Summary

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Published: December 03, 2019
doi:

Summary

Forniamo un protocollo per l’isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell’RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l’eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Abstract

Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l’omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l’avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un’ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell’RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l’adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.

Introduction

Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)1. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell’omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l’asgiogenesi1 . Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l’eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative1,8.

Il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell’espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense7. L’RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie9. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all’invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l’eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all’interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente2,11.

È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni12. In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l’input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un’ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l’eterogeneità.

Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l’RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L’altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l’età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L’isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio. NOT:</ Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali. 1. Preparazione il giorno …

Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l’efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare …

Discussion

Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temper…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis per il loro aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche lo Stanford Shared FACS Facility, in particolare Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart di Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) per il loro grande supporto per le riprese. Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione JPB e dalla Fondazione Vincent J. Coates.

Materials

5 M Betaine Sigma-Aldrich Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific Cat# 14185-052
1 M HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix Kapa Biosciences Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap Corning Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) Advanced Analytical Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A8806
DNase I Worthington Cat# LS002007 Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade Promega Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix Thermo Fisher Scientific Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl) New England BioLabs Cat# M0262S
Mouse Fc block BD Pharmingen Cat# 553142
Myelin removal beads Miltenyl Biotec Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit Illumina Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) Illumina Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific Cat# 70011044
PCRClean DX beads Aline Biosciences Cat# C-1003-50
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific Cat# P3566 Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermal Fisher Scientific Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) BioLegend Cat# 101236; RRID: AB_11203704 Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) Clontech Cat# 639538 Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'
(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'
(Picelli et al., 2014)
TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)
(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific VWR 89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates Bio-Rad HSP9631
Others
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml Wheaton 357422
Large depletion column Miltenyi Biotec 130-042-901
Large selection column Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RNAzap Thermo Fisher Scientific AM9780
Strainer (70 μm) Falcon 352350
Equipment
BD FACSAria II BD Biosciences http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer Agilent 2100
Fragment Analyzer Agilent 5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot TTP Labtech https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226

References

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhou, L., Li, Q. Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (154), e60347, doi:10.3791/60347 (2019).

View Video