde | Aftrekken.
- Importeer de 2 beeldreeksen in speciale beeldanalysesoftware (d.w.z. daime21). Een op drempelgebaseerde segmentatie van de rode kanaalafbeeldingen uitvoeren (Segment | Automatische segmentatie | Aangepaste drempelwaarde). Stel de 'lage' drempel boven de fluorescentieintensiteit van het schimmelcytoplasma en de 'hoge' drempel onder de intensiteit van de schimmelcelwanden en de bacteriën.
OPMERKING: Wanneer de juiste drempelwaarden zijn gekozen, worden alleen extracellulaire gebieden herkend als objecten. - De objectlaag van de gesegmenteerde afbeeldingsreeks overbrengen naar de afbeeldingsreeks voor groene kanalen. Klik hiervoor op Segment | Objectlaag overbrengen.
OPMERKING: Als het contrast tussen extracellulaire gebieden en schimmelcytoplasma te zwak is in de afzonderlijke kleurkanalen, voegt u de groene kanaalafbeeldingsreeks toe aan de rode kanaalreeks voordat u segmenteert door op Bewerken te klikken | Afbeeldingscalculator | Bijtelling. Voer de segmentatie uit zoals beschreven onder punt 4.2 en zet de objectlaag van de gesegmenteerde afbeeldingsreeks over naar zowel de groene als de afbeeldingsreeks met rood kanaal. - Gebruik de objecteditor om niet-objectpixels in de rode en groene kanaalafbeeldingsreeks te verwijderen (Visualizer | Objecteditor | In alle afbeeldingen | Niet-objectpixels verwijderen). Nu worden de biofilmbeelden gewist uit zowel bacteriële als schimmelcellen. Exporteer de verwerkte afbeeldingsreeks als TIF-bestanden.
- Importeer beide afbeeldingsreeksen naar ImageJ. ImageJ kent een intensiteit van 0 toe aan alle niet-objectpixels. Verwijder deze pixels door de rode afbeeldingsreeks (R1) zelf te delen (Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: R1; Operatie: Verdeel; Afbeelding 2: R1) en vermenigvuldigen van de resulterende afbeeldingsreeks (R2) met de oorspronkelijke rode afbeeldingsreeks(Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: R1; Bewerking: Vermenigvuldigen; Afbeelding 2: R2). Er wordt een derde afbeeldingsreeks (R3) gemaakt, identiek aan R1, met uitzondering van het feit dat NaN is toegewezen aan alle pixels met een intensiteit van 0 in R1. Ga op dezelfde manier verder met de groene afbeeldingsreeks.
- Gebruik het filter 'Gemiddelde' (Proces | Filters | Gemiddelde | Straal | 1 pixel) op de rode en groene kanaal beeldserie om detectorruis te compenseren. Verdeel de groene kanaalafbeeldingsreeks door de rode kanaalafbeeldingsreeks (Proces | Afbeeldingscalculator | Afbeelding 1: G3; Operatie: Verdeel; Afbeelding 2: R3). De resulterende afbeeldingsreeks (G3/R3) toont de groen/rode verhouding voor alle objectpixels.
- De gemiddelde verhouding voor elke afbeelding berekenen (Analyseren | Histogram). Valse kleuring toepassen voor een betere visuele weergave van de verhoudingen in de afbeeldingen (Afbeelding | Opzoektabellen). Zet de groen/rode verhoudingen om naar pH-waarden met behulp van de functie die is uitgerust onder 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 24 uur en 48 uur ontwikkelden robuuste cross-kingdom biofilms zich in de putplaten. C. albicans vertoonden verschillende mate van filamenteuze groei en S. mutanen vormden dichte clusters tot 35 μm hoog. Enkele cellen en ketens van S. mutanen gegroepeerd rond schimmel hyphae, en grote intercellulaire ruimten aangegeven de aanwezigheid van een volumineuze matrix (Figuur S1).
Kalibratie van de ratiometrische kleurstof levert een asymmetrische sigmoïdale curveop 13,14. De extracellulaire pH in de biofilms daalde snel in de eerste 5 min na blootstelling aan glucose tegen verschillende snelheden in verschillende microscopische gezichtsvelden. Daarna vertraagde de verzuring en bereikte deze waarden van 5,5–5,8 na 15 min (figuur 1). Repliceren de biofilms vertoonden een vergelijkbaar gedrag, met slechts lichte variaties in de gemiddelde pH(figuur S2).
De nauwkeurigheid van de pH-berekeningen is sterk afhankelijk van een zorgvuldige keuze van beeldinstellingen tijdens de acquisitie. Voor de betrokken biofilms bleek een optisch stukje 0,8 μm ideaal om het best mogelijke contrast tussen extracellulaire gebieden en schimmelcytoplasma(figuur S3)te verkrijgen. Bovendien zorgden een pixelgrootte van 0,28 μm (Figuur S4), een pixelopnametijd van 102,4 μs (figuur S5) en een lijngemiddelde van 2 (Figuur S6) voor een goed contrast samen met een aanvaardbare beeldverwervingstijd van ~1 min. Tijdens beeldnabewerking werden alle bacteriële en schimmelcellen uit de beelden verwijderd, terwijl de meeste van de omringende extracellulaire gebieden werden opgenomen in de daaropvolgende pH-analyse. Afhankelijk van de helderheid van de beelden moesten verschillende boven- en onderdrempels worden gekozen (figuur 2).
De pH-gegevens in figuur 1 en figuur S2 werden 5 μm geregistreerd uit de biofilm-substratum-interface. Met toenemende afstand tot het substraat, en afhankelijk van de celdichtheid in de biofilms, neemt de fluorescentieintensiteit af, wat resulteert in een lager contrast tussen cellen en matrix. Echter, in de dunne biofilms (~ 35 μm) geteeld in de huidige studie, contrast aan de bovenkant van de biofilm toegestaan betrouwbare beeldanalyse(Figuur S7A).
Figuur 1: Gebruik van pH-ratiometrie in cross-kingdom biofilms blootgesteld aan glucose. (A) Een gezichtsveld in een gekleurde biofilm werd afgebeeld met confocale microscopie en het gebied bedekt met bacteriële en schimmelcellen werd verwijderd voorafgaand aan ratiometrische analyse. (B) De pH in de extracellulaire ruimte werd berekend en gevisualiseerd met behulp van een opzoektafel (16 kleuren). Schaalrepen = 20 μm. (C) De pH in de 24 uur durende cross-kingdom biofilms daalde snel bij blootstelling aan glucose met iets andere snelheden in verschillende gezichtsvelden. Foutbalken = standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Op drempelgebaseerde beeldsegmentatie van gekleurde biofilms. Als gevolg van de lokale pH veranderingen, fluorescentie intensiteit in de biofilms verandert in de tijd. (A) enb) vertonen hetzelfde microscopische gezichtsveld na respectievelijk 1 min en 15 min blootstelling aan glucose. Tijdens beeldsegmentatie moeten hoge en lage drempels voldoende worden gekozen om alle gebieden die door bacteriële en schimmelcellen worden bestreken, te elimineren. (C) Blauwe gebieden werden geëlimineerd door de lage drempel (40), rode gebieden door de hoge drempel (115). (D) Alleen extracellulaire gebieden werden herkend als objecten (omgeven door oranje lijnen). (E) Na eliminatie van het gebied waarop microbiële cellen betrekking hebben, kan de pH-berekening worden uitgevoerd in de biofilmmatrix. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S1: Typische 24 uur cross-kingdom biofilm gekleurd met de ratiometrische kleurstof. Veel C. albicans cellen weergegeven filamenteuze groei, terwijl S. mutanen (geel) cellen gevormd dichte clusters of gelokaliseerd rond schimmel hyphae als enkele cellen of ketens. Grote intercellulaire ruimten wezen op de aanwezigheid van een volumineuze biofilmmatrix. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S2: De pH ontwikkeling in 24 uur cross-kingdom biofilms blootgesteld aan glucose. (A), (B) en (C) De pH werd ratiometrisch bepaald in drie replicerende biofilms gedurende 15 min na blootstelling aan glucose. Na een snelle pH-daling in de eerste 5 min vertraagde de verzuring en werden niveaus van 5,5−5,8 bereikt na 15 min. In verschillende microscopische gezichtsvelden werden iets verschillende percentages waargenomen (elk vertegenwoordigd door een lijn). Kalibratie van de ratiometrische sonde werd slechts één keer uitgevoerd. Foutbalken = SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S3: Impact van optische snijdikte op het contrast van het beeld. Afbeeldingen van gekleurde biofilms werden verkregen met (A) een pinhole grootte van 2 Airy Units en een optische snijdikte van 1,6 μm, en (B) 1 Airy Unit en een optisch plakje van 0,8 μm. Bij 1 Airy Unit was een hogere laserkracht/winst nodig voor het verkrijgen van afbeeldingen, maar het contrast tussen schimmelcytoplasma en extracellulaire gebieden verbeterde. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S4: Impact van resolutie op afbeeldingscontrast. Afbeeldingen van gekleurde biofilms werden verkregen met pixelmaten van (A) 1,12 μm, (B) 0,56 μm, (C) 0,28 μm, (D) 0,14 μm, en (E) 0,11 μm. De vermindering van de pixelgrootte onder 0,28 μm heeft het contrast tussen extracellulaire gebieden en schimmelcytoplasma niet verbeterd. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S5: Impact van de scansnelheid op het contrast met het beeld. Afbeeldingen van gekleurde biofilms werden verkregen met pixel-dwelltijden van (A) 12,8 μs, (B) 25,6 μs,( C) 51,2 μs, (D) 102 μs, en (E) 164 μs. Het verhogen van de pixel-dwelltijd na 102 μs verbeterde het contrast tussen extracellulaire en intracellulaire gebieden niet. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S6: Impact van gemiddelde op beeldcontrast. Beelden van gekleurde biofilms werden verworven met lijngemiddelden (gemiddelde) van (A) 1, (B) 2 en (C) 4. Een lijngemiddelde van 2 zorgde voor het beste compromis tussen contrast en aanschaftijd. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S7: Beeldcontrast in puur schimmelbiofilms en cross-kingdom biofilms. (A) De bovenkant van een gekleurde cross-kingdom biofilm werd afgebeeld 30 μm van de interface. Het contrast tussen extracellulaire en intracellulaire gebieden was lager dan bij de biofilmbasis, maar nog steeds voldoende voor ratiometrische pH-analyse. (B) Een C. albicans monospecies biofilm werd afgebeeld voor pH ratiometrie. Laserkracht/gain kan worden verhoogd om het contrast tussen schimmelcelwanden en cytoplasma te optimaliseren. (C) In cross-kingdom biofilms, de helder fluorescerende bacteriën uitgesloten verdere toename van laserkracht / winst. Vandaar dat het contrast tussen schimmelcelwanden en cytoplasma minder uitgesproken is dan in puur schimmelbiofilms. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende protocollen voor de teelt van langlauffolies waarbij C. albicans en Streptococcus spp betrokken zijngeweest . De huidige opstelling richt zich echter op eenvoudige groeiomstandigheden, een tijdschema dat compatibel is met reguliere werkdagen, een evenwichtige soortensamenstelling en de ontwikkeling van een volumineuze biofilmmatrix. Bovendien werden 96-well platen bekleed met speekseloplossing om orale hechtingsvoorwaarden tot op zekere hoogte na te bootsen.
Het gebruik van pH-ratiometrie met C-SNARF-4 is een goedkope methode voor snelle metingen van de pH van biofilm, waarvan de voor- en nadelen elders in detail zijn besproken12,26. Kortom, de techniek maakt de beoordeling van pH op verschillende locaties binnen biofilms en dus het monitoren van horizontale pH-gradiënten en pH-ontwikkelingen in de tijd27mogelijk . Verticale pH-profielen kunnen ook worden opgenomen, maar de penetratiediepte wordt beperkt door het gebruik van confocale microscopie. Vandaar dat pH-ratiometrie een sneller, veelzijdiger en minder invasief alternatief vormt voor pH-micro-elektroden, die momenteel de keuzemethode zijn voor Z-profilering van dikke biofilms28. In vergelijking met andere microscopiegebaseerde methoden voor pH-opnamen in biofilms heeft pH-ratiometrie met C-SNARF-4 het voordeel dat slechts één vlek in dienst is. Daarom worden verschillende problemen die kunnen voortvloeien uit het differentiële fluorescerende gedrag en de interactie tussen verschillende kleurstoffen omzeild26.
In cross-kingdom biofilms levert op drempelgebaseerde differentiatie tussen microbiële biomassa en extracellulaire gebieden problemen op in vergelijking met biofilms die alleen bacteriële of schimmelcellen bevatten. Bacteriële cellen internaliseren de ratiometrische kleurstof en geven een helder fluorescerend signaal weer in vergelijking met de biofilmmatrix, maar ook vergeleken met schimmelcelwanden. Schimmelcelwanden lijken iets helderder dan de biofilmmatrix, die op zijn beurt een hogere fluorescentie vertoont dan het schimmelcytoplasma. In biofilms die alleen uit schimmelcellen bestaan, kunnen beelden worden verkregen met een hoog laservermogen/winst, wat resulteert in voldoende contrast tussen de biofilmmatrix en het schimmelcytoplasma (Figuur S7B). Wanneer bacteriën aanwezig zijn, laser kracht / gain moet worden verminderd om overbelichting van bacteriële cellen(Figuur S7C)te voorkomen. Vandaar dat het contrast tussen schimmelcytoplasma en extracellulaire gebieden niet zo uitgesproken is, en beeldinstellingen zoals pinholegrootte, pixelgrootte en pixel-dwelltijd moeten met grote zorg worden gekozen voor ratiometrische analyse.
Zoals voor alle microscopie-gebaseerde technieken, beeldkwaliteit en acquisitie tijd zijn omgekeerd gecorreleerd. In de huidige cross-kingdom biofilms was een beeldtijd van ~30 s, idealiter 1 min, nodig om een geschikte kwaliteit te verkrijgen voor latere pH-analyse. Ter vergelijking: biofilms die alleen bacteriën herbergen, kunnen in 10 s of minder29met voldoende kwaliteit worden afgebeeld. Voor microscopieanalyses van biofilmgroei, structuur of samenstelling vormen aanschaftijden van 1 min geen probleem, en in veel gevallen kan dit ook gelden voor pH-opnamen. Extreme pH-veranderingen, zoals de snelle verzuring die onmiddellijk na blootstelling aan glucose (ΔpH > 1 unit/min) wordt waargenomen, zijn echter moeilijk te controleren in cross-kingdom biofilms.
Het huidige werk toont aan dat ratiometrische pH-opnamen met C-SNARF-4 haalbaar zijn in cross-kingdom biofilms bestaande uit S. mutans en C. albicans. Toekomstige studies kunnen gebruik maken van de methode om pH-veranderingen in cross-kingdom biofilms met een grotere soortendiversiteit te analyseren, vooral in biofilms die in situ worden geteeld (d.w.z. bij kinderen met vroege kinderen cariës)30. In deze studie werd de pH in de biofilms gecontroleerd onder statische omstandigheden en voor een beperkte observatietijd van 15 min, direct na een glucosepuls. Verdere vooruitgang kan de toepassing van een vloeistofstroom omvatten om in situ omstandigheden nader na te bootsen14,31,32. Bovendien kan pH-ratiometrie worden gebruikt om de impact van verschillende voedingsomstandigheden op langetermijnpH-veranderingen in grensoverschrijdende biofilms te bestuderen en bij te dragen tot het verduidelijken van het effect van biofilm pH op de onderliggende hostweefsels. Nogmaals, de demineralisatie van tandglazuur in vroege kinderjaren cariës kan dienen als een prominent voorbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Anette Aakjær Thomsen en Javier E. Garcia worden erkend voor uitstekende technische ondersteuning. De auteurs bedanken Rubens Spin-Neto voor vruchtbare discussies over beeldanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H.
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P.
