Summary
该协议描述了由念珠菌和链球菌组成的跨王国生物膜的培养，并提出了一种基于共焦点显微镜的方法，用于监测这些生物膜内的细胞外pH值。
Abstract
由真菌和细菌细胞组成的跨王国生物膜涉及各种口腔疾病，如内膜感染、牙周炎、粘膜感染，以及最值得注意的是儿童早期幼细胞。在所有这些条件下，生物膜基质中的pH影响微生物-宿主相互作用，从而影响疾病进展。本协议描述了一种基于共聚焦显微镜的方法，用于监测包括念珠菌和链球菌在内的跨王国生物膜内的pH动力学。利用pH依赖双发射光谱和比例探头C-SNARF-4的染色特性，确定生物膜细胞外区域pH的下降。在探头中使用 pH 比度测量需要仔细选择成像参数、彻底校准染料以及仔细、基于阈值的图像数据后处理。正确使用后，该技术可在生物膜的不同区域快速评估细胞外 pH 值，从而监测水平和垂直 pH 梯度随时间推后。虽然共聚焦显微镜的使用将Z型探型限制在75μm或以下的薄生物膜，但pH比度测定法的使用非常适合对跨王国生物膜中一个重要的毒力因子进行非侵入性研究。
Introduction
包括真菌和细菌物种的跨王国生物膜涉及口腔中的多种病理条件。念珠菌经常从内淋病感染1和牙周病变2，3分离。在粘膜感染中，米炎组链球菌物种已被证明能增强真菌生物膜的形成、组织入侵，并在体外和小鼠模型4、5、6、7中传播。最有趣的是，坎迪达spp的口服运输已被证明与儿童8的卡英的流行有关。如啮齿动物模型所示，粘膜链球菌和坎迪塔斯白化病之间的共生关系增加了细胞外多糖的产生，并导致形成更厚、更结血的生物膜9，10。
在上述所有条件下，特别是幼儿期，生物膜pH对疾病进展非常重要，生物膜基质在酸原微环境的发展中发挥突出作用11要求采用各种方法，允许研究跨王国生物膜内的pH变化。已开发出简单、准确的基于共聚焦显微镜的方法，用于监测细菌12和真菌13生物膜内的pH。通过比例染料C-SNARF-4和基于阈值的图像后处理，可以在生物膜14的所有三个维度中实时确定细胞外pH值。与生物膜中基于显微镜的pH监测技术相比，pH与C-SNARF-4的比值测量简单而便宜，因为它不需要合成颗粒或化合物，包括参考染料15或使用双光子激发16。仅使用一种染料可以防止探针条块分割、荧光透流和选择性漂白16、17、18的问题，同时仍然允许对细胞内和细胞外pH的可靠区分。最后，在生物膜生长后使用染料进行孵育，从而可以研究实验室和原位生长的生物膜。
本研究的目的是扩大pH比度测定的使用，并提供一种研究跨王国生物膜pH变化的方法。作为概念的证明，该方法用于监测暴露于葡萄糖的双种生物膜中的pH。
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Protocol
奥胡斯县道德委员会（M-20100032）审查并批准了唾液收集协议。
1. 跨王国生物膜的培育
- 在有氧条件下，在37°C的血琼脂板上生长S.mutans DSM 20523和C.白化菌NCPF 3179。
- 将每个生物体的单个菌落转移到充满5 mL脑心脏输液（BHI）的试管中。在37°C的有氧条件下生长18小时。
- 在1，200 x g下将过夜培养物离心5分钟。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在生理盐水中，并将OD550 nm调整为0.5，用于C.白化（+10 7细胞/mL）和S.mutans（+10 8细胞/mL）。用无菌生理盐水（+107细胞/mL）稀释S.mutans悬浮液1：10。
- 移液器50μL的无菌唾液溶液，根据de Jong等人19号的方法制备，放入光学底部96孔板的孔中进行显微镜。在37°C下孵育30分钟。用100μL无菌生理盐水清洗水井3倍。清空水井。
- 在每个井中加入100 μL的C.白化剂悬浮液。在37°C孵育90分钟。用无菌生理盐水洗涤3x。
注意：在清洗过程中不要完全清空水井。离开 20 μL 的储液罐，以避免剪切力过大。 - 在每个井中加入100 μL的热灭活胎儿牛血清（在56°C处灭活30分钟）。在37°C孵育2小时，用无菌生理盐水洗3次。清空井，留下 20 μL 的储液罐。
- 在每个井中加入 100 μL 的S. mutans悬架（在步骤 1.3 中准备）。加入含有5%蔗糖的150μLBHI。在 37°C 孵育 24 小时或更长时间。培养较老的生物膜时，每天将培养的培养基片改为新鲜的BHI。在跨王国生物膜生长阶段结束时，用无菌生理盐水清洗5x。
2. 比例 pH 成像
注：生物膜生长完成后，需立即进行比例pH成像。
- 对于比例pH成像，使用带63x油或水浸透镜的倒式共聚焦激光扫描显微镜、543nm激光线和光谱成像系统（即META探测器），以便对重叠的荧光信号进行成像。使用培养箱将显微镜级加热至 35°C。
- 设置检测器以确保从 576–608 nm 检测绿色荧光，同时检测 629–661 nm 的红色荧光。选择适当的激光功率和增益，以避免过度曝光和曝光不足。
注： 图像的曝光最好在带有假着色的调色板图像中看到。 - 将针孔大小设置为 1 Airy 单位或光学切片 ±0.8 μm。将图像大小设置为 512 x 512 像素，扫描速度设置为 2。使用均值选项选择平均线 2。
注：在一系列实验开始时，检查所选显微镜设置在细菌细胞、真菌细胞壁、生物膜基质和真菌细胞质之间提供清晰的对比。 - 制备含有0.4%（w/v）葡萄糖的无菌生理盐水100μL，至pH7。制备C-SNARF-4（二甲基亚硫酸盐1 mM）的库存溶液。将染料添加到 30 μM 的最终浓度。
注意：处理比例染料时，请戴上硝化手套。 - 用跨王国的生物膜清空其中一口井，留下20μL的储液罐。加入含有葡萄糖的无菌盐水和比例染料。将 96 孔板放在显微镜台上，开始对生物膜进行成像。
- 在生物膜的不同位置获取单个图像或 Z 堆栈。在显微镜软件中标记 X-Y 位置，以跟踪特定视场随时间的变化。每隔一段时间，在激光关闭时拍摄图像，以校正探测器的偏移。
- 重复步骤2.4_2.6，分析生长在不同井中的每个生物膜。
3. 比例染料的校准
注： 染料的校准和校准曲线的拟合可以在与比例测量 pH 成像不同的当天进行。
- 在35°C下，以0.2 pH单位的步骤制备一系列50mM 2-二型硫酸（MES）缓冲液，其分量为pH 4.0±7.8。将每个缓冲液溶液的移液器 150 μL 放入光学底 96 孔板的孔中，用于显微镜。
- 将染料添加到 96 孔板的缓冲填充孔中，最终浓度为 30 μM。让平衡5分钟。
- 将显微镜级加热至 35°C。选择与比例 pH 成像相同的显微镜设置。将 96 孔板放在显微镜台上。专注于井底。获取两个图像（绿色和红色通道）的所有缓冲液溶液，井底上方 5 μm。每隔一段时间，在激光关闭时拍摄图像，以校正探测器的偏移。
- 以三次执行校准实验。
- 将所有图像导出为 TIF 文件。将它们导入专用图像分析软件（即 ImageJ20）。单击"过程" 从缓冲液解决方案的相应图像中减去激光关闭时拍摄的图像 |图像计算器 |减去）。
注： 如有必要，使用Image |裁剪. - 通过红色通道图像划分绿色通道图像，并通过单击"分析" 来计算结果图像中的平均荧光强度直方图。
- 从三元实验中，绘制平均绿色/红色比与pH值。使用专用软件将功能适合校准数据（即 MyCurveFit）。
4. 数字图像分析
注：在校准染料和比例pH成像后，可在任何时间点执行数字图像分析。
- 将绿色和红色通道生物膜图像存储在单独的文件夹中，并重命名两个系列文件，并带有序号（例如，GREEN_0001）。将图像导入专用图像分析软件（即 ImageJ）。单击分析|直方图，用于确定使用激光关闭拍摄的图像中的平均荧光强度，并通过单击"过程" 从生物膜图像中减去值 |数学|减去。
- 将 2 个图像系列导入专用图像分析软件（即 daime21）。对红色通道图像执行基于阈值的分割（段|自动分段|自定义阈值）。将"低"阈值设置为高于真菌细胞质的荧光强度和低于真菌细胞壁和细菌强度的"高"阈值。
注：选择适当的阈值后，只有细胞外区域被识别为对象。 - 将分段图像系列的对象图层传输到绿色通道图像系列。为此，请单击"段" |传输对象层。
注：如果细胞外区域和真菌细胞质在单个颜色通道中的对比度太弱，则在分割之前通过单击"编辑|图像计算器|添加.执行 4.2 下所述的分割，并将分段图像系列的对象图层传输到绿色和红色通道图像系列。 - 使用对象编辑器删除红色和绿色通道图像系列中的非对象像素（可视化工具|对象编辑器|在所有图像 |删除非对象像素）。现在，生物膜图像从细菌细胞和真菌细胞中清除。将处理过的图像系列导出为 TIF 文件。
- 将两个图像系列导入 ImageJ。ImageJ 为所有非对象像素分配强度 0。通过将红色图像系列 （R1） 自行划分来删除这些像素 （进程|图像计算器|图 1： R1;操作：除分;图像 2： R1），并将生成的图像系列 （R2） 与原始红色图像系列（Process =图像计算器|图 1： R1;操作：乘法;图 2：R2。创建第三个图像系列 （R3）， 与 R1 相同，但 NaN 分配给 R1 中强度为 0 的所有像素。以相同的方式继续使用绿色图像系列。
- 使用"Mean"过滤器（过程|过滤器|平均|半径|1 像素）红色和绿色通道图像系列，以补偿探测器噪声。将绿色通道图像系列除以红色通道图像系列 （进程|图像计算器|图片1：G3;操作：除分;图 2：R3。生成的图像系列 （G3/R3） 显示所有对象像素的绿色/红色比例。
- 计算每个图像的平均比率（分析|直方图）。应用假着色，以更好地直观地表示图像中的比例（图像|查找表）。使用 3.6 下拟合的功能将绿色/红色比率转换为 pH 值。
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Representative Results
24小时和48小时后，在井板中开发出了强大的跨王国生物膜。C. 白化菌表现出不同程度的丝状生长，而S.mutans在高度形成高达35μm的密集簇。单细胞和S.mutan的链群在真菌的hyphae周围，和较大的细胞间空间表明存在一个大量的矩阵（图S1）。
比例染料的校准产生不对称的sigmoidal曲线13，14。在接触葡萄糖后，生物膜中的细胞外pH值在不同微观视场以不同速率迅速下降。此后，酸化减慢，通常在15分钟后达到5.5~5.8的值（图1）。复制生物膜表现出类似的行为，平均pH值只有细微的变化（图S2）。
pH 计算的准确性在很大程度上取决于采集期间图像设置的谨慎选择。对于相关生物膜，0.8 μm 的光学片被证明是在细胞外区域和真菌细胞质之间获得最佳对比度的理想（图 S3）。此外，像素大小为0.28 μm（图S4），像素的均衡时间为102.4μs（图S5），线平均2（图S6）提供了良好的对比度，可接受的图像采集时间为±1分钟。在图像后处理过程中，所有细菌细胞和真菌细胞都从图像中去除，而大多数周围的细胞外区域都包含在随后的pH分析中。根据图像的亮度，必须选择不同的上限和下阈值（图2）。
图1和图S2所示的pH值数据从生物膜层界面记录为5μm。随着与基材距离的增加，并且根据生物膜中的细胞密度，荧光强度降低，导致细胞和基质之间的对比度降低。然而，在本研究中生长的薄生物膜（±35μm）中，生物膜顶部的对比度允许可靠的图像分析（图S7A）。
图1：在暴露于葡萄糖的跨王国生物膜中使用pH比度。（A） 彩色生物膜中的视场以共聚焦显微镜成像，细菌和真菌细胞覆盖的区域在比例分析前被移除。（B） 使用查找表（16 种颜色）计算和可视化细胞外空间中的 pH 值。刻度条 = 20 μm. （C） 24 h 跨王国生物膜中的 pH 值在暴露于葡萄糖时，在不同的视场以略有不同的速度迅速下降。误差柱 = 标准差 （SD）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：彩色生物膜基于阈值的图像分割。由于局部pH的变化，生物膜中的荧光强度会随时间而变化。（A） 和 （B） 在分别接触葡萄糖 1 分钟和 15 分钟后显示相同的微观视野.在图像分割过程中，需要充分选择高阈值和低阈值，以消除细菌和真菌细胞覆盖的所有区域。（C） 蓝色区域被低阈值 （40） 所消除，红色区域被高阈值 （115） 所消除。（D） 只有细胞外区域被识别为物体（被橙色线条包围）。（E） 消除微生物细胞覆盖的区域后，可在生物膜基质中进行 pH 计算。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图S1：典型24小时跨王国生物膜沾染比例染料。许多C.白化细胞表现出丝状生长，而S.mutans（黄色）细胞形成致密的簇或围绕真菌的hyphae作为单个细胞或链。大型细胞间空间表明存在大量生物膜基质。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图S2：pH在24h跨王国生物膜中暴露葡萄糖。（A） （B） 和 （C） 在暴露于葡萄糖后，pH 值在三种复制生物膜中以比例测定为 15 分钟。在前5分钟快速下降pH值后，酸化减缓，15分钟后达到5.5~5.8的水平。 在不同的微观视场（每个以线表示）观察到略有不同的速率。比例探头的校准只执行一次。错误栏 = SD.请点击此处查看此图的较大版本。
图S3：光学切片厚度对图像对比度的影响。彩色生物膜的图像被获取为 （A） 针孔大小为 2 Airy 单位和光学切片厚度 1.6 μm， 和 （B） 1 空气单元和 0.8 μm 光学片。在 1 Airy 单元中，图像采集需要更高的激光功率/增益，但真菌细胞质和细胞外区域之间的对比度有所改善。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 S4：分辨率对图像对比度的影响。彩色生物膜的图像被获取像素尺寸为 （A） 1.12 μm，（B ） 0.56 μm， （C） 0.28 μm， （D） 0.14 μm， 和 （E） 0.11 μm. 像素大小减小在 0.28 μm 下， 没有改善细胞外区域和真菌细胞质之间的对比度.比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 S5：扫描速度对图像对比度的影响。彩色生物膜的图像采集时像素为（A） 12.8 μs、 （B） 25.6 μs， （C） 51.2 μs，（D ） 102 μs， 和 （E） 164 μs. 增加像素的置点时间超过 102 μs 不会改善细胞外和细胞内区域之间的对比度.比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 S6：平均对图像对比度的影响。彩色生物膜的图像是获得线平均值（均值）的 （A） 1 ，B） 2 和 （C） 4.线平均 2 提供了对比度和采集时间之间的最佳折衷。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图S7：纯真菌生物膜和跨王国生物膜的图像对比。（A） 彩色跨王国生物膜的顶部从界面上拍摄到 30 μm。细胞外和细胞内区域之间的对比度低于生物膜碱基，但仍足以进行比例pH分析。（B） A. A. 白化单一物种生物膜被成像为 pH 比度测定法.激光功率/增益可以增加，以优化真菌细胞壁和细胞质之间的对比度。（C） 在跨王国的生物膜中，明亮的荧光细菌排除了激光功率/增益的进一步增加。因此，真菌细胞壁和细胞质之间的对比不如纯真菌生物膜明显。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
涉及白化病和链球菌的跨王国生物膜的培养方案，在之前已经描述了9，22，23，24，25。然而，目前的设置侧重于简单的生长条件，与正常工作日兼容的时间表，平衡的物种组成，以及开发大量的生物膜基质。此外，96孔板涂有唾液溶液，在一定程度上模拟口腔粘附条件。
使用p-SNARF-4的pH比度测定法是快速测量生物膜pH值的一种廉价方法，其优缺点已在其他地方详细讨论了。简而言之，该技术允许评估生物膜内不同位置的pH值，从而监测水平pH梯度和pH发展随时间27。垂直 pH 型材也可以记录，但渗透深度受到使用共聚焦显微镜的限制。因此，pH比度测量是pH微电极的更快、更通用、侵入性小的替代品，目前它是厚生物膜28的Z型分析的首选方法。与生物膜中其他基于显微镜的pH记录方法相比，C-SNARF-4的pH比度测量具有仅使用一个染色的优点。因此，从差分荧光行为和不同染料之间的相互作用中可能出现的几个问题被规避26。
在跨王国生物膜中，与仅包含细菌或真菌细胞的生物膜相比，微生物生物量和细胞外区域之间的阈值分化会带来一些问题。细菌细胞内化比例染料，与生物膜基质相比显示明亮的荧光信号，但与真菌细胞壁相比。"真菌细胞壁似乎比生物膜基质亮一些，而生物膜基质的荧光比真菌细胞质高。在仅由真菌细胞组成的生物膜中，图像可以获得高激光功率/增益，从而在生物膜基质和真菌细胞质之间产生足够的对比度（图S7B）。当细菌存在时，必须降低激光功率/增益，以避免细菌细胞过度暴露（图S7C）。因此，真菌细胞质和细胞外区域之间的对比度并不明显，并且必须在比例分析时非常注意选择图像设置，如针孔大小、像素大小和像素-住距时间。
对于所有基于显微镜的技术，图像质量和采集时间成反比。在目前的跨王国生物膜中，需要30秒的成像时间，理想情况下为1分钟，以获得适当的质量，以便随后进行pH分析。相比之下，只有含有细菌的生物膜在10s或更少29时可以成像足够的质量。对于生物膜生长、结构或成分的显微镜分析，1分钟的采集时间不构成问题，在许多情况下，这可能也适用于pH记录。然而，在跨王国的生物膜中很难监测极端的pH变化，例如暴露于葡萄糖后立即观察到的快速酸化（μpH > 1单位/分钟）。
本研究表明，在由S.mutans和C.白化菌组成的跨王国生物膜中，用C-SNARF-4进行比例pH记录是可行的。未来的研究可能采用这种方法来分析具有更大物种多样性的跨王国生物膜的pH变化，特别是在原位生长的生物膜中（即儿童早期幼崽）30。在这项研究中，生物膜中的pH值在静态条件下被监测，在葡萄糖脉冲之后，观察时间有限，为15分钟。进一步的进展可能包括应用流体流动来模拟更密切的14、31、32原位条件。此外，pH比度法可用于研究各种营养条件对跨王国生物膜长期pH变化的影响，并有助于阐明生物膜pH值对底层宿主组织的影响。同样，在幼儿蛀牙中，牙釉质的脱矿可能是一个突出的例子。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
阿内特·阿克尔·汤姆森和哈维尔·加西亚因出色的技术支持而得到认可。作者感谢鲁本斯·斯宾-内托对图像分析进行了富有成果的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
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