Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung
Summary
Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.
Abstract
Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.
Introduction
Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreuteMakrophagen. Geschützt hinter Blut – Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten1,2,3,4verbunden ist. Jüngste spannende Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Mikroglia keineswegs passive Zuschauer von hirnabgeleiteten oder pathologischen Signalen sind, sondern eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Gehirnentwicklung und Homöostase spielen, beispielsweise durch die Unterstützung des neuronalen Überlebens, das Beschnitt unreifer Synapsen, die Förderung der Differenzierung von Oligodendrozyten-Linienzellen sowie die Angiogenese1. Da mehr Funktionen von Mikroglia aufgeklärt werden, wird die Aufregung durch humangenetische Studien weiter angeheizt, die zeigten, dass viele neurodegenerative Krankheitsrisikogene, wie TREM2, überwiegend oder ausschließlich durch Mikroglia5,6,7ausgedrückt werden. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und der plausiblen rolle der Krankheit wurden in letzter Zeit enorme Anstrengungen unternommen, um unser Verständnis der mikroglialen Genregulation und -funktion zu verstehen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele für neurodegenerative Erkrankungen zu finden1,8.
Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ermöglicht eine unvoreingenommene Charakterisierung der zelltypspezifischen Genexpression, was wiederum Wissenschaftler bei der Untersuchung von Genfunktionen in dichten Zellnetzen leitet7. RNA-seq wurde hauptsächlich auf Massenproben durchgeführt, was zur Entdeckung einer panostatischen mikrogliaalen Gensignatur führte, die sie von anderen neuronalen und Immunzellen unterscheidet9. Ein solcher Ansatz könnte jedoch molekulare und funktionelle Unterschiede zwischen Mikroglia übersehen, insbesondere solche, die vorübergehend in der Entwicklung vorhanden sind oder mit Alterung und Krankheit in Verbindung gebracht werden. Tatsächlich bietet einzellige RNA-seq (scRNA-seq) die Empfindlichkeit und Auflösung, die das Feld revolutioniert haben, indem sie zuvor unterschätzte Heterogenität von Mikroglia in einer Vielzahl von Kontexten2,3,10. Darüber hinaus liefert scRNA-seq aufgrund des Vorhandenseins anderer ähnlicher Immunzellen an der CNS-Zirkulationsschnittstelle Informationen, die das Design neuer Werkzeuge unterstützen, um diese verwandten Zellen mit wenig Vorkenntnissen zu trennen und funktionell zu sezieren2,11.
Es wurde eine Vielzahl von scRNA-seq-Plattformen erfunden, die jeweils für bestimmte Anwendungen geeignet sind12. Im Allgemeinen sind tröpfchenbasierte Methoden, wie z. B. 10x Genomics, höher im Durchsatz mit (Zehntausenden) Tausenden von Zellen, die in jedem Durchlauf sequenziert werden, und sie sind weniger selektiv für die Eingabe, die gemischte Zellpopulationen enthalten kann, die eine umfassende Kategorisierung erfordern. Plattenbasierte Methoden bieten eine höhere Empfindlichkeit und Lesetiefe13,14, in der Regel auf bestimmte Populationen aus der Zellsortierung abzielen, um subtile Unterschiede oder seltene Transkripte aufzudecken. Angesichts des geringen Anteils mikrogliar alataler Zellen, insbesondere dieser entwicklungs- oder krankheitsassoziierten Subpopulationen, unter allen ZNS-Zelltypen ist es oft wünschenswert, Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion zu isolieren und tiefe und umfassende transkriptomische Informationen zu erhalten, um ihre Heterogenität zu verstehen.
Hier bieten wir Details, wie Mikroglia aus verschiedenen Maushirnregionen isoliert werden kann, die von einer einzigen Hemisphäre seziert werden, die nach einem halbautomatischen plattenbasierten Bibliotheksvorbereitungsverfahren für einzellige (oder Massen-) RNA-Seq verwendet werden. Die andere Hemisphäre kann dann für die histologische Validierung verwendet werden. Optimiert von einer zuvor veröffentlichten Methode9zielt dieses Isolationsprotokoll darauf ab, den Ertrag aus einer geringen Menge an Ausgangsmaterialien zu maximieren und in der Zwischenzeit endogene mikrogliaale Genexpressionsprofile zu pflegen. Wir verwenden fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um Mikroglia (oder andere verwandte Immunzellen von Interesse) in 96-Well-Platten anzureichern und die Volumen von Reagenzien für die Bibliotheksvorbereitung zu miniaturisieren, um den Durchsatz zu erhöhen. Wir heben diese sensible scRNA-seq-Plattform hervor, obwohl andere plattenbasierte Strategien angewendet werden können. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Mikroglia von anderen sezierten Geweben zu isolieren, wie Verletzungen oder Krankheitsherde, und das Alter der Maus kann in fast jedem postnatalen Stadium variieren. Eine effiziente Isolierung regionaler Mikroglia für einzellige Transkriptomikstudien wird ein besseres Verständnis ihrer Funktionen bei Gesundheit und Krankheit erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode9gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente wer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno und Spyros Darmanis für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken auch der Stanford Shared FACS Facility, insbesondere Meredith Weglarz und Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart von Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) für ihre große Unterstützung bei den Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von der JPB Foundation und der Vincent J. Coates Foundation finanziert.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
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