Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60347
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurobiology, Stanford University School of Medicine

Summary

نحن نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا الصغيرة من المناطق تشريح مختلفه من نصف الكره الدماغ الفار الكبار ، تليها اعداد المكتبة شبه المؤتمتة لعمق خليه واحده الحمض الريبي النيبالي تسلسل كامل طول الكتابات النصية. ستساعد هذه الطريقة علي توضيح التغاير الوظيفي للدبقيه الصغيرة في الصحة والمرض.

Abstract

كما الضامة المقيمين في الجهاز العصبي المركزي ، الميكروبات الصغيرة بنشاط السيطرة علي نمو الدماغ والتوازن ، واختلالاتها قد تدفع الامراض البشرية. وقد أحرز تقدم كبير للكشف عن التواقيع الجزيئية من الخلايا الصغيرة الساكنة ، فضلا عن التغييرات في التعبير الجيني لديها استجابه للمؤثرات البيئية. مع ظهور ونضوج المنهجيات الجينية أحاديه الخلية ، فانه من المسلم به بشكل متزايد ان غير متجانس الصغيرة قد تكمن وراء الأدوار المتنوعة التي تلعبها في الظروف التنموية والمرضية المختلفة. ويمكن تحقيق مزيد من التشريح لهذا التغاير من خلال العزل الفعال للخلايا الصغيرة من منطقه معينه من الاهتمام ، يليه التنميط الحساس لكل خليه. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للعزل السريع من الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الدماغية الماوس الكبار واحد. ونحن أيضا شرح كيفيه استخدام هذه الخلايا الصغيرة فرزها لتسلسل المستندة إلى لوحه عميقة الحمض الريبي النيبالي. ونناقش قابليه هذه الطريقة للتكيف مع سيناريوهات أخرى ونقدم مبادئ توجيهيه لتحسين النظام لاستيعاب الدراسات الواسعة النطاق.

Introduction

الأجزاء الصغيرة التي تمثل 5% − 10% من جميع الخلايا العصبية هي الضامة المقيمة المنتشرة في جميع انحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. المحمية وراء حاجز الدم في الدماغ, الميكروبات النموذجية في الدماغ الكبار صحية تحتوي علي العديد من العمليات الدقيقة التي تمتد بسرعة والتراجع للتفاعل مع الخلايا العصبية وغيرها من الكريات الدبقيه في parenchyma. ويمكن أيضا ان تعتمد الخلايا الصغيرة المورفولوجية الشكل الأميبا المرتبطة بزيادة وظيفة البالعة خلال مراحل تنموية محدده أو عند التحديات المناعية في الإصابات والامراض1،2،3،4. كما يتم توضيح المزيد من وظائف الخلايا الصغيرة الصغرى ، ويغذي الاثاره أكثر من الدراسات علم الوراثة البشرية ، والتي أظهرت ان العديد من الجينات خطر الامراض العصبية ، مثل TREM2 ، هي في الغالب أو حصرا التي أعرب عنها ميكروليا5،6،7. نظرا لأهميتها في التنمية والأدوار المعقولة القيادة المرض, وقد تم مؤخرا بذل جهد هائل نحو فهمنا لتنظيم الجينات ميكروجليال ووظيفة في الأمل في العثور علي أهداف علاجيه جديده للامراض التنكسية العصبية1,8.

ويسمح تسلسل الحمض الريبي النيبالي (RNA-seq) بتوصيف غير متحيز للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، والذي بدوره يرشد العلماء إلى التحقيق في وظائف الجينات في الشبكات الخلوية الكثيفة7. وقد تم الحمض الريبي النيبالي-seq في الغالب علي عينات السائبة ، مما يؤدي إلى اكتشاف التوقيع الجينات ميكروجليال التماثل الذي يميزها عن الخلايا العصبية والمناعية الأخرى9. ومع ذلك ، يمكن ان يغفل هذا النهج الاختلافات الجزيئية والوظيفية بين الخلايا الصغيرة ، وخاصه تلك الموجودة بشكل عابر في التنمية ، أو المرتبطة بالشيخوخة والمرض. وفي الواقع ، فان الخلية الواحدة RNA-seq (scrna-seq) تقدم الحساسية والدقة التي أحدثت ثوره في المجال من خلال الكشف عن عدم التجانس في السابق من الميكروبات الصغيرة في مجموعه متنوعة من السياقات2،3،10. الاضافه إلى ذلك ، ونظرا لوجود خلايا مناعية مماثله أخرى في واجهه الجهاز العصبي الدوران ، يوفر scRNA-seq معلومات تساعد علي تصميم أدوات جديده لفصل وتشريح وظيفيا هذه الخلايا ذات الصلة مع القليل من المعرفة السابقة2،11.

وقد تم اختراع مجموعه متنوعة من المنصات التي تليها scRNA ، كل مناسبه لتطبيقات معينه12. وبصفه عامه ، فان الطرق القائمة علي القطرات ، مثل الجينوم الجيني 10x ، تكون اعلي في الانتاجيه مع (عشرات) آلاف الخلايا المتسلسلة في كل شوط ، وهي اقل انتقائية للمدخلات التي قد تحتوي علي مجموعات مختلطة من الخلايا التي تتطلب تصنيفا واسعا. توفر الطرق المستندة إلى اللوحة حساسية اعلي وقراءه العمق13،14، وعاده ما تستهدف الفئات السكانية المحددة من فرز الخلايا للكشف عن الاختلافات الدقيقة أو النصوص النادرة.

هنا ، ونحن نقدم تفاصيل حول كيفيه عزل الخلايا الصغيرة من مناطق مختلفه من الدماغ الماوس تشريح من نصف الكره الواحد ، والتي تستخدم لخليه واحده (أو السائبة) الحمض الريبي النيبالي-seq بعد اجراء شبه الألى لوحه القائمة علي التحضير للمكتبة. ويمكن بعد ذلك استخدام نصف الكره الآخر للتحقق من صحة الانسجه. تبسيط من الطريقة المنشورة سابقا9، ويهدف هذا البروتوكول العزلة لتعظيم العائد من كميه صغيره من مواد البداية ، وفي الوقت نفسه الحفاظ علي ملامح التعبير الجيني ميكروجليال الذاتية. نستخدم الفرز الخلوي المنشط (FACS) لإثراء الأجزاء الصغيرة (أو الخلايا المناعية الأخرى ذات الاهتمام) في لوحات 96 وتصغير احجام الكواشف لاعداد المكتبة من أجل زيادة الانتاجيه. ونحن نسلط الضوء علي هذه المنصة الحساسة ، علي الرغم من انه يمكن تطبيق استراتيجيات أخرى قائمه علي اللوحات. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهوله لعزل الخلايا الصغيرة من الانسجه الأخرى التي تم تشريحها ، مثل الاصابه أو بؤر المرض ، ويمكن ان يختلف عمر الماوس عبر اي مراحل ما بعد الولادة تقريبا. ومن شان العزل الفعال للخلايا الصغيرة الاقليميه للدراسات الناسخة أحاديه الخلية ان يسهل الفهم الأفضل لوظائفهم في مجال الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتتفق جميع الإجراءات المتعلقة بالقوارض مع المبادئ التوجيهية لجامعه ستانفورد ، التي تمتثل للقوانين والسياسات الوطنية والولائية. تمت الموافقة علي جميع الإجراءات الحيوانية من قبل الفريق الإداري لجامعه ستانفورد المعني برعاية الماشية في المختبرات.

ملاحظه: يتم توفير جميع التراكيب الحلوالعازلة في جدول المواد.

1. التحضير يوم عزل الخلايا

  1. اعداد الكواشف التالية والبرد لهم علي الجليد: المتوسطة A (50 mL) ، المغناطيسي تنشيط الخلية الفرز (الاشراف) المخزن المؤقت (الاشراف) (30 مل) ، العازلة FACS (25 مل) ، الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية المؤقتة ؛ 30 مل) ، DNase Ase
    ملاحظه: وحدات التخزين المقدمة هنا كافيه لعزل الخلايا الصغيرة من 4 مناطق الدماغ (علي سبيل المثال ، القشرة ، المخيخ ، الحصين والمخطط) من نصف الكره الدماغية ماوس واحد. التوسع في حاله استخدام المزيد من الانسجه.
  2. وضع أربعه نظيفه 2 مل Dounce الخالطون علي الجليد وأضافه 2 مل من متوسطه A مع 80 μL من DNase (12,500 وحده/مل) و 5 μL من مثبطات RNase في كل الخالطون Dounce. البرد المكابس في أنابيب 15 مل.
  3. تسميه أربعه 6 سم بيتري الاطباق مع مناطق الدماغ لجمع الانسجه وأضافه 200 μL من المتوسطة الباردة A في كل طبق علي الجليد. أضافه حوالي 5 مل من المتوسطة A في صحن بيتري 6 سم لتشريح.
    ملاحظه: قبل الاستخدام ، تاكد من ان جميع الكواشف معقمه ومناسبه لتطبيقات RNA. مقاعد البدلاء وأداات تشريح تحتاج إلى ان تكون نظيفه ورش مع محلول أزاله التلوث RNase (جدول المواد).

2. تشريح منطقه الدماغ

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 30 دقيقه.

  1. حقن 400 − 500 μL من الكيتامين/اكسيليازين (24 ملغ/مل الكيتامين و 2.4 ملغ/مل اكسيليازين) في الصفاق من الحدث إلى الكبار الفار مرحله (> 1 شهر من العمر).
    ملاحظه: ويستخدم الماوس الذكور هنا للتوضيح ، ولكن اما نوع الجنس هو مناسب.
  2. انتظر لمده 5 دقائق وقرصه مخلب الخلفية لضمان عدم التراجع.
  3. علي الفور استخدام 26 جرام x 3/8 ابره لأداء العمليات ترويه مع 20 − 30 مل من الجليد الباردة تلفزيوني حتى تنفد العازلة مع عدم وجود الدم مرئية.
  4. قطع راس الماوس مع زوج من المقص الجراحي. استخدام مقص صغير لقطع فتح الجلد لفضح تحت الجمجمة ، ومن ثم قطع من خلال خياطه السهمي ، خياطه أفاريز الباب وخياطه إكليلي. استخدام ملقط لسحب قباله كلا الجانبين من العظام الجدارية والعظام الجدارية دون الاضرار الانسجه ، ونقل بعناية الدماغ في الطبق بيتري تشريح مع المتوسطة ا.
  5. استخدم شفره مبرده مسبقا لقطع المخ من خلال الخط النصفي إلى نصفين.
    ملاحظه: مناطق الدماغ الاربعه الموصوفة هنا من نصف الكره الواحد تسفر عن اعداد كافيه من الخلايا الصغيرة للتطبيقات أحاديه الخلية أو الجزء الأكبر من الحمض الريبي-المتسلسل. الأخرى نصف كره يستطيع كنت استعملت ل مناعي أو [رنا] في موقعه تحقق.
  6. افصل المخيخ عن الفص القشري وجذع المخ بملقط #55 وانقل الانسجه إلى طبق بيتري الخاص بالمجموعة.
  7. استخدام ملقط #55 لتشريح بعناية من الحصين والمخطط من القشرة ونقل كل الانسجه إلى مجموعه طبق بيتري.

3. تفكك الانسجه الميكانيكية

ملاحظه: إبقاء الخلايا والكواشف بارده في كل وقت الا اثناء الخطوات تلطيخ. هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 30 دقيقه.

  1. ختم كل نسيج الدماغ مع شفره الحلاقة في < 1 مم3 قطع دقيقه.
  2. استخدام ماصه 1 مل (مع قطع نصائح) لنقل قطع الانسجه إلى الخالطون Dounce قبل المبردة ، كل منها يحتوي علي 2 مل من المتوسطة A مع DNase ومثبط RNase.
  3. تجانس النسيج عن طريق التواء ببطء المكبس داخل وخارج الخالط Dounce لمده 6 − 10 السكتات الدماغية الكاملة ، حتى لا توجد قطع مرئية.
    ملاحظه: دونسينج يقتل الخلايا العصبية ومعظم الكريات الأخرى ولكن ترك خلايا ميكروجليال سليمه بدلا. كلا غير كافيه والإفراط في الدونسينج يمكن ان يؤدي إلى انخفاض الغلة من الخلايا.
  4. نقل الانسجه غير المنفصلة في أنابيب 50 mL من خلال strainers 70 μm.
  5. شطف كل الخالط Dounce والمكبس مع ما مجموعه 6 مل من المتوسطة الباردة A وتصفيه محلول الشطف من خلال نفس مصفاه في أنبوب المقابلة.
  6. نقل المعلقات خليه واحده (حوالي 8 مل لكل) في 15 مل أنابيب مخروطيه وأجهزه الطرد المركزي في 400 x g ل 5 دقيقه في 4 °c مع الفرامل = 5.

4. أزاله الميالين

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 60 دقيقه.

  1. اعداد 1 العمود استنزاف كبير (LD) (للقشرة) و 3 اختيار كبير (LS) الاعمده (للمناطق 3 الأخرى) في فاصلالمغناطيسي (جدول المواد). شطف كل عمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
  2. بمجرد الانتهاء من طرد ، ماصه خارج وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه. بالنسبة للانسجه القشرة والمخيخ ، أعاده تعليق الخلايا في 850 μL من المخزن المؤقت للرصد والتقييم مع 1.8 μL من مثبط RNase. بالنسبة للانسجه الحصينة والشريطية ، أعاده تعليق الخلايا في 400 μL من المخزن المؤقت للرصد والتقييم مع 0.9 μL من مثبط RNase.
    ملاحظه: يتم تحسين الاعمده (LD مقابل LS) ووحده التخزين المستخدمة لأعاده التعليق استنادا إلى كميه الميلين الموجودة في الانسجه. إذا كانت المناطق الدماغية الأخرى التي يتم التهاوي, هذه الشروط قد تحتاج إلى تعديل اعتمادا علي حجم الانسجه ومقدار الميالين قد تكون موجودة. يمكن تقدير فعاليه أزاله الميلين في الخطوة 4.9.
  3. أضافه 100 μl من الخرز أزاله المايلين كل في الخلايا من القشرة والمخيخ وأضافه 50 μl من الخرز أزاله المايلين كل في الخلايا من الحصين والشريطية.
  4. تخلط برفق الخلايا مع الخرز واحتضان الأنابيب علي الجليد لمده 10 دقيقه.
  5. جلب حجم الأنبوب مع الخلايا القشرية إلى 2 مل مع المخزن المؤقت للرصد والاشراف ، وجميع الآخرين إلى 1 مل (اي ، أضافه 1 مل للخلايا القشرية ؛ 500 μL للخلايا الهيبوكامباله والشريطية ؛ لا حاجه لأضافه العازلة إلى الخلايا المخيخ).
  6. مره واحده الاعمده فارغه من الشطف العازلة ، ووضع أنبوب 15 مل تحت كل عمود. تحميل الخلايا القشرية (2 مل) علي العمود LD ، وجميع الآخرين (1 مل لكل منهما) علي أعمده LS. علي الفور استخدام 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف لكل منهما لغسل الأنابيب الاصليه وتحميل الحل علي الاعمده المقابلة.
  7. غسل العمود LD مره واحده مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف وغسل كل عمود LS مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف كل غسل. الاستمرار في جمع الحل من خلال التدفق اثناء الغسيل.
  8. تصفيه الخلايا في أنابيب FACS أسفل الجولة من خلال قبعات مصفاه 35 μm.
    ملاحظه: وينبغي لكل أنبوب جمع حوالي 4 مل من تعليق خليه واحده المنضب من myelin.
  9. اختياريا ، خذ 10 μL من تعليق الخلية ومزجها مع 10 μL من 0.4% الحل الأزرق التريبين. فحص الخلايا تحت 10x المجهر حقل مشرق لتقدير العائد ، ومعدل البقاء علي قيد الحياة ومستوي myelin المتبقية.
    ملاحظه: التحضير الناجح يجب ان يولد أكثر من 90% من الخلايا الحية (مستديرة الشكل وباستثناء الصبغة الزرقاء) مع القليل من الحطام العضلي.
  10. الخلايا بيليه في أنابيب FACS في 400 x g ل 5 دقيقه في 4 °c ، مع الفرامل = 5. يصب ببطء ماده طافي والداب حافه الأنبوب علي الورق المناديل. أعاده تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 300 μL من المخزن المؤقت FACS.
    ملاحظه: إذا كان الفرز الاشراف المفضل ، يمكن استخدام CD11b الخرز لاختيار الخلايا الدقيقة وغيرها من الكريات النخاعية بعد أزاله الميلين. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا لغير المستندة إلى لوحه scRNA-seq ، فضلا عن الجزء الأكبر RNA-seq. والتحذير من هذا النهج البديل هو ان الخرز CD11b لا تفصل الخلايا الصغيرة الأخرى من الخلية المناعية ذات الصلة التي هي أيضا ايجابيه لهذا مستضد.

5. تلطيخ لفرز الخلايا المنشطة الفلورية

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 40 دقيقه.

  1. أضافه 5 μL من الماوس Fc مستقبلات كتله كاشف (جدول المواد) في كل أنبوب. احتضان لمده 5 دقائق علي الجليد.
  2. أضافه 1 μL من CD45-Cy7 و 1 μL من CD11b-BV421 في كل أنبوب.
    ملاحظه: ويمكن استخدام الأجسام المضادة مع الفلوبهورس المترافقة الأخرى. يمكن أيضا تضمين الأجسام المضادة ضد TMEM119 ، وهي علامة محدده للمسكنات الصغيرة الساكنة9، ولكن من المستحسن استخدامها مع CD45 و CD11b ، لان بعض الفئات الفرعية من الخلايا الصغيرة قد تفقد TMEM119 تعبير السطح.
  3. احتضان الأنابيب علي شاكر لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
  4. أضافه 2 مل من العازلة FACS لغسل.
  5. الخلايا بيليه في 4 درجه مئوية ، 400 x g لمده 5 دقائق ببطء تصب في ماده طافي والداب علي حافه الأنبوب علي المناديل الورقية. أعاده التعليق الخلايا في كل أنبوب باستخدام 400 μL من المخزن المؤقت FACS مع 1 μL من مثبطات RNase و 0.5 μL من يوديد بروبيديوم (PI ، 1:1000 التخفيف).

6. مؤشر FACS الفرز

ملاحظه: يجب ان تاخذ هذه الخطوة ~ 1 h.

  1. بعد اجراء FACS القياسية ، ورسم بوابات علي أساس مبعثر (باستثناء الحطام) ، وخلايا واحده ، والخلايا الحية (PI السلبية) ، الخلايا الصغيرة والكريات النخاعية (CD45 +،CD11b +).
    ملاحظه: الخلايا ميكروجليال النموذجية اكسبرس CD45 في مستويات اقل مقارنه مع الضامة الأخرى المرتبطة الحدود ، مثل الضامة الوعائية والمكورات السحائية ، التالي النابضة علي CD45 منخفضهCD11b + يجب ان تكون كافيه إذا كان تركيز البحث هو ملامح التعبير الجيني فيهذهالكلاسيكية الصغرى ومع ذلك ، قد يكون بعض مجموعات فرعيه من الخلايا الصغيرة الصغرى التعبير CD45 اعلي وهذا صحيح بشكل خاص اثناء التنمية أو في ظروف المرض. لضمان التحليل غير المتحيز للتعبير الجيني المجهري ، يمكن تسجيل CD45 عاليه و CD45 منخفضه الإيمونوفينوتيبيس من خلال اعداد الفرز الفهرس وجمع كل من السكان للتسلسل وتحليل المصب. الاضافه إلى ذلك ، TMEM119 التعبير السطحي يمكن استخدامها لاستهداف السكان ميكروجليال الساكنة (انظر الخطوة 5.2) وتحليلها مع مستويات CD45 ونتائج التسلسل.
  2. فرز الخلايا الصغيرة واحده (مع فوهه 100 μm) في 96-بئر البلمره سلسله تفاعل (PCR) لوحات, تحتوي علي 4 μL من تحلل العازلة كل بئر (انظر البروتوكول المنشور14 للحصول علي التفاصيل).
    ملاحظه: الخارجية [رنا] تحكم اتحاد ([رك]) [رنا] سبايك-في مزيج (جدول المواد) يستطيع كنت أضفت في 1:2.4 x 107 في ال تحلل عازل لنوعيه تحكم وتطبيع أغراض2.
  3. لفتره وجيزة دوامه لوحات وتدور باستخدام جهاز الطرد المركزي اعلي مقعد.
  4. تجميد العينات علي الجليد الجاف فورا. تخزين لوحات في-80 درجه مئوية حتى اعداد المكتبة.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن جمع المزيد من الخلايا في أنابيب 1.5 mL مع الجيش النيبالي المؤقت استخراج العازلة لمعظم RNA-seq. ووفقا لتجربه المؤلفين ، 3,000 خليه كافيه لإنشاء مكتبات ذات نوعيه جيده بعد البروتوكول المنشور2،14.

7. خليه واحده الجيش الريبي النيبالي تسلسل اعداد المكتبة

ملاحظه: هنا ، يتبع البروتوكول14 المنشورة لتوليد scrna-seq المكتبات مع المعونة من التعامل مع الروبوتات السائل وبعض التعديلات. في هذه المقالة ، يتم وصف الاجراء لفتره وجيزة فقط ، ويتم تمييز الاختلافات. معالجه 4 لوحات في وقت واحد يستغرق حوالي 2.5 أيام.

  1. ذوبان لوحات علي الجليد وأداء النسخ العكسي مع التمهيدي Oligo-dT30VN (في المخزن المؤقت تحلل) لتوليد cDNA مع الدوريات الحرارية (الجدول 1): 42 درجه مئوية 90 دقيقه ؛ 70 درجه مئوية 5 دقيقه; 4 درجه مئوية عقد. ثم تضخيم cDNA مع خطوه الهضم اضافيه التبرئة في البداية (الجدول 2) باستخدام المزيج الرئيسي pcr وفي الموقع PCR (ispcr) الإشعال (جدول المواد) وحاله pcr التالية: 37 درجه مئوية 30 دقيقه; 95 درجه مئوية 3 دقيقه; 23 دورات من 98 درجه مئوية 20 ثانيه ، 67 درجه مئوية 15 ثانيه ، 72 درجه مئوية 4 دقيقه ؛ 72 درجه مئوية 5 دقيقه.
  2. تنقيه cDNA باستخدام 18 μL من الخرز المغناطيسي في بئر (0.7:1 نسبه). احتضان لوحه علي موقف المغناطيسي لمده 5 دقائق وغسل العينات مرتين مع الطازجة 80 ٪ الايثانول ، 80 μL في كل بئر في كل مره. بعد تجفيف لوحه لمده 15-20 دقيقه ، الوت cdna مع 20 μl من العازلة لكل بئر.
    ملاحظه: لمراقبه الجودة ، واستخدام محلل جزء (حساسية عاليه الجيل التالي التسلسل [خ ع] تحليل الجزء ، 1 − 6000 bp) للتحقق من حجم التوزيعات وتركيزات cDNA ، وعينات عمليه أخرى فقط مع مسحه بين 500 − 5000 bp ، واعلي من 0.05 ng/μL.
  3. لإنشاء المكتبات ، ومزيج 0.4 μL من كل عينه cDNA مع 1.2 μL من الكواشف Tn5 التغريد من مجموعه اعداد المكتبة (جدول المواد) في لوحه 384 بشكل جيد مع المعونة من اله الأنابيب نانووليتر ، في 55 درجه مئوية 10 دقيقه.
    ملاحظه: هنا ، يتم أضافه 1/12.5 من حجم رد الفعل المقترح (5 عينه μL و 15 μL من الكواشف التغريد) من أجل خفض التكلفة وفي الوقت نفسه زيادة الانتاجيه. يتم استخدام اله الأنابيب نانونوليتر (جدول المواد) لنقل الكواشف (هذه والخطوات التالية) من والي لوحات 384.
  4. أضافه 0.4 μL من العازلة تحييد لوقف رد فعل التغريد في RT لمده 5 دقائق.
  5. أضافه 384 فهارس (جدول المواد، 0.4 μl إلى الامام و 0.4 μl عكس) ، 1.2 μl من PCR مزيج إلى عينات (2 μl كل) ، وتضخيم المكتبات باستخدام الشرط التالي: 72 °c 3 دقيقه ؛ 95 درجه مئوية 30 ثانيه; 10 دورات من 95 درجه مئوية 10 ثانيه ، 55 درجه مئوية 30 ثانيه ، 72 درجه مئوية 1 دقيقه ؛ 72 درجه مئوية 5 دقيقه.
  6. تجمع جميع المكتبات الفردية (تاخذ 1 μL كل) من نفس لوحه 384 معا ، واستخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد، 0.7:1 نسبه) لتنقيه المكتبات المجمعة النهائية.
  7. استخدام مقياس فلوري (جدول المواد) لقياس التركيزات ومحلل حيوي (جدول المواد) لفحص توزيعات حجم المكتبات المجمعة قبل التسلسل. استهداف عمق التسلسل في 1,000,000 القراءة الاوليه لكل خليه.
  8. اتبع إجراءات المعلوماتية الحيوية القياسية لتصفيه وتقليم التسلسل يقرا وتنفيذ المحاذاة2. استخدام جدول العد وبيانات التعريف كمدخلات للقيام بتحليل التجميع مع حزمه Seurat15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول أسلوبا لعزل وفرز الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الارضيه الدماغ البالغة ، تليها scRNA-seq. نحن نستخدم دونسينج لإنشاء تعليق خليه واحده وأيضا كخطوه اولي لإثراء الخلايا الصغيرة. نقص أو الإفراط في دونسينج يقلل من الغلة. الاضافه إلى ذلك ، تحتوي أدمغه الفئران الكبار علي مستويات عاليه من الميالين ، والتي يمكن أيضا ان تقلل من كفاءه الفرز والغلة إذا لم تتم ازالتها بشكل صحيح. ولذلك ، فاننا ندرس تعليق الخلية تحت المجهر باستخدام التريبين الأزرق والكريات البيض لتقدير الغلة ، وبقاء الخلية وفعالية أزاله الميلين (الخطوة 4.9) قبل تنفيذ تلطيخ الأجسام المضادة (الشكل 1). يجب ان يكون إجمالي عدد الخلايا عند هذه النقطة أكثر من 30,000 للقشرة ، وأكثر من 5,000 للانسجه الأخرى. أكثر من 90% من الخلايا يجب ان تكون قابله للحياة مع القليل من الحطام الميلين.

نحن نستخدم اله FACS لفرز الخلايا الصغيرة (أو الكريات النخاعية) ، والتي عاده ما تكون CD45 منخفضه و CD11b موجبه. علي الأقل بالنسبة للانسجه القشرية ، فان العزلة الناجحة يجب ان تولد أكثر من 80 ٪ من الخلايا الصغيرة الحية من كل خليه واحده حيه (الشكل 2). ولا يمثل السكان المحتضرون/الموتى سوي جزء صغير من الاعداد (حوالي 10 في المائة).

مره واحده يتم القبض علي الخلايا الصغيرة الفردية في المخزن المؤقت تحلل ، يتم تحرير الجيش النيبالي الريبي وبعد ذلك عكس المنقولة إلى cDNA ، والتي يتم تضخيمها بعد ذلك ل 23 دورات. من المهم التحقق من جوده هذه العينات من cDNA — علي الأقل جزء منها — قبل صنع المكتبات. كمنصة الكهربي الشعرية ، ومحلل الجزء ومجموعات المواد الحساسة العالية خ ع (1 − 6000 bp) توفير معلومات سريعة ودقيقه حول توزيع حجم وكذلك كميه من جزيئات cDNA موجودة في كل بئر من لوحه 96-بئر (الشكل 3ا). يمكن استخدام العينات التي تظهر مسحه (500 − 5000 bp) وفوق عتبه تركيز معينه (علي سبيل المثال ، 0.05 نانوغرام/μL) لجعل المكتبات. المثل ، ينبغي اختبار المكتبات المجمعة علي محلل حيوي قبل التسلسل (الشكل 3ب).

نحن تسلسل العينات إلى عمق أكثر من 1,000,000 القراءة الخام في الخلية ، والتي تشبع قوه الكشف عن هذه المنهجية scRNA-seq16. مع حوالي 60 ٪ معدل رسم الخرائط ، ويمكن الكشف عن أكثر من 2,000 الجينات لكل خليه ميكروجليال. حصلنا علي البيانات المنشورة التي تم إنشاؤها باستخدام طريقه العزل17هذه ، واظهر استنساخها من التجارب المستقلة والحساسية للكشف عن الجينات الخاصة بالخلايا الصغيرة التي تنتشر في الفئات المتسلسلة (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: تقدير غله عزل الخلايا الصغرى ، وسلامه الخلية ، وكفاءه أزاله الميالين. وأظهرت اللوحة اليسرى صوره الحقل الساطع (التكبير 4x) من الخلايا الملونة التريكان الأزرق (من القشرة) بعد مرورها من خلال أعمده أزاله الميلين. النتائج للمناطق الأخرى سوف تبدو متشابهة ولكن مع عدد اقل من الخلايا. الاغلبيه الساحقة (ان لم يكن كل) من الخلايا ظهرت مشرقه (غير ملطخه) وجولة بسبب فقدان العمليات. كانت الصورة الصحيحة هي التكبير/التصغير (20x) من المنطقة المحاصرة وكان الحطام الصغير موجودا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: البوابات المستخدمة لفرز الخلايا الصغيرة. وأظهرت البيانات استراتيجية النابضة لفرز الخلايا الصغيرة من القشرة ، واستخدمت نفس الاستراتيجية للمناطق الأخرى. تم استبعاد الحطام الخلوي لأول مره من المخطط المبعثر ، وتمت بوابه الخلايا المفردة بواسطة المنطقة المبعثرة الاماميه (FSC-A)/العرض المبعثر للامام (FSC-W). تم بوابات الخلايا الحية بواسطة التلطيخ السلبية PI ، والتي كانت من حوالي 90 ٪ من جميع الخلايا المفردة. تم فرز الميكروبات الصغيرة ، التي تمثل تقريبا 80 ٪ من الخلايا الحية ، من CD45 منخفضه CD11b + بوابه. ويمكن عزل ما مجموعه ~ 30,000 الخلايا الدقيقة الصغيرة وفرزها من الانسجه القشرة (من نصف الكره الارضيه من الماوس القديمة لمده 3 أشهر). تم اجراء فرز الفهرس علي جهاز FACS. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3

Figure 3
الشكل 3: نتائج مراقبه الجودة التمثيلية لتضخيم cDNA من خليه ميكروجليال واحده ومكتبه مجمعه في نهاية المطاف. (ا) باستخدام محلل الأجزاء ، يتم رسم جميع الشظايا باحجامها علي محور X ، وكثافة الفلورية النسبية علي محور Y ، مما يدل علي وفره cdna معينه الحجم. LM (العلامة السفلي ، 1 bp) و UM (العلامة العليا ، 6,000 bp) يتم تحميل علامات مع تركيزات معروفه تستخدم لقياس كميه cDNA. تضخيم بنجاح cDNA من الخلية الصغرى التمثيلية تشكل منحني (خط اخضر منقط) علي الرسم البياني للتوزيع حجم أو مسحه (قوس المسمي) علي الرسم البياني هلام بين 500 bp و 5,000 bp. وقد تم تضخيم القمم الأخرى المسمية من الارتفاع ERCC-في جزيئات أو الحمض الريبي النيبالي. تركيز cDNA بين 500 bp و 5,000 bp يمكن قياسه كميا ، وتلك العينات مع تركيزات اعلي من 0.05 ng/μL وتظهر مثل هذه المنحنيات النموذجية يتم الاحتفاظ لاعداد المكتبة. RFU ، وحده مضان النسبية. (ب) نتيجة مراقبه الجودة التمثيلية علي محلل حيوي يظهر توزيع حجم المكتبة المجمعة النهائية (مع حوالي 380 الخلايا). عاده ، فانه يتراوح من 200 bp إلى 2,000 bp مع متوسط حجم 400 − 600 bp. وكانت القمم الحاده اثنين تحميل علامات. فو ، وحده مضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحليل المتسلسل لخلايا النحل الصغيرة المعزولة من 4 مناطق الدماغ من اثنين من الفئران الذكور. (ا) مخطط tsne الذي يظهر نمطا مختلطا من الخلايا الصغيرة الاقليميه (تم تسليط الضوء فقط علي الخلية من #1 الفاره). انها لا تشكل مجموعات متميزة وفقا لأصول المنطقة خارج التحول خفيه إلى مناطق مركزه علي مؤامرة tSNE (ربما بسبب الآثار دفعه). وتتسق هذه الملاحظة مع التباين الإقليمي المحدود في الخلايا الصغيرة التي تستند إلى التعبير الجيني العالمي في الفئران البالغة (انظر المنشور الأخير2 لمزيد من المناقشة بشان هذا الموضوع). (ب) المؤامرة التي تظهر نمطا متداخلا من الخلايا الصغيرة من اثنين من الفئران الفردية التي تم تجهيزها بشكل مستقل. علي الرغم من ان اثار الدفعات الصغيرة قد تكون موجودة (الخلايا التي تركز في مناطق معينه من المؤامرة) ، هذه الخلايا لا تشكل مجموعات متميزة وفقا لأصول الحيوانية. وتقترح هذه النتيجة استنساخ البروتوكول لمقارنه البيانات بين التجارب. (ج) التعبير عن جينات توقيع الخلايا الصغيرة التي كشفتها الخلية المتسلسلة للكشف عن الأورام التي تظهر أكثر من 95% من معدل الاكتشاف لعلامات محدده ، مثل Tmem119 و P2ry12، ومعدل اكتشاف أكثر من 80% لعوامل النسخ المعروفة مثل Sall1 و Pu. وأعيد تحليل البيانات من المؤلفات المنشورة17. (د) الغالبية العظمي من الخلايا الصغيرة المعزولة تفتقر إلى التعبير عن الجينات الخاصة بأنواع الخلية الأخرى ، مثل Tubb3 (الخلايا العصبية) ، Aldh1l1 (astrocytes) ، Gjb1 (Oligodendrocytes) ، و Tie1 (الخلايا البطانية). (ه) التعبير عن الجينات المرتبطة بالتنشيط المجهري أو الإجهاد. علامات الكلاسيكية ، Tnf، Il1b، Nos2، و Nfkb2، والتي يتم التعبير عنها المتواضع ، وتظهر علي القمه. يتم عرض جينات الاستجابة المبكرة ، Egr1 و Fos، في الجزء السفلي (انظر المناقشة). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

كاشف الحجم (μL)
خليه تحلل 4
النسخ العكسي (100 U/μL) 0.95
مثبطات rnase 0.25
5x الحاجز حبلا الاولي 2
ديثيوثريتول (DTT; 100 mM) 0.5
البيتين (5 م) 2
MgCl2 (1 M) 0.06
قالب التبديل اليغو (tso ؛ 100 μM) 0.1
H2O 0.14
مجموع 10

الجدول 1: حاله النسخ العكسي. يتم توفير وحدات التخزين كاشف لرد فعل النسخ العكسي واحد.

كاشف الحجم (μL)
عكس المنتج النسخ 10
2x PCR ماستر ميكس 12.5
التمهيدي ISPCR (10 μM) 0.25
التبرئة لأمدا 0.1125
H2O 2.1375
مجموع 25

الجدول 2: حاله التضخيم PCR. يتم توفير كميات كاشف لتضخيم PCR واحد من cDNA من خليه واحده.

المستندة إلى لوحه (هذا البروتوكول) المستندة إلى الحبريه (10 x جينوم)
حساسيه الكشف عن المزيد من الجينات عدد اقل من الجينات المكتشفة
كامل طول نعم لا (5 ' أو 3 ' نهاية)
المرونة لأرقام الخلايا/السكان مناسبه لتوصيف الفئات الفرعية الصغيرة أو النادرة مناسبه لتصنيف واسعه من السكان خليه كبيره
الانتاجيه حتى عده آلاف من الخلايا مئات من عشرات آلاف من الخلايا
المعرف الجزيئي الفريد لا نعم
التكلفة لكل خليه $1 − $5 اقل من $1
صعوبة تجريبية مزيد من الخطوات وعاده ما تتطلب التعامل مع الروبوتات السائل بسيطه لأداء مع آلات التجارية
مجموعات الخلايا المستهدفة من قبل الفرز FACS غير متحيزه

الجدول 3: المقارنة بين الأساليب المستندة إلى اللوحات والطرق التسلسلية المستندة إلى القطرات. في هذه المقالة ، يتم توفير الاجراء المستندة إلى لوحه كامله الطول scRNA-seq ، والتي لديها مزايا حساسية اعلي ، والتسلسل بالطول الكامل والمرونة لاعداد صغيره من الخلايا كمدخلات. وتوفر الطرق المستندة إلى القطيرات مزايا الانتاجيه العالية ، والتكلفة المنخفضة ، وسهوله الأداء ، والبيانات في المعرفات الجزيئية الفريدة. وهي متكاملة تبعا للغرض من التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الميكروبات تتفاعل بنشاط مع أنواع الخلايا الأخرى في الوحدة العصبية الخاصة ، وانها حساسة جدا للمؤثرات البيئية. من أجل التقليل من الاستجابات التهابيه والتغيرات الشاذة في التعبير الجيني اثناء عمليه العزل ، تم تبسيط هذا البروتوكول من الطريقة9المنشورة سابقا ، وهو الآن مناسب لعزل الخلايا الصغيرة من مناطق متعددة من نصف الكره الدماغية بالماوس الواحد بالتوازي. يتم الاحتفاظ الانسجه والكواشف في درجه حرارة الباردة ويتم اجراء التجارب في الوقت المناسب (حوالي 3.5 h من تشريح إلى الفرز) مع اقل يغسل واقل الكواشف علي أساس احجام الانسجه محدوده. نختار دونسينج علي أساليب التجانس الأخرى ، مثل الهضم الانزيمي ، لان التفكك الميكانيكي يمكن ان يقتل التالي أزاله الخلايا العصبية وغيرها من الخلايا الدبقيه في حين تسبب القليل من الضرر أو التنشيط إلى ميكروليا9،18. الإفراط في الدونسينج ، ومع ذلك ، قد يقلل من الغلة من الخلايا الصغيرة وينبغي تجنبها. وقد ثبت سابقا ان التفكك الميكانيكي وأزاله الميلين القائم علي الخرز تليها الفرز FACS إدخال اقل التنشيط إلى الخلايا الصغيرة ، استنادا إلى الحد الأدنى من التعبير عن الجينات التهابيه الكلاسيكية ، علي سبيل المثال ، Tnf، Il1b، Nos2، و Nfkb29 (الشكل 4ه).

هنا نقدم إجراءات لعزل الخلايا الصغيرة من القشرة ، المخيخ ، الحصين والمخطط من نصف الكره الدماغية الماوس الكبار ، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهوله إلى مناطق أخرى أو مراحل. وهذا مفيد للحالات ، علي سبيل المثال ، عندما تقتصر الخلايا الصغيرة المصابة بالمرض علي مناطق معينه من الدماغ يمكن تشريحها ، أو في دراسات الشيخوخة ، حيث تكون عينات التجميع غير ملائمة بسبب اختلافات فرديه كبيره. مع توافر الأجسام المضادة ضد الاوعيه الدقيقة (أو المناعية الفطرية) ، يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لعزل الخلايا الصغيرة في الفئران أو الانسجه البشرية9. عند التكيف مع الانسجه الكبيرة أو القديمة ، من المهم النظر واختبار حجم الحبيبات-أزاله الخرز ونوع الاعمده المستخدمة. مقاربه بديله ل [ميملين] أزاله بكثافة تدرج طرد في أوساط [لوو-لزوجه] تجاريه20. عموما هذه طريقتين قابله للمقارنة في كفاءتها ، علي الرغم من ان الكثافة التدرج طرد الأسلوب قد توفر غله اعلي قليلا ، ومن ناحية أخرى ، وطريقه الخرز المغناطيسي هو اقل عرضه لإدخال السموم الثنائية ، والتي قد تنشط الخلايا الصغرى21،22.

بسبب النسبة المئوية الصغيرة من الخلايا الدقيقة في الدماغ الكلي ، غالبا ما يكون من الضروري إثراء أو تنقيه الكريات الصغرى قبل القيام بالدراسات الناسخة أحاديه الخلية. نحن نستخدم FACS كنهج حساس للتقاط أنواع الخلايا التي تمثل المتواضع ، وحدد الصغيرة التي تعتمد علي CD11b و CD45 التعبير السطحي. من نصف الكره الارضيه ، ونحن بشكل روتيني الحصول علي ~ 30,000 الخلايا الدقيقة لقشره ، و ~ 5,000 ميكروليا لمخيخ ، الحصين أو سترياتوم. هذه الغلة كافيه لمعظم التطبيقات أحاديه الخلية ، فضلا عن الجزء الأكبر RNA-seq (3,000 أو أكثر يمكن استخدام الخلايا). ومن الجدير بالذكر ان الخلايا الصغيرة قد upregulate CD45 النشاط المناعي خلال التنمية أو المرض2، وفي هذه الحالة يجب ان يتم تسجيل الخلية مع كل من مستويات منخفضه وعاليه من CD45 وتصنيفها الفهرس للتحليل. خيار آخر لإثراء الميكروبات الصغيرة هو استخدام CD11b الخرز-بوساطة المغناطيسي تنشيط الفرز الخلية بعد أزاله المايلين ، ولكن هذا من شانه ان يحد من scrna-seq إلى طرق الحبريه.

لدراسة التعبير الجيني ميكروجليال في قرار خليه واحده ، ونحن عاده فرز الخلايا إلى ما لا يقل عن 2 − 3 96 لوحات البئر لكل عينه وأداء اعداد المكتبة مع آلات مناوله السائل. وقد تبين ان هذا النهج القائم علي ألواح بالطول الكامل لاعداد المكتبات هو واحد من أكثر الأساليب التي تتبعها scrna-seq في الحد من الكشف ، مما يسمح بتحديد كميات دقيقه من النصوص النادرة ، مثل عوامل النسخ13و14و16. وبسبب التسلسل الكامل الطول ، لا يخضع هذا النهج للتحيز 5 ' أو 3 ' ويمكن استخدامه لتحليل متغيرات الربط (الجدول 3). وهذا مفيد عند دراسة مجموعات فرعيه صغيره من الخلايا الصغيرة في ظروف معينه مثل النمو الجنيني.

في حين ان هذا البروتوكول يولد التكرار عاليه الجودة المكتبات المتسلسلة للدماغ الاقليميه الصغرى ، فانه غالبا ما تكون مناسبه فقط للدراسات علي نطاق صغير نظرا للتكلفة العالية نسبيا (حوالي 5 دولار/خليه لاعداد المكتبة ، لا تزال أرخص من $23/cell إذا باستخدام قباله الرف SmartSeq v4 عده). يمكن للعديد من الاستراتيجيات المساعدة في تقليل التكلفة وزيادة الانتاجيه. أولا ، يمكن فرز الخلايا في لوحات 384 بشكل جيد مع اقل قدر 0.5 μL من تحلل العازلة ، وهذا يتطلب فقط 1/8 مجلدات الكواشف للنسخ العكسي الاولي وخطوات التضخيم PCR. الثانية ، فمن الممكن لإنتاج في المنزل Tn5 للترانسبوزاز التي لديها نوعيه مماثله واحده في مجموعه متاحه تجاريا23. يمكن لهذين التعديلين تقليل تكلفه اعداد المكتبة وصولا إلى 1/خليه. ثالثا ، باستخدام الفهارس المخصصة ، يمكن تجميع آلاف الخلايا معا للتسلسل علي نظام دون التضحية عمق التسلسل (> 1 مليون يقرا/خليه)17. هذه التحسينات إلى جانب دمج الروبوتات الألى التعامل مع السائل ، وسوف تمكن عاليه الانتاجيه العميقة scRNA-seq من الخلايا الصغيرة المعزولة من اي مناطق محدده تقريبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

نشكر ماريكو ل. بينيت ، ليانا نيكول بونانو ، و سبيروس دارمانيس لمساعدتهم خلال تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا المرفق المشترك لمؤسسه "ستانفورد" ، ولا سيما ميريديث وايغلارز وليزا نيكولز ؛ ين تران ، مايكل Eckart من البروتين ستانفورد ومرفق الحمض النووي (PAN) لدعمهم الكبير للتصوير. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه JPB ومؤسسه فنسنت j. Coates.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 M Betaine Sigma-Aldrich Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific Cat# 14185-052
1 M HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix Kapa Biosciences Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap Corning Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) Advanced Analytical Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A8806
DNase I Worthington Cat# LS002007 Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade Promega Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix Thermo Fisher Scientific Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl) New England BioLabs Cat# M0262S
Mouse Fc block BD Pharmingen Cat# 553142
Myelin removal beads Miltenyl Biotec Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit Illumina Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) Illumina Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific Cat# 70011044
PCRClean DX beads Aline Biosciences Cat# C-1003-50
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific Cat# P3566 Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermal Fisher Scientific Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) BioLegend Cat# 101236; RRID: AB_11203704 Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) Clontech Cat# 639538 Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		 (Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		 (Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)		 (Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific VWR 89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates Bio-Rad HSP9631
Others
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml Wheaton 357422
Large depletion column Miltenyi Biotec 130-042-901
Large selection column Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RNAzap Thermo Fisher Scientific AM9780
Strainer (70 μm) Falcon 352350
Equipment
BD FACSAria II BD Biosciences http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer Agilent 2100
Fragment Analyzer Agilent 5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot TTP Labtech https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Tags

العلوم العصبية ، الإصدار 154 ، الخلايا الصغيرة ، العزلة ، منطقه المخ ، الفرز الخلوي المنشط ، تسلسل الحمض الريبي أحاديه الخلية ، المناعة العصبية ، التغاير
عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, L., Li, Q. Isolation of… More

Zhou, L., Li, Q. Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (154), e60347, doi:10.3791/60347 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter