Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Abbiategrasso Brain Bank Protokol til indsamling, behandling og karakterisering aldrende hjerner

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/60296
Automatic Translation
*1,4, *1, 1, 2, 1, 1, 1,4, 3, 3, 3, 5, 2,6, 7, 5, 8, 1,2,3
1Department of Neurology and Neuropathology, Golgi-Cenci Foundation, 2Laboratory of Neurobiology and Neurogenetic, Golgi-Cenci Foundation, 3Department of Neuropsychology and Social Sciences, Golgi-Cenci Foundation, 4Department of Rehabilitation, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 5Genomic and Post-Genomic Center, IRCCS Mondino Foundation, 6Department of Brain and Behavioral Sciences, University of Pavia, 7Department of Pathology, ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, 8Department of Neurological Science, IRCCS Mondino Foundation, University of Pavia
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at spore individuelle hjerne-aldring baner gennem en hjernedonation program og korrekt karakterisering af hjerner. Hjernedonorer er involveret i en langsigtet langtidsundersøgelse, herunder serielle flerdimensionale vurderinger. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af hjernens behandling og en nøjagtig diagnostisk metode.

Abstract

I en konstant aldrende befolkning, forekomsten af neurodegenerative lidelser forventes at stige. Forståelse af sygdomsmekanismer er nøglen til at finde forebyggende og helbredende foranstaltninger. Den mest effektive måde at opnå dette på er gennem direkte undersøgelse af syge og sunde hjernevæv. Forfatterne præsentere en protokol for at opnå, behandle, karakterisere og gemme god kvalitet hjernevæv doneret af personer, der er registreret i en antemortem hjernedonation program. Donationen programmet omfatter en ansigt-til-ansigt empatisk tilgang til mennesker, en samling af komplementære kliniske, biologiske, sociale og livsstil oplysninger og serielle multi-dimensionelle vurderinger over tid til at spore individuelle baner af normal aldring og kognitiv tilbagegang. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores hjernebank en unik protokol til udskæring af friske prøver. Hjernesektioner af begge halvkugler er skiftevis frosset (ved -80 °C) eller fastgjort i formalin; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Med denne fremgangsmåde kan der opnås en fuldstændig histologisk karakterisering af alt frosset materiale, og omics-undersøgelser kan udføres på histologisk veldefinerede væv fra begge halvkugler, hvilket giver en mere fuldstændig vurdering af neurodegenerative sygdomsmekanismer. Korrekt og klar diagnose af disse sygdomme kan kun opnås ved at kombinere det kliniske syndrom med den neuropatologiske vurdering, som ofte tilføjer vigtige æologiske spor, der er nødvendige for at fortolke patogenesen. Denne metode kan være tidskrævende, dyr og begrænset, da den kun dækker et begrænset geografisk område. Uanset dens begrænsninger, den høje grad af karakterisering det giver kan være givende. Vores ultimative mål er at etablere den første italienske Brain Bank, alt imens understreger betydningen af neuropatologisk verificerede epidemiologiske undersøgelser.

Introduction

Ifølge WHO lider ca. 50 millioner mennesker i øjeblikket af demens, et tal, der forventes at blive tredoblet i 2050. Alzheimers sygdom er den vigtigste årsag til demens, efterfulgt af cerebrovaskulær sygdom og andre aldersrelaterede neurodegenerative lidelser. I 2017 udviklede WHO Det Globale Observatorium for Demens for at øge bevidstheden om demens og fremme en global handlingsplan mod det1. Hver enkelt har deres egen hjerne aldring bane, derfor søgen efter kuren kan være udfordrende på grund af kompleksiteten af patogenesen af neurodegenerative sygdomme. Måske, hver person besidder hende eller hans egen patogenese skrevet i hjernevævet kræver en personlig tilgang. Således, studiet af hjernevæv vil være nøglen til at forstå mekanismerne i neurodegeneration.

Ser man tilbage på historien om neurovidenskab, indser vi, at de mest imponerende og banebrydende opdagelser aldrig kunne have fundet sted uden direkte undersøgelse af den menneskelige hjerne. Gennem tiden har kilden til hjernevæv, der skal undersøges, ændret sig fra rå dissektioner, tilfældige "tilfældige møder" og i nogle tilfælde ulovlig handel til organiserede hjernesamlinger og strategiske moderne hjernebanker. Behandlingen af mange etiske aspekter er en af de vigtigste faktorer, der adskiller moderne hjernebanker fra fortidens hjernesamlinger. De første ægte moderne Brain Banks (BBs) blev indført i anden halvdel af det20. Nicholas Corsellis og Wallace Tourtelotte kan betragtes som pionerer inden for moderne hjernebank. I Storbritannien, Corsellis samlet en samling bedrift over 1000 veldokumenterede hjerner ramt med forskellige psykiske og neurologiske lidelser2. Desuden, Corsellis hjalp afsløre behovet for at bevare frisk hjernevæv i is af hensyn til biokemiske test3. I mellemtiden i USA, Wallace Tourtelotte indført antemortem hjernedonation programmer til at lette opfordring af potentielle hjernedonorer og sikre, at hjerner indsamlet er ledsaget af en komplet medicinsk og neurologiskhistorie 4,5. For et historisk overblik over hjernesamlinger og moderne BBs, se Carlos et al. 6.

Hvorfor har vi stadig brug for menneskelige hjerner? Hjernesygdomme kan kun gives en klar diagnose efter neuropatologisk undersøgelse. Neuropatologi udfordrer den kliniske diagnose og er nøglen til en korrekt fortolkning af de kliniske symptomer og til opdagelsen af de histologiske grundlag for nye syndromiske varianter. Diagnosen kan faktisk omdefineres på baggrund af det patologiske billede. Ikke desto mindre, obduktionsraten er faldet i de sidste årtier på grund af den seneste udvikling af innovative neuroimaging teknikker. Gennem hjernebilleddannelse kan de morfologiske, funktionelle og metaboliske ændringer i hjernen samt omfanget af proteins misfolding vurderes in vivo. Men in vivo neuroimaging og andre biomarkør undersøgelser kan kun give et "skøn" af det patologiske billede, da de ikke er i stand til at opdage subtile cellulære og molekylære ændringer. Fremskridt inden for molekylær billeddannelse og opdagelsen af nye biomarkører, målmolekyler og sporstoffer7 (f.eks. amyloid, TAU, mikrogliale sporstoffer) gør den menneskelige hjerne endnu mere uundværlig for fortolkningen af data fra kliniske evalueringer og biomarkørtest. Endvidere er omics-teknologierne (genomik, epigenomics, transskriptomik, metabolomik, proteomik, lipidomics, osv.), udført på friskogfrossen hjernevæv, åbnet nye muligheder for at forstå sygdomsmekanismer og opdage risikogener, nye diagnostiske og prognostiske markører, og potentiellelægemiddelmål 8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,,9,20,21,22,23.19

Til disse formål, moderne BBs arkiv vel karakteriseret, høj kvalitet hjernevæv gør dem tilgængelige for det videnskabelige samfund3,24. Hjerner, der leveres af BBs, skal ledsages af en komplet klinisk historie. Aktiviteten af en BB omfatter følgende: (1) Anerkendelse og rekruttering af syge og raske personer til hjernedonation programmer; den ideelle betingelse ville være at opnå en tværfaglig opfølgning af donorer gennem hele livet for at opnå en komplet klinisk, livsstil og social historie, og biomarkør profiler; faktisk, kognitive reserve og hjernestruktur afhænger af livsstil og socio-uddannelsesmæssige faktorer25,26, så disse oplysninger beriger de samlede data ved hånden. (2) Erhvervelse af hjernen (bestående af cerebrum, lillehjernen og hjernestammen) og relaterede væv (f.eks rygmarv, kranienerver og ganglier osv.) efter donorens død, alt imens standardiserede juridiske og etiske regler. (3) Passende behandling (dissektion, fiksering, frysning) af hjernen, som defineret i en standardiseret operativ protokol, for at opnå væv af høj kvalitet og for at give mulighed for fremtidig brug i tværfaglig forskning. (4) Detaljeret neuropatologisk karakterisering giver en endelig bestemt diagnose. (5) Opbevaring og distribution af vævsmateriale tilforskningsfællesskabet 27,28.

Alle BBs gemme både frosne og formalin-fast-paraffin indlejret væv. Hver BB har sin egen protokol. Bortset fra særlige undersøgelser, såsom den bihemisfæriske skæring protokol af Biomedical Research Institute (New Jersey)29 og Deramecourt's undersøgelse af cerebrovaskulær patologi30, de største BBs i verden blot skære cerebrum, cerebellum og hjernestammen langs midterlinjen (sagittal plan). Den ene halvdel dissekeres frisk og derefter frosset til biokemiske undersøgelser, mens den anden er fastsat i formalin til histopatologisk vurdering. Så biokemiske og histopatologiske analyser udføres separat på hver halvkugle. Beslutningen om , hvilken side der er fast eller frosset (lateralitet), afhænger af entalsbanken31,32,33,34,35. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores BB en unik protokol til udskæring af friske hjerner: tilstødende dele af hjernestammen og hver halvkugle er skiftevis faste og frosne; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Gennem denne metode er brugen af hjernevæv optimeret, og en komplet histologisk karakterisering af alt frosset materiale kan opnås med mulighed for at opnå og sammenligne histologiske og biokemiske oplysninger fra alle områder af begge halvkugler.

Rammen for vores hjernebankprojekt er byen Abbiategrasso. Abbiategrasso er en lille by omkring 22 km sydvest for byen Milano, i det nordlige Italien. Det har en befolkning på omkring 32.600 mennesker. Det er hjemsted for Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation er en del af et stort Rehabilitering Geriatric Hospital (ASP Golgi-Redaelli), og er et institut med fokus på forskning om aldring og pleje af ældre. Især fokuserer det på at studere mental aldring, de sociale og adfærdsmæssige faktorer, der påvirker det, og biologi og patologi underliggende aldersafhængige neurokognitive lidelser (NCDs). I 2009 lancerede GC Foundation en ny langsgående undersøgelse med 1321 deltagere (ud af 1644 støtteberettigede forsøgspersoner: indledende responsrate på 80,3 %) født mellem 1935 og 1939 (i alderen 70-75 år), af kaukasisk etnicitet, der bor i samme lille geografiske område. Undersøgelsen blev kaldt InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelsk: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) og er i øjeblikket i gang. InveCe.Ab er planlagt til at opnå en kohorte med maksimal homogenitet og mindst variabilitet med henblik på at vurdere forekomsten, prævalens og naturlige historie af demens, sammen med dens mulige risiko eller beskyttende faktorer, herunder adfærdsmæssige, psykosociale, kliniske og biologiske variabler36. Kohortens karakteristika er vist i figur 1 og tabel 1. De epidemiologiske data er i overensstemmelse med demenstendensen iden europæiske befolkning 37,,38 og InveCe.Ab-deltagerne har homogene genetiske og miljømæssige egenskaber, der repræsenterer en god model til at studere forløbet fra normal aldring til neurokognitive lidelser. Homogene populationer kræver faktisk færre forsøgspersoner for at opnå tilstrækkelig statistisk effekt. InveCe.Ab-metoden er allerede blevet rapporteret andetsteds36, men det er vigtigt at understrege dens flerdimensionale tilgang gennem periodisk kontrol (hvert 2.-3. år) ved hjælp af det samme sæt evalueringer, herunder: blodprøvetagning (metabolisk panel, homocystein og vitaminer, DNA-ekstraktion til profil Apolipoprotein E (APOE) og andre genetiske polymorfier relateret til kognition og aldring), antropometriske målinger (vægt, højde og talje), Talking Mens Walking Test (dobbelt opgave test), et interview for at vurdere livsstil (Middelhavet kost overholdelse, niveauer af fysisk aktivitet og kognitive engagement) og sociale faktorer (social involvering, ensomhed), en neuropsychological evaluering og en klinisk generel undersøgelse. At sammenligne sådanne langsgående data med postmortem neuropatologiske data ville være afgørende for forskning. Derfor har vores team og især Dr. Michela Mangieri udtænkt den neuropatologiske tilgang, der er nævnt ovenfor. Siden 2014 og under den anden opfølgning, inveCe.Ab deltagerne blev bedt om at donere deres hjerner, og dermed skabe fødslen af Abbiategrasso Brain Bank (ABB). De centrale donorer af ABB er InveCe.Ab deltagere, men ABB er nu åben for andre frivillige donorer. De er patienter fra ASP Golgi-Redaelli, hjemsted for flere patienter ramt af forskellige neurologiske sygdomme eller voksne frivillige, der lærer om ABB-projektet og hører til det samme geografiske område (Abbiategrasso og omgivelser). Alle donorer gennemgår den samme evalueringsprotokol.

Forfatterne foreslår en metode til at spore individuelle baner af normal aldring og den mulige progression til NCDs, og præcist at styre, behandle og karakterisere hjerner erhvervet fra sådanne donorer fulgte langsgående. Desuden er vores mål at møde og engagere enkeltpersoner i periodiske neurologiske vurderinger, seminarer og uddannelsesmæssige aktiviteter vedrørende hjernens trivsel og at øge deres bevidsthed om hjernedonation til forskningsformål.

Protocol

I overensstemmelse med vores institutions etiske komité for human forskning og BNE's adfærdskodeks udfører ABB sine aktiviteter efter etiske standarder39,40. Hjernehøstproceduren blev forelagt og godkendt af den etiske komité ved Universitetet i Pavia i forbindelse med InveCe.Ab-studiet36. Undersøgelsesprocedurerne var i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen fra 1964 og følgende ændringer. Samtykkeformularen er fuldstændig og let forståelig. Vær med i donationsprogrammet er en personlig beslutning, og der er behov for fuldstændig bevidsthed. Hvis en person ikke anses for kompetent til at underskrive samtykkeformularen, er det berettiget at give tilladelse fra værge eller pårørende (NOK). Tabel 2 rapporterer inklusions- og udelukkelseskriterier for hjernedonation. Forskningen blev udført under tilsyn af Federazione Alzheimer Italia.

1. Rekruttering til hjernen donation program

  1. Indkalde de emner, der havde udtrykt interesse i hjernedonation og deres NOK og / eller værge til at præsentere projektet (omfanget af donation program, processen med hjerne fjernelse, bevarelse, brug og distribution), retten til at trække sig ud af programmet på et givet tidspunkt, beskyttelse af anonymitet, og opfølgning strategier. Diskuter muligheden for yderligere biomarkør undersøgelser og genetiske tests. Bemærk den potentielle donors eller DENNES ønsker om at blive informeret om resultaterne.
  2. Forklar alle de økonomiske aspekter, herunder den manglende økonomiske gevinst for både Instituttet og donoren (hjerner doneres og distribueres altruistisk). Informere dem om, at ABB dækker udgifterne til kropstransport, mens familien dækker dem af begravelse, begravelse eller kremering.
  3. I tilfælde af accept skal du indhente underskriften af samtykket til at deltage i donationsprogrammet. Giv donoren en individuel numerisk kode for at garantere anonymitet. Nedskrive identifikationsnummeret på dem, der deltager i den langsgående undersøgelse, og angiv en anden kode, som hjernebanken nemt kan adskille de to undergrupper af donorer (deltagere eller ikke-deltagere i langtidsundersøgelsen; se tabel 3).
  4. Giv donoren et id-kort, der erklærer sin status som donor og viser telefonnummeret (tilgængelig 24/7) for at underrette Hjernebanken om hans død.

2. Donorevaluering og serieopfølftning

BEMÆRK: Det er kun muligt at give samtykke til nogle, og ikke alle, af nedenstående undersøgelser. Alle kliniske vurderinger udføres af det samme team, herunder en neurolog, en geriatriker med ekspertise inden for neurologi og 3 psykologer. Hvis nye symptomer udvikler sig, eller den kognitive tilbagegang skrider frem, kan tidsintervallet mellem opfølgninger forkortes.

  1. Som det er tilfældet med InveCe.Ab-undersøgelsen, skal du få et livsstilssocialt spørgeskema, herunder graden af autonomi (ADL, IADL), personlige vaner, sociale og livsstilsfaktorer, der kan påvirke mentale funktioner. Indsamle familie, medicinsk og neurologisk historie med oplysninger om genetiske, infektiøs, giftige, metaboliske, autoimmune, hjerte-kar-, traumatiske, degenerative, neoplastiske, og neurologiske sygdomme. Indsamle tidligere kliniske eksamener og liste farmakologiske behandlinger.
  2. Udføre en omfattende neuro-motorisk evaluering, herunder test for kranienerver funktion, fundus oculi, synsfelt, muskelstyrke og tone, følelser, sene reflekser, exteroceptive og primitive reflekser, meningeal tegn, kropsholdning, gangart, bevægelser, koordinering, lukkemuskelfunktioner, og enhver tilstedeværelse af fokal eller Babinski tegn. Vurder sprog, mental status og enhver ændring i adfærd.
  3. Foretage en omfattende neuro-kognitiv evaluering, herunder global kognition og en komplet neuropsykologisk vurdering af specifikke kognitive domæner: verbal og visuel hukommelse, opmærksomhed, psykomotorisk hastighed, sprog, semantisk hukommelse, udøvende funktioner, og visuospatial evner (Tabel 4 for detaljer). Overvej tilstedeværelsen af depression (CES-D skala).
  4. Der udtages en blodprøve, som anvendes til både analyse af blodkemi (tabel 5) og isolering og opbevaring af DNA-, plasma- og perifere mononukleære blodlegemer (PBMC). Bestem APOE genotyping (rs429358 og rs7412) (en mere omfattende genetisk profilering er blevet bestemt i InveCe.Ab deltagere; se tabel 6). Registrer et EKG (hjerteændringer, atrieflimren) og en hviletilstand elektroencefalogram til kvantitativ analyse (QEEG).
  5. Overvej valgfri biomarkørtest, herunder cerebrospinalvæske (CSF) TAU, fosfor-TAU og β-amyloid, og hjernescanning (MR at detektere in vivo degeneration, iskæmi eller betændelse; FDG-PET til at opdage metabolisk svigt; PIB-PET til at opdage hjernen amyloidose relateret til Alzheimers patofysiologi).
  6. Planlæg hjernedonorens efterfølgende check-up program. Konfigurer tidsintervallerne efter forskellige aldersgrupper (op til 64 år: hvert 10. år, 65-74 år: hvert tredje år, fra 75 år og fremefter: hvert andet år).
  7. Tildel en klinisk diagnose og/eller en neurokognitiv diagnose i henhold til DSM-V. Klassificere klinisk demens iscenesættelse med Klinisk Demens Rating (CDR) score. Opdater CDR i den sidste periode før døden.
  8. Forbered en database, der ligner papiret. Indsæt alle indsamlede data i Brain Bank-databasen. Planlæg en revision af en anden degnen for at kontrollere for eventuelle fejl.

3. Dødstidspunktet og fjernelse af hjernen

BEMÆRK: Den italienske lov fastslår, at asystole skal vare længere end 20 min for at bekræfte døden. Registrering af et fladt elektrokardiogram (EKG) i mindst 20 min (navngivet endatografi) gør det muligt at foretage en obduktion inden for 24 timer efter dødsfaldet (DPR 285/90 art. 8 og lov n. 578 Dec 29, 1993). En postmortem tid på <24 h er et godt mål at bevare den samlede vævskvalitet. I tilfælde af et postmortemtid >30 timer annulleres obduktionen (se tabel 2). Obduktionsholdet består af en patolog, en neurolog og/eller en neurobiolog, en sygeplejerske, en anatomisk rumtekniker og eventuelle praktikantstuderende. de første to teammedlemmer udfører også den neuropatologiske diagnose. Under kadaver håndtering og dissektion, brug af passende tøj (pels, handsker, briller og hårnet) er obligatorisk. I dette afsnit beskriver vi de vigtigste værktøjer og udstyr, der normalt anvendes i vores laboratorium. Læserne kan vælge de instrumenter, der skal anvendes efter eget skøn. For en detaljeret beskrivelse af de anvendte materialer, se venligst Tabel over materialer.

  1. Sørg for, at begravelsen agentur valgt af familien bringer kroppen til ABB faciliteter. Udfør den thanatografi, hvor hjerteaktiviteten skal være fraværende. Hvis ja, underskrive en dødsattest og begynde obduktionsprocedurer.
  2. Transporter kadaveret til obduktionsrummet. Mål kraniets omkreds på niveau med den bredeste del af hovedet. Mål fra nasion til inion for at opnå anteroposteriordiameteren (APD), mens afstanden fra det ene øre til det andet giver den tværgående diameter (TD). Beregn cephalic index (CI) ved hjælp af formlen: CI = TD/APD x 100.
  3. Ved hjælp af en skarp skalpel, lave en hovedbund snit på koronal flyet, fra spidsen af mastoid processen på den ene side til den anden, passerer over knudepunktet. Skær gennem hår, hud og subkutane væv og adskille de to folder i hovedbunden omhyggeligt fra undersiden kraniet. Udfør snittet, indtil den gule supraorbital fedt bliver synlig og afspejler hovedbunden anteriorly. Træk den anden del posteriort.
  4. Brug skalpel og scef, tage en lille prøve af den tidsmæssige muskel på hver side, sætte en i 4% formaldehyd og fryse den anden (se afsnit 7).
  5. Skær kraniet ved hjælp af en elektrisk sav efter en V-snit på frontal side. Fjern kalot og skær meninges. Prøvestykker af dura er begge fastgjort i 4% formaldehyd og frosset (se afsnit 7).
  6. Opnå omkring 10 ml CSF ved at indsætte en 20 G 3,5 i. nål gennem corpus callosum for at nå den tredje hjertekammer. Vurder udseendet, farven og turbiditeten af CSF og mål pH.a.'en. Derefter, gøre 10 aliquots på omkring 1 ml hver og gemme dem ved -80 °C.
  7. Løft hjernen forsigtigt trække på begge frontal lapper og skære både synsnerver infundibulum, de interne halspulsårer (ICA) og den tredje, fjerde, femte og sjette kranienerver. Skær tentorium at nå den bageste fossa og skære vertebrale arterier og lavere kranienerver. Indsæt skalpellen så dybt som muligt gennem foramen magnum, at skære den mest caudal del af medulla. På dette tidspunkt, fjerne hele hjernen forsigtigt.
  8. Med skalpellen gennembore knoglen over Meckels hule og få gasseriansk ganglion fra begge sider. Fix en ganglion i 4% formaldehyd og fryse den anden (se afsnit 7). Fraktur den knoklede sella turcica ved hjælp af en kirurgisk hammer og mejsel til at fjerne hypofysen og derefter ordne det i 4% formaldehyd.
  9. Undersøg kraniet og hele hjernen for makroskopiske ændringer og vaskulære ændringer. Med et målebånd, måle hjernen opnå tværgående og anteroposterior diametre. Indvind med omhu cirklen af Willis og vurdere det makroskopisk (Figur 2E) for tilstedeværelsen af anatomiske varianter, læsioner eller kar stenose.
  10. Tag 1-2 stykker leptomeninges af 2-4 cm2 fra konveksiteten og bevare dem i komplet høj glukose Dulbecco modificerede Eagle media (DMEM) kultur medium ved 4 °C indeholder 20% føtal kvæg serum (FBS), 1% pen / strep, 1% glutamin og 1% ikke-essentielle aminosyrer (som tidligere offentliggjort, med nogle ændringer)41.
    1. For at opnå fibroblaster kulturer, placere leptomeninges på en 10 cm petriskål og vask to gange med fosfat buffer saltvand (PBS), hver gang kassere væsken.
    2. Ved hjælp af en skalpel og en pipette spids, skære leptomeninges i små stykker på omkring 2 eller 3 mm, frø 3-4 stykker i hver brønd af en 6-brønd plade tidligere belagt med gelatine på 0,5% og fylde hver brønd med 2 ml komplet medium suppleret med 1% af amphotericin B (gennemføre behandlingen i en biosikkerhed kabinet for at sikre sterilitet af kulturen).
    3. Pladen hældes i en 37 °C, 5% CO2-inkubator i mindst en uge, og der skiftes til et medium hver 3-4 dage. Trypsinize celler med sterile 1x trypsin når brønden er på omkring 70% af sammenløbet. Placer leptomeningeal fibroblaster i en T75 kolbe og fyld den med 12 ml komplet medium. Efter 5 dage trypsinize og bevare dem i 900 μL af FBS og 100 μL dimethylsulfoxid (DMSO).
  11. Adskælg og undersøg cerebrum, lillehjernen og hjernestammen og vægt dem individuelt. Tag pinealkirtlen og ordne det i 4% formaldehyd. Fjern olfaktoriske pærer og synsnerver, og fastgør eller fryse en af hvert par, uafhængigt af siden. Hold cerebrum, lillehjernen og hjernestammen i is ved 4 °C i mindst 2-4 h, indtil den er klar til dissektion for at minimere vævsforstyrrelser og reducere vævs blødhed.
  12. Efter høsten, være passende opmærksom og pleje til kadaver. Sæt knoglen på igen ved hjælp af en superklæbende lim, og sy hovedbunden tilbage ved hjælp af en kirurgisk nål og ikke-absorberbare suturer.
  13. Vis respekt og taknemmelighed til den afdøde person ved at behandle kadaveret forsigtigt. Rens og barbere ansigtet, og vask og tør håret, fordi kadaver vil blive sat i en åben kiste synlig for deres kære.
    BEMÆRK: Genkomposition af kadaveren udføres af en tekniker. Protokollen kan sættes på pause her.

4. ABB dissektion protokol

BEMÆRK: Den samme patolog og/eller neurolog skærer hjernestammen, lillehjernen og cerebrum under en røghætte. En neurobiolog arrangerer skiverne efter trækning. En praktikant, der ikke håndterer hjernesektioner, dokumenterer hele proceduren med fotos, der skal uploades til databasen for at fungere som vejledning i de efterfølgende vævsbehandlingsfaser.

  1. Ved hjælp af en dissekerekniv, skæres hjernestammen aksialt og gøre det første snit på niveau med rostral midbrain, gennem den overlegne colliculus, for at opnå to skiver udsætter substantia nigra (SN).
  2. Gør resten af nedskæringer til at erhverve 8 mm hjernestamme skiver for at opnå omkring 10 sektioner. Vær omhyggelig med at inkludere nedskæringer, der passerer gennem rostralpons nær den overlegne margener af den fjerde ventrikel til at observere locus coeruleus (LC) og gennem medulla oblongata ringere end den akustiske striae lige over ringere toppen af den fjerde ventrikel at have skiver, herunder dorsale motorkerne af vagus (DMNV).
  3. Navngiv alle udsnit i rostrocaudal forstand som BS (hjernestamme) efterfulgt af arabiske tal for at identificere sektionerne. Efter den sidste hjernestamme skal du bruge betegnelsen SC (rygmarv) efterfulgt af tal 1-n. Omkring 2-4 SC skiver opnås afhængigt af antallet af spinal metamere fjernet (Figur 2H-I).
  4. Mærl alle sektioner, der skal fastgøres eller skal fryses skiftevis, og tag et billede til fotoarkivet (Figur 2). Fastgør og frys derefter alle skiver som beskrevet nedenfor (trin 4.7 og 4.8).
  5. Skær lillehjernen på sagittal flyet for at adskille de to cerebellar halvkugler på niveau med vermis. Udfør sagittal sektion for at få 5 skiver fra hver halvkugle (Figur 2F-G).
  6. Navngiv alle udsnit fra vermis som CBR eller CBL (for henholdsvis højre og venstre lillehjerne), og brug arabiske tal til at identificere sektionerne. Mærl alle sektioner, der skal fastgøres eller fryses skiftevis, og tag et billede til arkivet (Figur 2). Derefter fastsætte og fryse alle skiver som beskrevet nedenfor.
  7. Adskære de to halvkugler af cerebrum gennem corpus callosum (Figur 2A-B) og skær dem ental på koronalplanet. Gør det første snit i et fly, der passerer mellem den optiske chiasm og mammillary organer, gennem frontallappen, tidsmæssig pole, forreste cingulate, forreste commissure, kernen i Meynert og basal ganglier.
  8. Udfør det andet snit omkring 1 cm posteriort passerer gennem mammillary organer og udsætter de basale ganglier, forreste thalamus, subthalamus og amygdala. Fortsæt udskæring at dissekere den forreste og bageste regioner til at erhverve 1 cm skiver for at opnå 15 til 20 sektioner for hver halvkugle.
  9. Sæt skiverne på en flad overflade. Læg dem efter deres oprindelige position i anteroposterior retning, fra frontal til occipital pole, med den del kontinuerlig med den foregående skive vender opad.
  10. Ved at sammenligne sektionerne fra begge halvkugler skal du vælge alternative sektioner fra hver halvkugle, der skal bevares som fast eller frosset materiale. Genkende de vigtigste sektioner, der skal fastsættes og behandles for histopatologi, herunder frontale og tidsmæssige lapper, cingulate, basal ganglier, nucleus basalis af Meynert, amygdala, thalamus, hippocampus og entorhinal cortex, occipito-temporal gyrus, parietal og occipital lapper.
  11. Navngiv alle udsnit i anteroposterior-betydning som L (venstre) eller R (til højre) efterfulgt af arabiske tal, og sæt en etiket, der angiver, om udsnittet skal fastgøres eller fryses (Figur 2A-D). Hvis du vil identificere afsnittene, skal du tage et billede til fotoarkivet. Derefter fastgør og frys alle skiver som beskrevet i afsnit 7 og 8.

5. Hjerne- og karinspektion og makroskopisk patologisk vurdering (med det blotte øje)

  1. Foretage en generel makroskopisk undersøgelse overvejer meningeal ændringer, diffus eller lokaliseret kortikal atrofi, hippocampal atrofi, ventrikel udvidelsen, cerebellar atrofi, hjernestammer atrofi, substantia nigra pallor, hvide stof ændringer (angiv type og placering).
  2. Undersøg kredsen af Willis overvejer åreforkalkning og okklusion. Tildel score = 1 i nærvær af atherom uden stenose på mere end 50%, score = 2, hvis mindst én arterie er 50% eller mere okkluderet, score = 3, hvis to eller flere arterier er 50% eller mere okkluderet42. Vurdere tilstedeværelsen eller fraværet af patologi i andre intrakranielle fartøjer.
  3. For at opdage parenkymale vaskulære læsioner, undersøge hjernehalvdel, lillehjernen og hjernestammen. Overvej lakunerlæsioner (diameter < 10 mm), iskæmisk eller hæmoragisk infarkter og blødning (diameter > 10 mm). Hvis den findes, skal du angive størrelse i millimeter, antal og placering. Også overveje tilstedeværelsen eller fraværet af subarafetoid blødning.

6. Kontrol af vævskvalitetskontrol

BEMÆRK: Agonal faktor score (AFS) varierer mellem 0 og 2 og er vigtig i evalueringen af vævskvaliteten. At bestemme AFS, overveje kliniske tilstande, der forekommer omkring dødstidspunktet (især betingelser bestemme hjernens acidose) og varigheden af agonal tilstand (pludselig død eller langvarig smerte). Hvis AFS > 1, hjernevævet måske ikke er af optimal kvalitet43. Også overveje hjernen og CSF pH; hvis pH < 6, hjernevævet måske ikke er af optimal kvalitet43,44.

  1. Kontroller, om døden er forårsaget af tilstande, der kan skade hjernevæv, herunder hypoxi, langvarig acidose, mekanisk ventilation, multi-organsvigt, høj feber, svær kranietraume, indtagelse af neurotoksiske stoffer, svær dehydrering, svær hypoglykæmi, epileptisk tilstand og langvarig koma. Hvis en af disse betingelser er til stede, skal du tildele 1 point.
  2. Kontroller varigheden af agonal tilstand(hurtig, hvis døden indtræffer inden for 1 time, mellemliggende hvis døden indtræffer mellem 1 og 24 timer, langsom, hvis den agonal tilstand varer mere end 1 dag). Hvis en mellemliggende eller en langsom død sker, tildele 1 point.
  3. Beregn AFS-score, og mål CSF-pH-pH-værdien af en elektrodepH-nål og en pH-overflade ved hjælp af en overfladepH-meter på en hjerneskive fra hver lap og på en cerebellarsektion.

7. Vævsfrysning

  1. Hold alt væv, der skal fryses i is ved 4 °C. Derefter fryse dem hurtigt. Placer dem på en prefrozen aluminium bakke. Dæk med en sikringsanlæg aluminiumsplade til at holde dem flade. Læg dem i flydende nitrogen ved -120 °C i 3 min.
  2. Læg skiverne i en plastikpose mærket med deres tilsvarende identifikationskode og skivenummer. Del plastposerne op i tre kryogene kasser (til højre halvkugle, venstre hjernehalvdel og hjernestamme) og opbevares ved -80 °C.

8. Vævsfiksering

  1. Wrap skiverne i gaze én efter én, og læg skiverne i 10% fosfat buffered formalin opløsning. Efter 1 dag, erstatte formalin løsning med en ny løsning. Lad dem i ca 5 dage i et koldt rum ved 4 °C.
  2. Hold alle skiver som en helhed og split kun skiver, der indeholder hippocampus og amygdala i to dele (Figur 3). Den øverste del af begge skiver vil indeholde frontallappen (R10a-L9a i figur 3); de nederste dele vil indeholde henholdsvis: (1) amygdala, tidslap og basal ganglier (L9b i figur 3B) og (2) hippocampus og en del af tindingelappen (R10b i figur 3A). Dette gøres for at opretholde forholdet mellem de forskellige strukturer.
  3. Sæt alle sektioner i fosfat buffer i mindst 2 dage til at vaske ud og fjerne krydsbinding produkter.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

9. Dehydrering, rydning, indlejring af paraffin og forberedelse af rutsjebaner

  1. Forbered stigende koncentrationer af ethylalkohol fra 70% til 100%, xylen og to sæt smeltet paraffin. Placer hjernesektionerne i den automatiske processor til dehydrering, clearingprocedure og paraffinfiltration (brug to forskellige vævsbehandlingsprotokoller til makro (cerebrum- og cerebellum slices) og mikroprøver (hjernestammeskiver og de andre små prøver); Tabel 7). Integrer vævet i paraffin på en metal- eller plastform.
  2. Vælg de afsnit, der skal skæres i, til evaluering af alle de interesseområder, der anvender Montines indeks for neuropatologisk karakterisering45 (tabel 8). Skær derefter de markerede sektioner.
  3. Brug en slædemikrotom til makrosektioner og en roterende mikrotom til små sektioner. Skær 5 μm skiver til Haematoxylin og Eosin (H&E) farvning og 8 μm skiver til de andre farvninger og immunohistokæmi. Sæt skiverne på tre forskellige slags histologiske dias: 8,5 cm x 11 cm for største skiver, 5 cm x 7,5 cm for mellemstore skiver og den klassiske 2,5 cm x 7,5 cm for mindste.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.

10. Deparaffinisering, histologisk farvning og immunhisekemi (IHC)

  1. Udfør deparaffinisering for at muliggøre reaktion med vandige farveopløsninger. Udfør det ved hjælp af xylen og faldende alkoholkoncentration (5 min for hvert trin). Rehydrere i 5 min med destilleret vand.
  2. Brug følgende histologiske pletter til at evaluere arkitektoniske og strukturelle væv abnormiteter, og cellulære morfologi: H & E (for vaskulære mikroskopiske læsioner og inflammation), Cresyl Violet (NISSL; for neuronal tab), Luxol Fast Blue (LFB; for demyelination), Gallyas (for neuritiske plaques og neuropil tråde).
  3. Brug immunhisekemi (IHC) for at fremhæve tilstedeværelsen af specifikke målstrukturer. Anti-NeuN og anti-GFAP bruges til at identificere neuronal og glia rum; 4G8, AT8, α-SYN og TDP-43 anvendes til at identificere proteiner, der samler sig i neurodegenerative sygdomme (Tabel over Materialer).
    1. Forbehandle devoxed sektioner med 3% H2O2 i 10 min derefter skylles i PBS. Udfør behandling ved udtagning med citratbuffer 0,01 M pH 6 (serielt mikrobølgeovn i 2, 1 og 2 min) i 4G8, α-SYN, TDP-43 og NeuN-antigener; 70 % myresyre til 4G8 og α-SYN. Preincubate i 30 min i 5% normal gedeserum.
    2. Inkuber natten over ved 4 °C med det primære antistof. Dagen efter skylles sektionerne i PBS før inkubation med det sekundære antistof (Envision+ System-HRP mærket Polymer) ved en fortynding på 1:2 i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
    3. Vask flere gange i PBS og inkuberes i kromogensystem med diaminobenzidin (Liquid DAB+Substrate Chromogen System), hvor man ser på reaktionsudviklingen under mikroskopet (forstørrelse 4-10x). Endelig vaskes sektionerne i PBS. Kontrastain i sektionerne i haematoxylin, dehydrer og coverslip med DPX montering.
      BEMÆRK: Tabel 8 opsummerer standardprotokollen. Udfør H&E-farvning på alle sektioner, mens der anvendes særlige/specifikke pletter og reaktioner på udvalgte sektioner. Udvalgte tilfælde kræver yderligere områder eller reaktioner. Tabel over materialer viser detaljerne i antistoffer, der anvendes til IHC.

11. Grundlæggende neuropatologisk karakterisering

BEMÆRK: Uspecifikke ændringer af hjernevæv, vaskulær patologi, Alzheimers sygdom (AD) patologi, ikke-AD TAUopathies, synucleinopatier, TAR DNA-bindende Protein (TDP-43) patologi og hippocampal læsioner undersøges. Et optisk mikroskop, der er tilsluttet et kamera, bruges til at detektere parenkymale mikroskopiske læsioner. Den histologiske vurdering udføres af det samme team af uddannet personale i neuropatologi, herunder professor i neurologi, en neurolog og en patolog. Den er baseret på en modificeret Montines fremgangsmåde45 (tabel 8), herunder også: 1) Heterogene ikke-AD TAUopathies, som udgør det patologiske kendetegn ved Fronto-Temporal Lobe Degeneration (FTLD) i forbindelse med TAU-aflejringer: Pick's sygdom, ikke-flydende primær progressiv afasi (TAU-nfPPA), Progressive Supranuclear Parese (PSP)46,47 og Cortico-Basal Degeneration (CBD)48. Desuden omfatter ikke-AD TAUopathies tilstande relateret til aldring og uden nogen klar klinisk betydning såsom primær aldersrelateret TAUopati (DEL)49, Aldersrelateret TAU Astro-Gliopathy (ARTAG)50, argyrophilic kornsygdom48. (2) Lewy Type Synucleinopati (LTS), der er relateret til Parkinsons sygdom (PD) og Lewy Bodies Demens (LBD). For at søge efter LTS skal du anvende følgende hierarkiske trin: i første omgang, olfaktoriske pære, hjernestamme, amygdala/tidsbarken; hvis de tidligere områder er positive, tilføje limbiske strukturer (hippocampal dannelse, entorhinal cortex, forreste cingulate), midterste frontal gyrus, ringere parietal lobule og occipital cortex45. Hvis der findes kliniske træk ved kortikale LBD (dvs. udsving og/eller hallucinationer), skal du overveje limbiske strukturer og isocortex for det første skridt. (3) TDP-43 indskud, den patologiske kendetegnende for FTLD relateret til TDP-43 indskud: adfærdsmæssige variant af Fronto-Temporal Demens (bvFTD), semantisk demens (SD eller svFTD), TDP-nfPPA og FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). IHC for TDP-43 udføres på følgende afsnit: amygdala, hippocampus, entorhinal cortex og midterste frontale gyrus; tilfælde med mistanke om klinisk FTLD, overveje at undersøge andre afsnit51.

  1. Vurder uspecifikke hjernevævsændringer i udvalgte sektioner ved hjælp af H&E, NISSL, LFB og IHC for GFAP og NeuN. Overvej neuronal rarefaction, ballooned neuroner, spongiosis, gliose, myelin tab, tilstedeværelsen eller fraværet af inflammatoriske eller tumoralinspirerede. Angiv den fremherskende placering af disse ændringer.
  2. For at detektere mikroskopiske vaskulære læsionerskal du undersøge H&E- og LFB-objektglas, herunder mindst to halvkugleformede makrosektioner (de første gennem mammillary-karrosserne (Charcot cut) med frontale og tidsmæssige lapper, basal ganglier, forreste thalamus, amygdala, og den anden passerer gennem occipital lap), den "geniculate" del af hippocampal dannelse, en cerebellar sektion, og alle tre vigtigste dele af brainstem (gennem substantia nigra, locus coeruleus og DMNV).
    1. Detekter små karsygdom, herunder arteriolosclerose, lipohyalinose, perivascular space dilatation, white matter loss, leptomeningeal og/eller parenkymal og/eller kapillær cerebral amyloid angiopati. Angiv klassificering (0-3) og den udbredteplacering 42,52. Overvej tilstedeværelsen eller fraværet af hæmosiderin lækage, microbleeds og microinfarcts.
    2. Vurder bidraget af vaskulære skader på kognitiv svækkelse ved hjælp af hierarkisk Deramecourt's ordning (fartøj væg ændringer-lille fartøj sygdom-makroskopiske infarkter). Til denne evaluering overveje en frontal og tidsmæssige lap sektion, basal ganglier og hippocampus (score 0-20)30. Også, anslå sandsynligheden for, at cerebral vaskulær sygdom bidraget til den kognitive svækkelse ved hjælp af VCING score (lav-mellemliggende-høj), opnået ved at overveje halvkugleformet makroskopisk infarkter og små kar sygdom i occipital lap herunder moderat til svær årefariolosklerose og amyloid angiopati53.
  3. Evaluer AD-patologi ved hjælp af IHC (4G8) for amyloidspredning. Definer Thal's etaper (1-5)54, samlede Amyloid scoring (0-3)45, og morfologi pr site (diffus, brændpunkt, cored).
    1. Evaluer AD Tau patologi ved hjælp af IHC (AT8) og beskrive den udbredte morfologi pr. sted (neurofibrillary tangles, neuropil tråde, neuritiske plaques). Definer Braak's fase (I-VI +; positive tegn angiver tilstedeværelsen af yderligere områder af hyperphosphorylated Tau patologi ikke efter Braak hierarki)55 og samlede scoring (0-3)45.
    2. Neuritiske plaques ved hjælp af Gallyas farvning og CERAD score (0-3)56. Derefter definere sandsynligheden for de neuropatologiske funktioner, der svarer til en AD klinisk syndrom ved hjælp af Amyloid-Braak-CERAD score (ABC score 0-3): ingen-lav-mellemliggende-høj45.
  4. Brug AT8 IHC til at lægge mærke til tilstedeværelsen eller fraværet af ikke-AD TAU patologi angiver fremherskende placering og ejendommelige morfologiske billede. Overvej neuronale indeslutninger såsom flammeformet eller globose tangles, sfærisk-kugleformede indeslutninger (dvs. Pick's organer)57, neuropil tråde, dystrofisk neurites, argyrofile korn; og glia indeslutninger såsom tuftede astrocytter, tornede astrocytter, astrocytiske plaques, oprullede organer, kugleformede indeslutninger58,59.
  5. Brug α-syn IHC til at detektere LTS (Lewy organer, blege kroppe og Lewy neurites) på områderne i noten ovenfor. I tilfælde af positivitet, anvende McKeith's klassificering (0-4) til at vurdere sværhedsgraden af læsionerne60; derefter bruge Beach's etaper (I-IV) for topografisk distribution (olfaktoriske pære, hjernestammer fremherskende, limbisk fremherskende, neocortisk)61. Sammenlign Beach's og Braak's faser til at definere forholdet mellem LBD og AD patologi60,61,62.
  6. Overvej tilstedeværelsen eller fraværet af Glial cytoplasmic indeslutninger (GCI; ikke Lewy-type gukleinopati), som er det patologiske kendetegn for Multiple System Atrofi (MSA) og angive deres fremherskende placering63.
  7. Brug TDP-43 IHC til at detektere TDP-43-aflejringer på områderne i noten ovenfor. Identificer den udbredte morfologi pr. sted: Neuronal cytoplasmatiske indeslutninger (NIN'er), distrofiske neurites-indeslutninger (DN'er), nukleare indeslutninger (9'er). Definer mønsteret: A (fremherskende NPI'er og DN'er: bvFTD og nfPPA); B (fremherskende NCI'er: FTD-MND) C (fremherskende lange DNs: svPPA og bvFTD)51,64. Brug Nelsons skema til at definere tilstedeværelsen af TDP-43 iAD-tilfælde 65,66.
  8. Vurder hippocampus startende fra subiculum og Sommer sektor (CA1). Brug Rauramaa score (0-4): 1-2 for microinfarcts og macroinfarcts, henholdsvis; 3–4 svarende til moderat og svær neuronal tab, henholdsvis, og hippocampal atrofi (hippocampal sklerose: HS). På samme måde er tilstedeværelsen eller fraværet af patologiske proteinaflejringer (i faldende hyppighed: pTAU, TDP-43, α-syn)67.
  9. Definer den neuropatologiske diagnose og indtast alle de patologiske data i databasen.
    BEMÆRK: De rum, hvor det biologiske materiale og de fornuftige data for donorerne opbevares, er altid låst, og kun det autoriserede personale får lov til at komme ind for at garantere både sikkerhed og privatliv. Det frosne biologiske materiale opbevares i låste frysere ved -80 °C, mens formalinfaste paraffinindredte væv opbevares i aflåste skabe ved stuetemperatur. Der anvendes to motorfrysere, og der er også en back-up-fryser. For at sikre, at fryserne altid fungerer, får de desuden et 24/7 overvågningssystem, der slår alarm. En nødgenerator er også til stede i tilfælde af strømsvigt. Deltagerne anonymiseres med en numerisk kode for at sikre deres privatliv; Det er ikke muligt for ikke-autoriseret personale at vende tilbage til donorernes identitet og deres fornuftige data. Alle oplysninger indsamles i en database, der er beskyttet med adgangskode. ligeledes opbevares en papirkopi af disse data i låste arkiver.

Representative Results

Hjernedonorer og hjernehøstdata
I 2014 begyndte donorrekruttering under den anden InveCe.Ab opfølgning, der omfattede 1010 ud af 1061 støtteberettigede forsøgspersoner (svarprocent: 93 %; Figur 1). I forhold til InveCe.Ab-undersøgelsen i længderetningen deltog 290 ud af 1010 deltagere (28,7 %) at blive registreret som donorer (160 er allerede registreret og 130, der gav udtryk for, at de havde til hensigt at lade sig registrere). Uddannelsesniveauet er højere i donorer end i ikke-donorer (66% af vores donorer har et mellemhøjt uddannelsesniveau: 8 eller flere år i skolen), hvilket indikerer betydningen af kultur og uddannelse. Mange "sunde" personer viste også interesse i hjernen donation program. De fleste af vores "kontrol" bekende, at de kan sympatisere med de syge og deres pårørende, og ønsker at bidrage en eller anden måde til forskning, der fører til en bedre forståelse af neurologiske sygdomme. Uselviske mennesker, der regelmæssigt engagere sig i blod eller marv donation programmer i løbet af livet er mere åbne over for tanken om hjernedonation, som er mennesker, der allerede har indvilget i at donere organer efter døden. De er klar over, at selv om der ikke ville være en levende modtager, ville deres donation være af stor betydning for forskningen. En anden faktor, der bidrager til hjernedonation er præference for at blive kremeret. I øjeblikket omfatter ABB donorpopulationen i alt 427 personer (290 InveCe.Ab deltagere + 137 frivillige eller patienter fra ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital), hvoraf 75% er 70 år eller ældre. Der er en klar overvægt af kvinder (64%) og mentalt intakte ældre (ca. 85 %). Hidtil har 27 hjerner blevet høstet ud af 40 afdøde donorer (67% obduktion sats); 13 forsøgspersoner er ikke blevet obduceret af forskellige årsager, herunder manglende anmeldelse af dødsfald til ABB, alvorlige skader, der fører til hjernedestruktion, farlige infektionssygdomme og 1 CJD-tilfælde; 4 forsøgspersoner har inddraget deres samtykke. Indtil nu har 24 ud af de 27 høstede hjerner fået en komplet neuropatologisk karakterisering med en klar klinik-patologisk diagnose, mens de resterende 3 hjerner stadig er under undersøgelse (Tabel 3). Yderligere hjernehøstdata fra ABB omfatter: gennemsnitsalder ved dødsfald (81 år); gennemsnitligt postmortem-interval (10,37 timer) gennemsnitlig CSF-pH (6,64) gennemsnitlige vævspH (6,07) gennemsnitlig hjernevægt (1012,86 gr); AFS var 1 ud af 90% af afdøde forsøgspersoner.

Neurofysiologiske biomarkører (QEEG)
QEEG er en del af den flerdimensionelle tilgang. Det er en enkel, ikke-invasiv og billig metode, med et sandsynligt potentiale til at opdage konvertering fra mild Neuro-kognitiv lidelse (mild-NCD eller MCI) til større neuro-kognitiv lidelse (major-NCD eller demens). Gennem vores flerdimensionelle tilgang udføres en almindelig QEEG-undersøgelse, og dens mulige rolle som biomarkør for demens testes. Vores data om en foreløbig serie på 36 hjernedonorer (18 normale ældre (NOLD), 11 mild-NCD og 7 større NCD; 9 hvoraf 9 med en bestemt neuropatologisk diagnose) viser, at den gennemsnitlige alfarytmeprocent var signifikant lavere i større NCD sammenlignet med mild-NCD (p: 0,002) og NOLD (p: 0.033). Omvendt var langsommere EEG-frekvenser (theta/delta) betydeligt højere i større NCD end i NOLD/mild-NCD (se eksempeltilfældene i figur 4). I vores serie kan EEG-rytmefordelingen skelne NOLD/mild-NCD-forsøgspersoner fra større NDC-patienter uanset den ætivologiske diagnose, hvilket tyder på, at hjernerytmer påvirkes af byrden af degenerative læsioner uanset læsionstype. Faktisk, 7 ud af 9 undersøgte hjerner viser demens på grund af blandede patologier. Det særlige ved patologiens art synes at være lav, og hjernens elektriske rytmer synes i højere grad at være påvirket af læsionens byrde og topografi end af deres molekylære karakter (Poloni, et al. proceedings of AD/PD 2019, Lissabon, data ikke offentliggjort).

Symbolske tilfælde
ABB-protokollen kan være nyttig og nødvendig i nogle tilfælde og betingelser. Et eksempel er tilstedeværelsen af en asymmetrisk patologi (Figur 5). Vores protokol er meget velegnet til identifikation og korrekt karakterisering af denne type patologi. Indtil videre har vi undersøgt 4 hjerner med asymmetrisk involvering, hvoraf nogle er vist i figur 5. Makroskopisk, højre side atrofi (Figur 5A) er til stede i et tilfælde med svær ventrikeldilatation i højre koronalsektion ( Figur5C) sammenlignet med venstre side ( Figur5B). Et andet tilfælde viser infarkt af højre halvkugle (Figur 5D) og en anden viser en klar atrofi af højre mammillary krop (Figur 5E). På mikroskopisk niveau, et tilfælde af FTLD viser en asymmetrisk TDP-43 positivitet, der er mere intens i højre frontal side i forhold til venstre (Figur 5F,G).

Makrosektioner (Figur 6A,C) bruges til at få et samlet overblik. LFB farvning hjælper med at identificere myelin tab (Figur 6D) og IHC for både 4G8 og AT8 (Figur 6B) gør det muligt at vurdere fordelingen af immunoraktiviteten på halvkugler med det blotte øje. I ABB-serien kan der sammenlignes hjerner af beslægtede personer.

I figur 7placeres mikroskopiske billeder af sektioner fra homozygot tvillingers hjerner side om side for at få en lettere sammenligning (tvilling 1 (BB137): Figur 7A, C, E,G,I,K versus tvilling 2 (BB138: Figur 7B,D,F,H,J,L). Som i en lignende tidligere undersøgelse68, begge tvillinger blev sammenlignet med kliniske og neuropatologiske vurderinger. Tvillingerne rapporterede den samme diagnose af major-NCD på grund af flere ætiologier, men de døde med to års mellemrum, i en alder af 83 (demens-debut på 72 år) og 85 (demens-debut på 76 år), hhv. Deres hjerner har en meget lignende neuropatologisk billede, med høj AD patologi forbundet med amyloid angiopati. 4G8 immunoraktivitet spredes i hele cortex (Figur 7A,B) og basale ganglier (Figur 7C,D) med diffuse, tætte og kernehus plaques. Det er også tydeligt påvist i både parenkymale og leptomeningeal fartøjer af cortex og lillehjernen (Figur 7A, B, G-J). Ved højere forstørrelse er capCAA tydeligt(figur 7G,H). AT8 immunopositive plaques, tangles og tråde er diffuse i parietal cortices af begge hjerner (Figur 7E, F, L). Med hensyn til amyloid og NFT patologi byrde, twin 1 betragtes som en Thal fase 3 (montine A2) og en Braak fase 5 (montine B3), mens twin 2 betragtes som en Thal fase 5 (montine A3) og en Braak fase 6 (montine B3). De havde de samme års uddannelse og lignende livsstil; men den ene (BB137) var gift og blev enke kort efter, mens den anden var single (BB138). De viste forskellige grader af klinik-patologisk variation med samme begyndelse og samme sygdomsforløb, men i forskellige tidsrammer. Dette bekræfter det faktum, at selv om den genetiske komponent spiller en central rolle i udviklingen af sygdommen, den epigenetiske og miljømæssige komponent er grundlæggende i fastsættelsen af lidt forskellige manifestationer.

I nogle tilfælde svarer det kliniske billede ikke til de neuropatologiske træk. I figur 8 blevto forskellige tilfælde klinisk defineret som ad-tilfælde. neuropatologiske analyser viser ud over en mellemliggende AD-patologi en diffus positivitet for α-syn. I det første tilfælde viser et alvorligt LTS-billede (Beach IV) Lewy-kroppe, der er homogent fundet i gyruscingolien ( figur8A) og i SN som cytoplasmatiske indeslutninger omgivet af neuromelanin (Figur 8B,C). I det andet tilfælde er Lewy-kroppe, der er forbundet med Lewy neuritter, spredt i amygdala (figur 8D,E) og i Meynerts kerne (figur 8F,G), hvilket tyder på en limbisk LTS-diagnose. Faktisk, topografi af læsioner snarere end deres molekylære karakter producerer de kliniske manifestationer.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over Inve.Ce.Ab-undersøgelsen. Ved baseline var den samlede prævalens af demens 3%. I løbet af opfølgningerne var prævalensraten: 4,4 % (1m)69, 7,1 % (2nd),10,9 % (3.)). Den otteårige incidensrate var 15 p/1000/år (95% CI: 13-18 p/1000/år). Donorrekrutteringen blev påbegyndt i 2014 (under den anden opfølgning). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Dissektionsprotokol af cerebrum (A), lillehjernen (F) og hjernestammen (H). Cirkel af Willis og enkelt halvkugler er vist i (E) og (B). Koronale udskæringer af højre (C) og venstre side (D) er nummererede og alternativt faste ("F") og frosne ("C"). Der vises en sagittal cerebellumsektion (G) og hjernestammer (I). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Koronale skiver af fast højre (A) og venstre (B) fronto-tidslappen vises.
Hippocampus og temporal lap (A, R10b) er delt fra frontallappen (A, R10a) på højre skive. På den modsatte skive er amygdala og basale ganglier (B, L9b) opdelt fra frontallappen (B, L9a). Skalabar: 1,7 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Relativ spektral effektfordeling i NOLD- og større NCD-emner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative billeder af asymmetriske patologier. (A) Første tilfælde: hjerne med højre atrofi. Koronale skiver (B) og(C)viser højresidet ventrikeldilatation særlig tydelig i afsnit 10-12 (C, pile). I afsnit (B) og (C) står "F" for fast og "C" for frosset (på italiensk: congelato). DD) Andet tilfælde: alvorlig infarkt på højre halvkugle. (E) Tredje tilfælde: atrofi af højre mammillary krop (pil). (F, G) Fjerde tilfælde: mikroskopiske billeder viser en mere intens TDP-43 immunoraktivitet i den frontale højre cortex (G) i forhold til den venstre (F) i et tilfælde af frontotemporal demens. Skalastænger: 183 μm (F, G). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Makrosektioner. (A, C) Koronale skiver af fast fronto-tidslap (A) og frisk parietal lap (C). B) Histologisk fronto-tidsmæssig sektion immunmærket med AT8 antistof. Immunoraktivitet er klart fordelt over hele cortex, men mere intens i den tidsmæssige lap. d) Histologisk parietal sektion plettet med LFB. Pilen angiver et område med demyelinisering af det hvide stof. Skalabar: 1,55 cm (B, D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Tvillinger. Sammenligning mellem hjerner af to homozygot tvillinger: BB137 (A, C, E, G, I, K) og BB138 (B, D, F, H, J, L). De neuropatologiske billeder er meget ens. (A) og (B) viser diffus 4G8 positivitet i occipital lap med amyloid plaque, leptomeningeal (pile) og parenkymale (pilespidser) fartøjer. Kapillær amyloid angiopati (stjerner) er velkendt ved højere forstørrelser (G) og (H). 4G8 er diffust fordelt over hele de basale ganglier (C, D) og omkring leptomeningeal fartøjer af lillehjernen (I, J: pile). AT8 immunoraktivitet identificere sammenfiltring, tråde og plaques (pile) i parietal cortex (E, F). Gallyas farvning (K) afslører neuritiske plaques som AT8 antistof (L)gør. Skalastænger: 470 μm (A-F; I-J); 90 μm (G-H; K-L). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Klinisk versus neuropatologisk diagnose. I dette tal, to forskellige tilfælde er rapporteret, hvor den neuropatologiske diagnose adskiller sig fra den kliniske diagnose. Immunoraktivitet for α-syn er et uventet resultat. AA–C) Første tilfælde: Gyrus cingoli (A) viser homogen fordeling af Lewy organer i SN (B-pile). I en neuron af SN, en dobbelt Lewy krop omgivet af neuromelanin er vist (C). (D–G) Andet tilfælde: En diffus positivitet for α-syn kan påvises i amygdala (D, E) og Meynert-kernen (F, G). Cellulære organer og Lewy neurites (stjerne) er godt markeret. Skalastænger: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G) 20 μm (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Skabelonen Overførselsaftale. Klik her for at se en større version af dette tal.

N %
Køn Mænd 607 45.9
Kvinder 714 54.1
Fødsel kohorte 1935 236 17.8
1936 219 16.6
1937 264 20.0
1938 305 23.1
1939 297 22.5
Civilstand Gift 872 66.1
Samlevende 13 1.0
Separeret/fraskilt 29 2.2
Enke 325 24.6
Enkelt 80 6.1
Beskæftigelse i det primære liv Arbejdere i blå funktionærer 666 50.6
Funktionærer 459 34.9
Husmor 191 14.5
Års uddannelse ≤5 år 754 57.2
>5 år 565 42.8

Tabel 1: Sociodemografiske træk ved deltagerne i InveCe.Ab-undersøgelsen.

INKLUSIONSKRITERIER UDELUKKELSESKRITERIER
Alle personer på 18 år og derover Folk, der åbenlyst nægter donation
Mennesker, der bor inden for det område af Abbiategrasso Personer, der bor uden for Lombardiet
Frivillige, der giver samtykke på egen hånd Uoverensstemmelser mellem den potentielle donor og NOKs ønsker vedrørende hjernedonation
Emner ude af stand til at beslutte med NOK's tilladelse Situationer, der i høj grad ødelægger sammenhængen i hjernen
Døden af en naturlig årsag Klinisk forløb på <2 år, medmindre muligheden for en prionsygdom er udelukket
Død forårsaget af drab eller selvmord, med behov for en retsmediciner rapport
Post mortem-interval >30 timer

Tabel 2: Kriterier for hjernedonation.

Nr. Køn KODE BB KODE InveCe Alder edu (år) Klinisk diagnose Cdr Afs PM (timer) pH-væv pH spiritus neuropatologisk diagnose
1 F BB 37 87 5 Større NCD på grund af AD (BPSD) 5 2 29 Nd Nd Høj AD patologi, moderat SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
2 F BB 105 94 5 Major-NCD på grund af AD 5 1 5 5.72 6.78 Høj AD patologi, mild SVD, HS
3 F BB 137 83 3 Major-NCD på grund af flere ætiologier (AD-VaD) 5 1 16 Nd Nd Høj AD patologi, moderat SVD, occipital infarkt, CAA-capCAA
4 M BB 181 71 13 Større NCD på grund af AD (BPSD) 5 2 3 Nd Nd Svær LTS (Strand IV), mellemliggende AD patologi, mildSVD, mCAA
5 M BB 115 Jeg 636 78 18 Major-NCD på grund af AD 5 1 6 Nd Nd Mellemliggende AD, moderat SVD, inflammation, ILBD (Beach IIa), HS
6 F BB 23 Jeg 65 79 3 Major-NCD på grund af vaskulær sygdom 5 1 14 Nd Nd Svær og udbredt CAA, mellemliggende AD patologi
7 M BB 102 I 412 79 8 Major-NCD på grund af vaskulær sygdom 3 1 8 Nd Nd Vaskulær demens, ILBD
8 M BB 224 Jeg 16 80 3 Major-NCD på grund af flere ætiologier 5 1 11 Nd 5.99 Moderat SVD, Lav AD patologi, ILBD (Beach IIa), HS
9 F BB 47 78 5 Større NCD til flere ætiologier (LBD-VaD BPSD) 5 0 8 Nd Nd Høj AD patologi, BG TAU patologi, ARTAG, mild SVD, HS
10 F BB 153 I 965 79 5 Mild-NCD (død på grund af tyktarmskræft med udbredt metastase) 0.5 1 8 Nd 6.73 Lav AD patologi, moderat BG-SVD
11 M BB 118 Jeg 1211 79 13 NOLD (død på grund af leverkræft) 0 2 3 Nd 6.51 Moderat SVD
12 M BB 236 Jeg 521 80 3 Større NCD på grund af AD (BPSD) 4 1 15 Nd 6.15 Høj AD-patologi, Svær BG-SVD (flere mikrobleer), HS
13 F BB 138 85 3 Major-NCD på grund af flere ætiologier (AD-VaD BPSD) 4 0 15 Nd 6.75 Høj AD patologi, moderat SVD, CAA, limbisk TDP43
14 M BB 109 Jeg 876 79 8 NOLD (død på grund af hjernetumor - GBL) 0 1 16 Nd 6.4 Lav AD patologi, ILBD (Beach IIa), mild SVD
15 F BB 271 84 8 Større NCD på grund af AD (BPSD) 4 1 2 Nd 6.7 Mellemliggende AD, limbiske LTS, moderat BG-SVD, mCAA, TDP
16 F BB 71 I 1080 79 8 NOLD (død på grund af hjertesvigt) 0 0 6 Nd 6.26 Moderat BG-SVD, ILBD, amy TDP, lav AD
17 F BB 189 kr. Jeg 858 80 5 Større NCD på grund af AD (BPSD) 3 0 20 Nd 6.42 Mellemliggende AD, CAA-capCAA, TDP43, moderat BG-SVD, HS
18 F BB 278 kr. I 924 80 5 Større NCD på grund af LBD (BPSD) 3 1 5 6.02 7.05 Mellemliggende AD, limbiske LTS (Strand IV), limbisk TDP, HS
19 F BB 247 104 8 Major-NCD på grund af flere ætiologier (sandsynligvis blandet patologi) 3 0 6 6.48 7.22 TAU-patologi (PART-ARTAG), HS
20 M BB 85 Jeg 19 83 10 Større NCD på grund af LBD (BPSD) 3 1 9 6.26 7.3 Svær limbisk LTS, mellemliggende AD, Moderat SVD, svær CAA-capCAA, HS
21 F BB 14 I 222 82 8 Major-NCD på grund af flere ætiologier (AD-VaD) 2 1 11 5.59 6.4 Mellemliggende AD-patologi, Moderat SVD
22 F BB 282 76 8 Større Frontotemporal NCD (nfPPA BPSD) 3 1 10 6.07 6.39 TDP (type A), ILBD, moderat SVD, lav AD, HS
23 F BB 154 I 1079 80 5 NOLD (død på grund af kræft med udbredt metastase) 0 1 5 6.49 6.9 moderat SVD, CAA, lav AD, limbisk encephalitis
24 F KR. 65 13 større Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD) 5 1 12 5.73 6.42 TDP (type A)
25 F BB 210 89 8 Større NCD på grund af AD (BPSD) 5 1 15 5.94 6.4 i gang
26 M BB 293 75 18 Større Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD) 5 1 8 6.14 6.83 i gang
27 F KR. I 1370 79 9 NOLD (død på grund af septisk chok) 0 2 14 6.3 7.12 i gang
M/F Mener Mener Mener Mener Mener Mener Mener
0.5 81 7.7 3.2 1.0 10.4 6.1 6.6

Tabel 3: Klinisk/neuropatologisk diagnose af ABB-serien. BB: Brain Bank; edu (år): uddannelsesår; CDR: Klinisk demensklassificering (0 = ingen demens; 0,5 = mild kognitiv svækkelse; 1 = mild demens; 2 = moderat demens; 3 = svær demens; 4 = meget svær demens; 5 = terminal demens); AFS: Agonal Factor-score; PM (timer): Post Mortem timer; nd: ikke gjort; M/F: Hanner/Hunner; BPSD: Adfærdsmæssige og psykologiske symptomer på demens; VaD: Vaskulær demens; NOLD: Normale ældre; GBL: Glioblastoma; nfPPA: ikke flydende primær progressiv afasi; bvFTD: adfærdsmæssig variant af Frontotemporal Demens; SVD: Lille fartøjssygdom; LTS: Lewy Type Synucleinopati; HS: Hippocampal sklerose; CAA: Cerebral Amyloid Angiopati; capCAA: kapillær CAA; mCAA: meningeal CAA; ILBD: Tilfældig Lewy Kropssygdom; BG: Basal Ganglia; ARTAG: Aldersrelateret TAU Astro-Gliopati; DEL: Primær aldersrelateret TAUopati; amy: amigdala.

Domæne Testnavn
Depression Center for Epidemiologiske Studier Depression Scale (CES-D) [2]
Global kognition Mini-mental tilstandsundersøgelse (MMSE) [1]
Verbal og visuel hukommelse Gratis og Cued Selektiv Minde Test [3]
Corsi Test [4]
Tilbagekaldelse af Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) [5]
Opmærksomhed/ psykomotorisk hastighed Trail gør A [6]
Attentional Matrices [4]
Sprogsemantisk hukommelse Semantisk verbal flydende (farver, dyr, frugter, byer) [4]
Udøvende funktioner Trail gør B [6]
Ravnens farvede matricer [7]
Visuospatiale evner Test af urtegning (CDT) [8]
Rey-Osterrieth Complex Figure (ROCF) Kopi [5]

Tabel 4: Neuropsykologisk vurdering af hjernedonorer.

Metabolitter
Komplet blodtælling
Kolesterol HDL og LDL
Triglycerider
Glukose
Glykneret hæmoglobin (HbA1c)
Homocystein
Cobalamin (Vitamin B12)
Folat
Albumin
Urinstof
Kreatinin
Transaminaser (ALT og AST)
Gamma Glutamyl transferase
Skjoldbruskkirtlen-stimulerende hormon (TSH)
D-vitamin (25-hydroxy-vitamin D)
C-reaktivt protein (CRP)
Elektrolytter

Tabel 5: Metabolisk panel for hjernedonorer.

GENNAVN dbSNP
Apolipoprotein E (APOE) rs429358
kr.
Catalase (CAT) rs1001179
Superoxid dismutase 2 (SOD2) kr.
Angiotensinogen (AGT) kr.
Sirtuin 2 (SIRT2) rs10410544
Translocase af ydre mitokondrielle membran 40 (TOMM40) rs2075650
Bridging integrator 1 (BIN1) rs7561528
Catechol-O-methyltransferase (COMT) kr.
Methylenetetrahydrofolat reduktase (MTHFR) rs1801133
rs1801131
Hjerne afledt neurotrofisk faktor (BDNF) rs6265
opløst luftfartsselskab familie 6, medlem 4 (SLC6A4 eller 5HTT) Hydroxytryptamin transporter gen-forbundet polymorfe region (5-HTTLPR)
rs25531

Tabel 6: SNPs analyseret for InveCe.Ab hjernedonorer.

Proces Løsning Varighed
MAKROEKSEMPLER MIKROPRØVER
Fiksering 10% BUFFERED FORMALIN 8 dage ved 4 °C 8 dage ved 4 °C
Vask FOSFATBUFFER 2-15 dage ved stuetemperatur 2-15 dage ved stuetemperatur
Vask H2O VASK 2-3 timer, postevand 2-3 timer, postevand
Dehydrering ETHYLALKOHOL 70% 24 h 8 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 80% 24 h 4 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 90% 60 h (normalt i løbet af weekenden) 4 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 95% 12 h 4 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 95% 12 h 4 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 100% 6 h. 4 timer
Dehydrering ETHYLALKOHOL 100% 6 h. 4 timer
Clearing XYLENE I 12 h 10 h
Clearing XYLENE II 12 h 10 h
Infiltration PARAFFIN I 12 h 11 h
Infiltration PARAFFIN II 12 h 11 h
Integrering PARAFFIN WAX

Tabel 7: ABB-vævsbehandlingsprotokol.

Region &E CRESIL VIOLET LFB GALLYAS 4G8 kr. α-SYN TDP-43 Neun GFAP
Hjernestammen
Medulla-Dorsal Motor Kerne af Vagus X X X
Pons - Locus Coeruleus X X X
Midbrain - Substantia Nigra X X X X
Lillehjernen
Cerebellar cortex og Dentate kerne X X X X
Cerebrum
Midterste frontal gyrus X X X X X X X
Basal Ganglia + kernen i Meynert X X X X X X
Cingulate, forreste X X X X X X X
Amygdala X X X X X X
Thalamus og subthalamic kerne X X
Overlegen og mellemtyrlig gyri X X X X X X X X X
Hippocampus og Entorhinal cortex X X X X X X X X X X
Ringere parietal lobule X X X X X X X
Occipital cortex X X X X X
Olfaktoriske pære X X

Tabel 8: Vurderede regioner, farvning og immunhisemitri.

Discussion

Kritiske trin i protokollen
Vores mål er at opnå, karakterisere og gemme væv af god kvalitet, der kommer fra emner med detaljeret historie stammer fra langsgående observation. For at nå dette mål er det nødvendigt at behandle følgende centrale aspekter. Som beskrevet ovenfor begynder protokollen med rekruttering af donorer, som er det første afgørende skridt. Derefter er det nødvendigt, at donorerne fortsætte opfølgningsprogrammet og opretholde vedhæftning til projektet over tid, indtil den faktiske donation af hjernen. På dødstidspunktet er det nødvendigt, at ABB-personalet straks underrettes for at indkalde obduktionsholdet inden for 24 timer, da det er vigtigt for tilstrækkelig vævskvalitet. Frisk skæring af hjernehalvdel kræver en rolig hånd og en specifik uddannelse. For at undgå cellulære skader forårsaget af langsom frysning og opnå god kvalitet skiver til kryostat og Omics, er det vigtigt, at de er frosset hurtigt. I betragtning af hastigheden af indtrængning af formalin opløsning (1 mm / time), for at bevare væv antigenicitet iblødsætningen tid af den enkelte skive holdes på sit minimum.

Fejlfinding af metoden
For at løse de kritiske trin, der er nævnt ovenfor, tilbyder vi følgende tilgang. Donor rekruttering og overholdelse af opfølgninger: Der er flere faktorer, der hindrer hjernedonation, herunder frygt for at beskadige kroppens figur, renhed og integritet, eller muligheden for at føle smerte efter døden. Nogle endda bange for, at obduktionen kan udføres, mens de stadig er ilive 70,71. Der er også72bekymring over afbrydelsen af begravelsesordninger og den finansielle byrde . Desuden kan et medicinsk personales manglende viden om postmortem-procedurer og den manglende evne til at løse potentielle donorers eller deres NOK's problemer afskrække fra registrering. Alle disse faktorer kan give et lavt niveau af bevidsthed med et lavt antal tilmeldte deltagere og en stor mulighed for donortab over tid. Faktisk bør donor rekrutteringsprogrammet være effektiv til at sprede bevidsthed, indgyde tillid og overbevise folk til at registrere og opretholde en høj grad af opfølgning deltagelse. Det er vores erfaring, at dette sker gennem omhyggelig udvælgelse af potentielle donorer og grundig forklaring af BB's formål. Vi tilbyder uddannelsesaktiviteter og en empatisk tilgang, der imødekommer frygt og behov hos både raske mennesker og dem, der rammes af neurodegenerative sygdomme og deres familier. Vi finder, at potentielle donorer er mere tilbøjelige til at give deres samtykke, når kontaktet personligt. En ansigt-til-ansigt tilgang skaber et forhold baseret på gensidig tillid og respekt, som er afgørende for at opnå en høj procentdel af registrering til hjernedonation og opfølgende vurderinger. Et højtuddannet personale med en stærk sans for etik nærmer sig først den potentielle donor, diskuterer muligheden for at donere hjernen efter døden, forklarer værdien af humant hjernevæv til neurovidenskabelig forskning og tydeliggør enhver tvivl om postmortem-procedurer. Gunstige ord i munden er lige så vigtigt. Efter hjernen høst, passende opmærksomhed og pleje gives til at komponere kadaver. Det er vigtigt at vise respekt og taknemmelighed over for den afdøde person ved at behandle kadaveren forsigtigt. Et par måneder efter, et møde er planlagt til at kommunikere resultaterne af den neuropatologiske analyse, når anmodet af familiemedlemmer.

Døds- og hjernehøsttid: Når personen accepterer, bliver de donor og får et id-kort med et nummer, der kan kontaktes 24 timer i døgnet, 7 dage om ugen (modtagelsesnummeret på ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital, som er forbundet med os). Desuden gives en selvklæbende mærke til de pårørende, der skal anvendes i tilfælde af hospitalsindlæggelse. Begravelsen agenturer i området blev tidligere informeret til at bringe liget til ABB faciliteter, hvor obduktionen holdet er indkaldt. Obduktionsholdet består af en patolog, en neurolog og/eller en neurolog og en anatomisk rumtekniker, som er på vagt fra 06:00 til 11:00 hver dag; nogle praktikantstuderende er også ofte til stede for at hjælpe og tage billeder.

Præcisionen og konsistensen af de friske skæreprocedurer sikres ved inddragelse af de samme to operatører (en neurolog og en patolog), som har udviklet metoden og har flere års erfaring med neuropatologi. Når frysning skiverne, er de sat på en prefrozen aluminium bakke og dækket med en sikringsanlæg aluminiumsplade for at holde dem godt fladt. Umiddelbart efter sættes de i flydende nitrogen i 3 minutter, før de opbevares ved -80 °C. De skiver, der skal fastsættes, er individuelt pakket ind i gaze, og dyppet i en 10% fosfat buffered formalin opløsning, som erstattes efter en dag. Derefter holdes de i formali højst 5 ekstra dage; i betragtning af, at formalinopløsningen trænger ind ved 1 mm/dag, vil vi dog gerne forkorte iblødsætningstiden yderligere.

Begrænsninger af metoden
Den forskningsmetode, der er beskrevet her, dækker kun et begrænset geografisk område, og de personer, der er involveret i donationsprogrammet, har karakteristika, der ikke helt repræsenterer den almindelige befolkning. Selv om mere end acceptabelt, en postmortem interval op til 24 timer kan producere ændringer i nogle proteinstrukturer, enzymer og RNA af hjernevæv. Bestemmelsen af AFS og pH er muligvis ikke helt tilstrækkelig til at bestemmevævskvalitet 73, og vi udvikler andre måder at autentificere vævskvaliteten på baseret på RNA's integritet.

Med hensyn til mikrotomskæringsproceduren, selv om det er meget nyttigt til rekonstruere anatomiske relationer, skal det bemærkes, at brugen af makrosektioner ikke er enkel og giver nogle tekniske vanskeligheder. Vores metode er udfordrende og tidskrævende. Omkostningerne er ret høje, og finansieringen er ikke altid let. Finansieringen kommer primært fra offentlige (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) og private ressourcer (Golgi-Cenci Foundation), private donationer, non-profit organisationer (f.eks."Federazione Alzheimer Italia") og giver deltagelse.

ABB-metodens betydning for eksisterende/alternative metoder
I begyndelsen, vores hjernedonation program målrettet personer, der deltager i InveCe.Ab langsgående undersøgelse. Som følge heraf ledsages de donerede hjerner af detaljerede kliniske, biologiske og sociale oplysninger, der er indsamlet gennem årene. ABB's styrke stammer netop fra denne karakteristiske oprindelse. Faktisk, studere en gruppe af socialt og genetisk relaterede mennesker, der deler biologiske karakteristika og miljømæssige eksponeringer øger statistisk analyse. Desuden omfatter undersøgelsen følgende fordele: 1) At tage sig af og sørge for samfundets behov (den handling at "give før du spørger"): folk modtager en gratis periodisk kontrol, som den praktiserende læge er informeret om, et telefonnummer på vores sekretær er fastsat for konsultationer, og alvorligt handicappede mennesker besøges i hjemmet; 2) Inddragelse af deltagere, personer med offentlige roller og alment praktiserende læger i uddannelsesaktiviteter gennem afholdelse af regelmæssige seminarer (relateret til hjernesundhed, hjernedonation og generel sundhed) og planlægning af tematiske kurser (f.eks. anvendelse af informationsteknologisk udstyr til ældre); 3) Møde mennesker og vedtage en ansigt-til-ansigt tilgang. Alle disse elementer udgør ABB-projektets styrke. Desuden forbedrer projektet de involverede medicinske medarbejderes kliniske evner, da de får erfaring med både antemortem-vurderinger og postmortem-neuropatologiske evalueringer. I den forbindelse vil vi gerne nævne den meget ejendommelige oplevelse af "Minoritets aldrende forskningsundersøgelse". Denne undersøgelse omfattede et begrænset og udvalgt antal afroamerikanere, der bor i Chicago-området (784 ud af 1.357 støtteberettigede forsøgspersoner: svarprocent på 57 %). Deltagerne blev besøgt årligt hjemme og blev bedt om at deltage i hjernen donation program. Denne undersøgelse er baseret på en usædvanlig tilgang med nogle ligheder med vores opnå høje procentdele af positiv respons på hjernen donation program (352 donorer ud af 784 deltagere var tilmeldt: 44%), selv om obduktionen var ikke helt tilfredsstillende (53%)74. Ligesom i "The Minority aging research study", tilbyder vi uddannelsesmæssige aktiviteter og en empatisk tilgang, der opnår fremragende resultater. Især er vores svarprocent 93%, tilmeldingsprocenten er 28,7%, og obduktionsprocenten i øjeblikket er 67%. Disse satser viser, at projekter, der direkte engagerer folk, har en større procentdel af donationer. Andre hjernedonation programmer, med mindre opmærksomhed i opbygningen af et forhold til potentielle donorer, generelt har en lav tilmelding procent, er omkring 10-15%eller mindre 73,75.

Der er få tidligere kohorte undersøgelser slutter med en neuropatologisk analyse. Desuden er de fleste af hjernen banker og depoter er sygdom-centreret, og der er en mangel på "kontrol" hjerner fra raske donorer i forhold til antallet af "syge" hjerner. Kun et begrænset antal BBs er baseret på befolkningsundersøgelser, der involverer både syge og normale forsøgspersoner med henblik på at studerealdrende forløb 73,74,76 , 77,,78,79,80.77 Nogle undersøgelser såsom "The Minority aging research study" i USA74 og "The Vantaa 85+ study" i Finland76 ligner vores, men de har tendens til at løbe tør med afslutningen af kohorten. I stedet er ABB's donation program forestillet sig at fortsætte i lang tid i fremtiden, hverve potentielle donorer og planlægning opfølgninger selv efter afslutningen af InveCe.Ab langsgående undersøgelse. Denne fremgangsmåde gør vores rekrutteringsmetode svarer til "Sun Health Research Institute (SHRI) hjernedonation program", som er rettet mod en pensionering samfund73. SHRI-protokollen for hjernedonation er meget effektiv med det korteste middeltidsinterval i verden (3,92 timer). I lighed med de største BBs i verden, SHRI protokollen simpelthen skære cerebrum, cerebellum og hjernestammen i midterlinjen (sagittal plan), så den ene halvdel er dissekeret frisk og frosset til biokemiske undersøgelser, mens den anden er fastsat i formalin for histopatologisk vurdering. Men en af styrkerne ved SHRI dissektion protokol er fiksering af de enkelte skiver i stedet for hele halvkugle. Faktisk er fiksering af en halvkugle som helhed ikke optimal, på grund af de forskellige fikseringsgradienter mellem overfladen og kernen. Desuden kan de kortikale proteiner blive påvirket af langvarig eksponering for formalinopløsningen. Således grunden til, at vi besluttede at fastsætte individuelle skiver.

Beslutningen om, hvilken side der er fastgjort eller frosset, afhænger af entalsbanken (altid den samme , tilfældigt tildelte eller tildelte, afhængigt af om dissektionsdagen er ulige eller lige)31,32,33,34,35. Så, biokemiske og histopatologiske analyse udføres separat på hver halvkugle. Da mange neurologiske sygdomme er asymmetriske, tilbyder vores BB en unik protokol til udskæring af friske prøver: alternative sektioner fra hjernestammen og fra hver halvkugle af lillehjernen og cerebrum bevares som fast eller frosset materiale; en fast skive på den ene halvkugle svarer til en frossen på den anden halvkugle. Vores metode giver mulighed for at opnå en komplet histologisk karakterisering af alt frosset materiale og til at sammenligne resultaterne fra alle områder af begge sider. Som sagt i indledningen, den beskrevne metode giver os mulighed for at få så mange oplysninger som muligt fra hjernevæv. Desuden giver ABB's metode en grundlæggende, men komplet neuropatologisk karakterisering, herunder næsten alle kendte hjerneproteinopatier og vaskulær patologi. På grund af den kontroversielle rolle vaskulære skader i fastsættelsen af kognitiv svækkelse, besluttede vi at bruge en dobbelt scoring for denvaskulære byrde 30,,53.

Som forklaret i protokollen anvender vi en tværfaglig tilgang. Selv om dette er en tidskrævende og bearbejdede metode, mener vi, at det giver flere fordele for forskning. For eksempel, i et tidligere arbejde, viste vi, at høj tHcy i sig selv, eller MTHFR C677T TT forbundet med APOE-ε4 allel, kan være relateret til udøvende dysfunktioner snarere end hukommelsestab81. Derfor kan det være interessant at evaluere emner med denne særlige genetiske profil på et neuropatologisk niveau. Dette er et eksempel på, hvordan en sådan dybdegående opfølgning er nyttig til at skabe nye forskningshypoteser verificerbare gennem undersøgelse af biologisk materiale indsamlet i vores bank. En anden demonstration af fordelen ved vores tilgang er inddragelsen af QEEG blandt de vurderinger, vi rutinemæssigt udfører, for dens originalitet og den relative brugervenlighed. Faktisk, EEG registrerer den synaptiske aktivitet af hjernebarken ved at registrere de elektriske potentialer af dendritter, der tilhører kortikale pyramideformede neuroner82. QEEG kan betragtes som en biomarkør til estimering af kortikale synaptisk aktivitet , som er relateret til kognition83. Især har et fald i alfarytmer i den bageste del af hjernen med en generel stigning i lavere frekvenser (theta og delta rytmer) været relateret til kortikal forbindelse opdeling. Det bør overvejes, at de fleste diagnostiske korrelationsundersøgelser har været baseret på en kliniskdiagnose,der kun er en sandsynlig og ikke en bestemtdiagnose 84,85,86,87. Kun meget få målrettede undersøgelser har sammenlignet QEEG-data med det neuropatologiske billede for at undersøge sammenhængen mellem QEEG- og LTS-varianterne88,89og sondringen mellem FTLD og AD83. Ved at afslutte vores undersøgelse med en definition af den neuropatologiske diagnose, er det derefter muligt at fortolke observationerne på den cerebrale elektriske aktivitet korrekt. Desuden udfører seriel QEEG i hvert emne kan vi spore intra-individuelle EEG bølger bane og deres korrelationer med det neuropatologiske billede. Efter individuelle ændringer af kortikale elektriske aktivitet over tid kan føre til en bedre forståelse af dens betydning som en biomarkør for begyndende demens.

Fremtidige anvendelser og retning af metoden
Implementering af vævsfordelingen er et af vores vigtigste fremtidige mål. For at gøre dette, har vi netop etableret en videnskabelig kommission, herunder direktøren for GC Foundation (geriatrician), en akademisk af neurologi fra University of Pavia, en neurolog og en patolog både fra GC Foundation & geriatric Hospital ASP Golgi-Redaelli. Når du distribuerer hjernevæv, histologiske dias og andre biologiske prøver, er det vigtigt at huske, at donorer enige om at donation af hensyn til forskning. Distributionen af materiale bør derfor ske med forsigtighed, ligesom beskrevet i BNE's adfærdskodeks40. Enhver part, der indgiver en begæring om materiale, skal angive typen og mængden af den nødvendige stikprøve, give en beskrivelse af forskningsprojektet, og hvordan prøverne vil blive anvendt, og så vidt muligt fremlægge dokumentation for tidligere publikationer (for overførselsaftalen, se figur 9). Hjernen banken virker ikke for økonomisk vinding. Så de gebyrer, der betales af forskerne bør kun dække udgifterne til væv udtagning, forarbejdning, opbevaring og distribution.

Planer om at begynde at analysere sager med exome sekventering og Omics teknikker, såsom proteomics og transskriptionomics, er i bevægelse. Vores alternative prøveudtagningsmetode vil gøre det muligt at udføre omics-undersøgelser på histologisk veldefinerede væv fra begge halvkugler. Gennem denne tilgang vil det være muligt at sammenligne mønstret for genaktivering i forskellige hjerneområder på samme halvkugle og i de tilsvarende områder af den anden halvkugle og være i stand til at korrelere genaktivering med histopatologi. På dette område vil deep learning applikationer være af stor interesse, herunder edb-analyse af histologiske dias og banebrydende korrelation af kliniske, histologiske og omics data. Andre korrelationer mellem mange forskellige variabler kan identificeres samt andre mulige teknologiske anvendelser. Tilgængeligheden af frosset materiale fra begge halvkugler vil give mulighed for en nøjagtig topografi af genaktivering og proteindistribution. Dette vil være af særlig interesse, selv i raske forsøgspersoner, i betragtning af at både hjernefunktioner og nogle sygdomme er asymmetriske.

Desuden kan vi få cellekulturer fra vel karakteriserede hjernedonorer. Faktisk cellekulturer fra leptomeninges af høstede hjerner levere levende celler, der kan bruges til yderligere undersøgelse af sygdom eller aldringsmekanismer, ved hjælp af den inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) teknologi, som indebærer omprogrammering leptomeningeal fibroblaster og differentiere dem i neurale celler i avancerede modeller90.

Som hjerner alder, forskellige profiler af forandring kan forekomme på det molekylære, cellulære og væv niveau. Hver hjerne er unik. Hver har sin egen måde at reagere på interne og eksterne stressfaktorer; nogle modstår, mens andre bukke under og vise forskellige patologier. Uoverensstemmelser mellem den kliniske præsentation og det neuropatologiske billede eksisterer ofte, fordi læsionens topografi snarere end deres molekylære karakter bestemmer den kliniske præsentation. Den korrekte og konkrete diagnose kan kun opnås ved at kombinere det kliniske syndrom med de neuropatologiske fund, som ofte tilføjer vigtige æologiske spor, der er nødvendige for at optrævle sygdomssogenese. I Europa gøres der en indsats for at skabe en standardtilgang til neuropatologisk diagnose. Vores diagnostiske protokol følger næsten helt de nyligt offentliggjorte retningslinjer for neuropatologisk diagnose for hjernebank91. Dette vil give os mulighed for at indsamle og dele veldokumenterede hjernevæv, med det fremadrettede mål at etablere den første italienske Brain Bank. Faktisk er der i Italien hjernelagre, men ikke hjernebanker baseret på kohorteundersøgelser. Vores mål er at udvikle en metode til hjernevævshøstning, der kan gennemføres bredt i hele Italien, for at etablere et netværk, der bruger en fælles protokol og deler sammenligneligt materiale. For at gøre dette, inddragelse af andre forskningscentre og oprettelsen af en bestemt hjemmeside er blandt de vigtigste mål for fremtiden.

Innovative teknologier anvendes konstant til analyse af neurodegenerative sygdommes molekylære karakter og til identifikation af biomarkører. I denne sammenhæng vil der være et stigende behov for hjerner ledsaget af oplysninger om kognitive og aldrende baner opnået gennem langsgående undersøgelser, understreger betydningen af en neuropatologisk verificeret epidemiologisk tilgang92.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker at dedikere dette arbejde til Dr.ssa Michela Mangieri. Før hun døde for tidligt, hun undfanget og startede Abbiategrasso Brain Bank Project.

Vi er taknemmelige for vores hjernedonorer, som generøst bidrager til forskning, der donerer det ædleste organ i deres krop; uden dem ville denne forskning ikke være mulig.

Vi er Valeria Marzagalli taknemmelige for hendes dyrebare arbejde i ABB-projektet.

Forfatterne takker prof. Johannes Attems, Dr. Paolo Fociani og Dr. Giorgio Giaccone for deres dyrebare vejledning og kloge råd.

Vi vil gerne takke Dr.ssa Alice Cirrincione og Miss Giulia Bortone for deres dyrebare hjælp gennem hele projektet.
Mange tak til Fru Tere Cassani for hendes støtte og til "Federazione Alzheimer Italia" for sit samarbejde.
Forfatterne er taknemmelige for Dr. Matteo Moretti og prof. Antonio Marco Maria Osculati, Institut for Folkesundhed, Eksperimentel og Retsmedicin, University of Pavia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm BD 405253
Anti-GFAP Dako Z0334 policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60) Chemicon MAB377 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8) ThermoScientific MN1020 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) CosmoBio TIP-PTD-P02 policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51) Novocastra NCL-L-ASYN monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8) BioLegend 800703 monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board BD 352070
DMEM High Glucose Carlo Erba FA30WL0101500 medium
Electrical saw with 5d blade CEA 06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm CEA 70064.250 HHH
Electrode pH needle Fisher Scientific 11796338
EnVision+System-HRP Dako K4001 secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP Dako K4003 secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether SMI 8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm Fisher Scientific 11749798
Fetal Bovine Serum Carlo Erba FA30WS1810500 medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical Uvex 500XG
Gloves CEA 01.28.14
Glue Arcobaleno 2624000800002
Head supporter Lacor 60456
L-Glutamine (100X) Carlo Erba FA30WX0550100 medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape CEABIS CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide UHU Bostik 8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140050 medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X) Carlo Erba FA30WL0022100 medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm CEA 03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin Olcelli Farmaceutica A930857255
Surgical mallet and surgical cisel CEA 79.68.88
Surgical scissor CEA 27.08.45/79.68.64
Feather M130RC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. The Global Dementia Observatory Reference Guide World Health Organization. , at http://apps.who.int/bookorders (2018).
  2. Kasper, B. S., et al. Neuropathology of epilepsy and psychosis: the contributions of J.A.N. Corsellis. Brain: a journal of neurology. 133, Pt 12 3795-3805 (2010).
  3. Overy, C., Tansey, E. M. The development of brain banks in the UK. c.1970-c.2010. , Available from: www.histmodbiomed.org (2013).
  4. Tourtellotte, W. W., Itabashi, H. H., Rosario, I., Berman, K. The National Neurological Research Bank. A collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists. Annals of the New York Academy of Sciences. 436, 513-516 (1984).
  5. Tourtellotte, W. W., Rosario, I. P., Conrad, A., Syndulko, K. Human neuro-specimen banking 1961-1992. The National Neurological Research Specimen Bank (a donor program of pre- and post-mortem tissues and cerebrospinal fluid/blood; and a collection of cryopreserved human neurological specimens for neuroscientists). Journal of neural transmission. 39, Supplementum 5-15 (1993).
  6. Carlos, A. F., Poloni, T. E., Medici, V., Chikhladze, M., Guaita, A., Ceroni, M. From brain collections to modern brain banks: A historical perspective. Alzheimer's & dementia. 5, New York, N.Y. 52-60 (2019).
  7. Szymański, P., Markowicz, M., Janik, A., Ciesielski, M., Mikiciuk-Olasik, E. Neuroimaging diagnosis in neurodegenerative diseases. Nuclear medicine review. Central & Eastern Europe. 13 (1), 23-31 (2010).
  8. Nowak, D., Hofmann, W. K., Koeffler, H. P. Genome-Wide Mapping Of Copy Number Variations using SNP Arrays. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 36 (4), 246-251 (2009).
  9. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS computational biology. 8 (12), 1002822 (2012).
  10. Dirks, R. A. M., Stunnenberg, H. G., Marks, H. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical epigenetics. 8 (1), 122 (2016).
  11. Felsenfeld, G. A Brief History of Epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 018200 (2014).
  12. Cogswell, J. P., et al. Identification of miRNA Changes in Alzheimer's Disease Brain and CSF Yields Putative Biomarkers and Insights into Disease Pathways. Journal of Alzheimer's Disease. 14 (1), 27-41 (2008).
  13. Lau, P., et al. Alteration of the microRNA network during the progression of Alzheimer's disease. EMBO molecular medicine. 5 (10), 1613-1634 (2013).
  14. Lowe, R., Shirley, N., Bleackley, M., Dolan, S., Shafee, T. Transcriptomics technologies. PLoS computational biology. 13 (5), 1005457 (2017).
  15. Simpson, J. E., et al. Microarray analysis of the astrocyte transcriptome in the aging brain: relationship to Alzheimer’s pathology and APOE genotype. Neurobiology of aging. 32 (10), 1795-1807 (2011).
  16. Shevchenko, G., Konzer, A., Musunuri, S., Bergquist, J. Neuroproteomics tools in clinical practice. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 705-717 (2015).
  17. Patterson, S. D. Proteomics: evolution of the technology. BioTechniques. 35 (3), 440-444 (2003).
  18. Paraizo Leite, R. E., Tenenholz Grinberg, L. Closing the gap between brain banks and proteomics to advance the study of neurodegenerative diseases. Proteomics. Clinical applications. 9 (9-10), 832-837 (2015).
  19. Giacomelli, C., Daniele, S., Martini, C. Potential biomarkers and novel pharmacological targets in protein aggregation-related neurodegenerative diseases. Biochemical Pharmacology. 131, 1-15 (2017).
  20. Faghihi, M. A., Mottagui-Tabar, S., Wahlestedt, C. Genetics of neurological disorders. Expert review of molecular diagnostics. 4 (3), 317-332 (2004).
  21. Toft, M. Advances in genetic diagnosis of neurological disorders. Acta Neurologica Scandinavica. 129, 20-25 (2014).
  22. Kumar, D., Weatherall, D. J. Genomics and clinical medicine. , 651 (2008).
  23. Han, G., Sun, J., Wang, J., Bai, Z., Song, F., Lei, H. Genomics in Neurological Disorders. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 12 (4), 156-163 (2014).
  24. Gere, C. A Brief History of Brain Archiving. Journal of the History of the Neurosciences. 12 (4), 396-410 (2003).
  25. Fratiglioni, L., Paillard-Borg, S., Winblad, B. An active and socially integrated lifestyle in late life might protect against dementia. Lancet neurology. 3 (6), 343-353 (2004).
  26. Spartano, N. L., et al. Association of Accelerometer-Measured Light-Intensity Physical Activity With Brain Volume. JAMA Network Open. 2 (4), 192745 (2019).
  27. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta neuropathologica. 115 (5), 497-507 (2008).
  28. Ravid, R., Park, Y. mok Brain banking in the twenty-first century: creative solutions and ongoing challenges. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine. 2, 17 (2014).
  29. Iacono, D., Geraci-Erck, M., Peng, H., Bouffard, J. P. Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), (2016).
  30. Deramecourt, V., et al. Staging and natural history of cerebrovascular pathology in dementia. Neurology. 78 (14), 1043-1050 (2012).
  31. Netherlands Brain Bank Information for tissue applicants. , Available from: https://www.brainbank.nl/media/uploads/file/Information for tissue applicants_2019.pdf (2019).
  32. UK Brain Bank Network Process used by the banks for tissue processing and storage. The UK Brain Bank Network protocol. , Available from: https://mrc.ukri.org/documents/pdf/process-used-by-the-banks-for-tissue-processing-and-storage/ (2019).
  33. Vonsattel, J. P. G., Del Amaya, M. P., Keller, C. E. Twenty-first century brain banking. Processing brains for research: the Columbia University methods. Acta neuropathologica. 115 (5), 509-532 (2008).
  34. A Tour Of The Brain Bank. Brain Bank. , Available from: https://hbtrc.mclean.harvard.edu/pdf/about/HBTRC-Tour-2013.2.pdf (2019).
  35. Sheedy, D., et al. An Australian Brain Bank: a critical investment with a high return! Cell and tissue banking. 9 (3), 205-216 (2008).
  36. Guaita, A., et al. Brain aging and dementia during the transition from late adulthood to old age: design and methodology of the "Invece.Ab" population-based study. BMC Geriatr. 13, 98 (2013).
  37. Lobo, A., et al. Prevalence of dementia and major subtypes in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 4-9 (2000).
  38. Hofman, A., et al. The prevalence of dementia in Europe: a collaborative study of 1980-1990 findings. Eurodem Prevalence Research Group. Int J Epidemiol. 20 (3), 736-748 (1991).
  39. BrainNet Europe - Code of Conduct. , Available from: https://www.brainnet-europe.org/indexe151.html?_option=com_content_view=article_id=89_Itemid=89 (2008).
  40. Klioueva, N. M., Rademaker, M. C., Huitinga, I. Design of a European code of conduct for brain banking. Handbook of Clinical Neurology. 150, Elsevier B.V. (2018).
  41. Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. Journal of visualized experiments: JoVE. (119), (2017).
  42. Esiri, M. M., Wilcock, G. K., Morris, J. H. Neuropathological assessment of the lesions of significance in vascular dementia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 63 (6), 749-753 (1997).
  43. Tomita, H., et al. Effect of agonal and postmortem factors on gene expression profile: quality control in microarray analyses of postmortem human brain. Biological psychiatry. 55 (4), 346-352 (2004).
  44. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: what quality markers matter. Brain research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  45. Montine, T. J., et al. National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease: a practical approach. Acta Neuropathologica. 123 (1), 1-11 (2012).
  46. Boxer, A. L., Yu, J. T., Golbe, L. I., Litvan, I., Lang, A. E., Höglinger, G. U. Advances in progressive supranuclear palsy: new diagnostic criteria, biomarkers, and therapeutic approaches. The Lancet Neurology. 16 (7), 552-563 (2017).
  47. Dickson, D. W., Ahmed, Z., Algom, A. A., Tsuboi, Y., Josephs, K. A. Neuropathology of variants of progressive supranuclear palsy. Current opinion in neurology. 23 (4), 394-400 (2010).
  48. Dickson, D. Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders. , Wiley-Blackwell. (2011).
  49. Crary, J. F., et al. Primary age-related tauopathy (PART): a common pathology associated with human aging. Acta neuropathologica. 128 (6), 755-766 (2014).
  50. Kovacs, G. G., et al. Aging-related tau astrogliopathy (ARTAG): harmonized evaluation strategy. Acta neuropathologica. 131 (1), 87-102 (2016).
  51. Alafuzoff, I., et al. Neuropathological assessments of the pathology in frontotemporal lobar degeneration with TDP43-positive inclusions: an inter-laboratory study by the BrainNet Europe consortium. Journal of neural transmission. 122 (7), Vienna, Austria. 957-972 (2015).
  52. Love, S., et al. Development, appraisal, validation and implementation of a consensus protocol for the assessment of cerebral amyloid angiopathy in post-mortem brain tissue. American journal of neurodegenerative disease. 3 (1), 19-32 (2014).
  53. Skrobot, O. A., et al. Vascular cognitive impairment neuropathology guidelines (VCING): the contribution of cerebrovascular pathology to cognitive impairment. Brain. 139 (11), 2957-2969 (2016).
  54. Thal, D. R., Rüb, U., Orantes, M., Braak, H. Phases of A beta-deposition in the human brain and its relevance for the development of AD. Neurology. 58 (12), 1791-1800 (2002).
  55. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112 (4), 389-404 (2006).
  56. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD): Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-479 (1991).
  57. Finger, E. C. Frontotemporal Dementias. CONTINUUM: Lifelong Learning in Neurology. 22, 2, Dementia 464-489 (2016).
  58. Kovacs, G. G. Neuropathology of Neurodegenerative Diseases. , Cambridge University Press. Cambridge. (2014).
  59. Kovacs, G. G., et al. Neuropathology of the hippocampus in FTLD-Tau with Pick bodies: a study of the BrainNet Europe Consortium. Neuropathology and applied neurobiology. 39 (2), 166-178 (2013).
  60. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB Consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  61. Beach, T. G., et al. Unified staging system for Lewy body disorders: correlation with nigrostriatal degeneration, cognitive impairment and motor dysfunction. Acta neuropathologica. 117 (6), 613-634 (2009).
  62. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies. Neurology. 89 (1), 88-100 (2017).
  63. Trojanowski, J. Q., Revesz, T. Neuropathology Working Group on MSA Proposed neuropathological criteria for the post mortem diagnosis of multiple system atrophy. Neuropathology and applied neurobiology. 33 (6), 615-620 (2007).
  64. Mackenzie, I. R. A., et al. A harmonized classification system for FTLD-TDP pathology. Acta neuropathologica. 122 (1), 111-113 (2011).
  65. Nelson, P. T., et al. Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy (LATE): consensus working group report. Brain. 142 (6), 1503-1527 (2019).
  66. Josephs, K. A., et al. Staging TDP-43 pathology in Alzheimer's disease. Acta neuropathologica. 127 (3), 441-450 (2014).
  67. Rauramaa, T., et al. Consensus recommendations on pathologic changes in the hippocampus: a postmortem multicenter inter-rater study. Journal of neuropathology and experimental neurology. 72 (6), 452-461 (2013).
  68. Iacono, D., et al. Same Ages, Same Genes: Same Brains, Same Pathologies?: Dementia Timings, Co-Occurring Brain Pathologies, ApoE Genotypes in Identical and Fraternal Age-matched Twins at Autopsy. Alzheimer Disease & Associated Disorders. 30 (2), 178-182 (2016).
  69. Guaita, A., et al. Influence of socio-demographic features and apolipoprotein E epsilon 4 expression on the prevalence of dementia and cognitive impairment in a population of 70-74-year olds: The InveCe.Ab study. Archives of Gerontology and Geriatrics. 60 (2), 334-343 (2015).
  70. Stevens, M. Factors influencing decisions about donation of the brain for research purposes. Age and ageing. 27 (5), 623-629 (1998).
  71. Le Bouc, R., et al. Limiting Factors of Brain Donation in Neurodegenerative Diseases: The Example of French Memory Clinics. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 49 (4), 1075-1083 (2016).
  72. Samarasekera, N., et al. Brain banking for neurological disorders. The Lancet. Neurology. 12 (11), 1096-1105 (2013).
  73. Beach, T. G., et al. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: description and experience, 1987-2007. Cell and tissue banking. 9 (3), 229-245 (2008).
  74. Barnes, L. L., Shah, R. C., Aggarwal, N. T., Bennett, D. A., Schneider, J. A. The Minority Aging Research Study: ongoing efforts to obtain brain donation in African Americans without dementia. Current Alzheimer research. 9 (6), 734-745 (2012).
  75. de Lange, G. M., Rademaker, M., Boks, M. P., Palmen, S. J. M. C. Brain donation in psychiatry: results of a Dutch prospective donor program among psychiatric cohort participants. BMC psychiatry. 17 (1), 347 (2017).
  76. Peuralinna, T., et al. APOE and AβPP Gene Variation in Cortical and Cerebrovascular Amyloid-β Pathology and Alzheimer's Disease: A Population-Based Analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (2), 377-385 (2011).
  77. Kawas, C. H. The oldest old and the 90+ Study. Alzheimer's & dementia: the journal of the Alzheimer's Association. 4, Suppl 1 56-59 (2008).
  78. Bennett, D. A., Schneider, J. A., Arvanitakis, Z., Wilson, R. S. Overview and findings from the religious orders study. Current Alzheimer research. 9 (6), 628-645 (2012).
  79. O'Brien, R. J., et al. Neuropathologic studies of the Baltimore Longitudinal Study of Aging (BLSA). Journal of Alzheimer's disease: JAD. 18 (3), 665-675 (2009).
  80. Jonkman, L. E., et al. Normal Aging Brain Collection Amsterdam (NABCA): A comprehensive collection of postmortem high-field imaging, neuropathological and morphometric datasets of non-neurological controls. NeuroImage: Clinical. 22, 101698 (2019).
  81. Polito, L., et al. High homocysteine and epistasis between MTHFR and APOE: association with cognitive performance in the elderly. Experimental gerontology. 76, 9-16 (2016).
  82. Amzica, F., Lopes Silva, F. Cellular substrates of brain rhythms. Niedermeyer's Electroencephalography is now in its thoroughly updated sixth edition. , 33-63 (2009).
  83. Vecchio, F., et al. Resting state cortical EEG rhythms in Alzheimer's disease: toward EEG markers for clinical applications: a review. Supplements to Clinical neurophysiology. 62, 223-236 (2013).
  84. Gouw, A. A., et al. EEG spectral analysis as a putative early prognostic biomarker in nondemented, amyloid positive subjects. Neurobiology of Aging. 57, 133-142 (2017).
  85. Babiloni, C., et al. Abnormalities of cortical neural synchronization mechanisms in patients with dementia due to Alzheimer's and Lewy body diseases: an EEG study. Neurobiology of Aging. 55, 143-158 (2017).
  86. Bonanni, L., et al. Quantitative electroencephalogram utility in predicting conversion of mild cognitive impairment to dementia with Lewy bodies. Neurobiology of Aging. 36 (1), 434-445 (2015).
  87. Engedal, K., et al. Quantitative EEG Applying the Statistical Recognition Pattern Method: A Useful Tool in Dementia Diagnostic Workup. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 40 (1-2), 1-12 (2015).
  88. Caviness, J. N., Beach, T. G., Hentz, J. G., Shill, H. A., Driver-Dunckley, E. D., Adler, C. H. Association Between Pathology and Electroencephalographic Activity in Parkinson's Disease. Clinical EEG and Neuroscience. 49 (5), 321-327 (2018).
  89. Goossens, J., et al. EEG Dominant Frequency Peak Differentiates Between Alzheimer's Disease and Frontotemporal Lobar Degeneration. Journal of Alzheimer's Disease. 55 (1), 53-58 (2016).
  90. Bordoni, M., et al. From Neuronal Differentiation of iPSCs to 3D Neuro-Organoids: Modelling and Therapy of Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3972 (2018).
  91. Alafuzoff, I. Minimal neuropathologic diagnosis for brain banking in the normal middle-aged and aged brain and in neurodegenerative disorders. Handbook of clinical neurology. 150, 131-141 (2018).
  92. Wharton, S. B., et al. Epidemiological Neuropathology: The MRC Cognitive Function and Aging Study Experience. Journal of Alzheimer's Disease. 25 (2), 359-372 (2011).

Tags

Neurovidenskab Brain Bank neuropatologi aldring ældrepleje langsgående kohorte undersøgelse hjernedonation hjernedissektion protokol QEEG klinik-patologisk korrelation omics
Abbiategrasso Brain Bank Protokol til indsamling, behandling og karakterisering aldrende hjerner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poloni, T. E., Medici, V., Carlos,… More

Poloni, T. E., Medici, V., Carlos, A. F., Davin, A., Ceretti, A., Mangieri, M., Cassini, P., Vaccaro, R., Zaccaria, D., Abbondanza, S., Bordoni, M., Fantini, V., Fogato, E., Cereda, C., Ceroni, M., Guaita, A. Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains. J. Vis. Exp. (160), e60296, doi:10.3791/60296 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter