Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering
Summary
Vi tilbyr en protokoll for isolering av mikroglia fra ulike dissekert regioner av en voksen mus hjerne halvkule, etterfulgt av semi-automatisert bibliotek forberedelse for dyp enkelt celle RNA sekvensering av full lengde transcriptomes. Denne metoden vil bidra til å belyse funksjonell heterogenitet av mikroglia i helse og sykdom.
Abstract
Som bosatt makrofager i det sentrale nervesystemet, mikroglia aktivt kontrollere hjernens utvikling og homeostase, og deres dysfunksjoner kan drive menneskelige sykdommer. Det er gjort betydelige fremskritt for å avdekke de molekylære signaturene av homøostatisk mikroglia samt endringer av deres genuttrykk som svar på miljømessige stimuli. Med bruk og modning av single-Cell genomisk metoder, er det stadig mer anerkjent at heterogene mikroglia kan ligger til grunn de ulike rollene de spiller i ulike utviklingsmessige og patologiske forhold. Ytterligere Disseksjon av slike heterogenitet kan oppnås gjennom effektiv isolering av mikroglia fra en gitt region av interesse, etterfulgt av følsom profilering av individuelle celler. Her gir vi en detaljert protokoll for rask isolering av mikroglia fra ulike hjernens regioner i en enkelt voksen mus hjerne halvkule. Vi viser også hvordan du bruker disse sorterte mikroglia for plate BAS ert, dyp enkelt celle RNA-sekvenser. Vi diskuterer tilpasning av denne metoden til andre scenarier og gir retningslinjer for å forbedre systemet for å imøtekomme store studier.
Introduction
Mikroglia, som representerer 5% − 10% av alle nevrale celler, er bosatt makrofager spredt over hele det sentrale nervesystemet (CNS)1. Beskyttet bak blod-hjerne barriere, typisk mikroglia i en sunn voksen hjernen inneholder mange fine prosesser som raskt utvide og trekke seg tilbake til å samhandle med neurons og andre gliacellene celler i parenchyma. Mikroglia kan også vedta Amoeboid morfologi forbundet med økt phagocytic funksjon under bestemte utviklingstrinn eller på immun utfordringer i skade og sykdom1,2,3,4. Nylige spennende oppdagelser har tydelig vist at mikroglia er på ingen måte passive tilskuere til hjerne-avledet eller patologiske signaler, men spiller avgjørende roller i å kontrollere hjernens utvikling og homeostase, for eksempel ved å støtte neuronal overlevelse, beskjæring umodne synapser, fremme oligodendrocyte avstamning celler differensiering samt angiogenese1. Som flere funksjoner mikroglia er belyst, spenningen er ytterligere fueled av Human genetikk studier, som viste at mange nevrodegenerative sykdom risiko gener, som TREM2, er overveiende eller utelukkende uttrykt av mikroglia5,6,7. Gitt sin betydning i utvikling og sannsynlig sykdom-kjøring roller, har enorm innsats nylig blitt satt mot vår forståelse av mikrogliaaggregater gen regulering og funksjon i håp om å finne nye terapeutiske mål for nevrodegenerative sykdommer1,8.
RNA sekvensering (RNA-SEQ) tillater objektiv karakterisering av celle type-spesifikke genuttrykk, som i sin tur veileder forskere til å undersøke gen funksjoner i tette mobilnettverk7. RNA-SEQ hadde vært stort sett gjort på bulk prøver, fører til oppdagelsen av en homøostatisk mikrogliaaggregater gen signatur som skiller dem fra andre nevrale og immune celler9. Imidlertid kan en slik tilnærming overse molekylære og funksjonelle forskjeller blant mikroglia, spesielt de midlertidig stede i utvikling, eller forbundet med aldring og sykdom. Faktisk, enkelt celle RNA-SEQ (scRNA-SEQ) tilbyr følsomhet og oppløsning som har revolusjonert feltet ved å avsløre tidligere underappreciated heterogenitet av mikroglia i en rekke sammenhenger2,3,10. I tillegg, på grunn av tilstedeværelsen av andre lignende immunceller på CNS-sirkulasjon grensesnitt, scRNA-SEQ gir informasjon hjelpe utformingen av nye verktøy for å skille og funksjonelt analysere disse relaterte celler med litt tidligere kunnskap2,11.
En mangfoldig oppstille av scRNA-SEQ plattform ha blitt konstruere, hver egnet til bestemt søknadene12. Generelt er dråpe BAS ert metoder, for eksempel 10x Genomics, høyere i gjennomstrømming med (titusenvis av) celler sekvensielt i hver kjøring, og de er mindre selektive for innspill som kan inneholde blandet celle populasjoner som krever bred kategorisering. Plate BAS ert metoder gir høyere følsomhet og lese dybde13,14, vanligvis rettet mot bestemte populasjoner fra celle sortering for å avdekke subtile forskjeller eller sjeldne transkripsjoner. Gitt den lille prosentandelen av mikrogliaaggregater celler, spesielt de utvikling-eller sykdoms-assosiert subpopulasjoner, blant alle CNS celletyper, er det ofte ønskelig å isolere mikroglia fra en bestemt region av interesse og få dyp og full-lengde transcriptomic informasjon for å forstå deres heterogenitet.
Her gir vi informasjon om hvordan du isolerer mikroglia fra ulike mus hjernen regioner dissekert fra en enkelt halvkule, som brukes for én celle (eller bulk) RNA-SEQ etter en semi-automatisert plate-basert bibliotek forberedelse prosedyre. Den andre halvkule kan deretter brukes til histologiske validering. Strømlinjeformet fra en tidligere publisert metode9, denne isolasjons protokollen har som mål å maksimere avkastningen fra små mengder av Start materialer, og i mellomtiden opprettholde endogene mikrogliaaggregater genuttrykk profiler. Vi bruker fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for å berike mikroglia (eller andre relaterte immunceller av interesse) i 96-brønn plater og miniaturize volumene av reagenser for biblioteks forberedelser for å øke gjennomstrømningen. Vi fremhever denne følsomme scRNA-SEQ-plattformen, selv om andre plate-baserte strategier kan brukes. Denne metoden kan lett tilpasses til å isolere mikroglia fra andre dissekert vev, slik som skade eller sykdoms prioriteringer, og alder av musen kan variere over nesten alle postnatal etapper. Effektiv isolering av regionale mikroglia for enkelt celle transcriptomics studier vil gjøre det lettere å forstå deres funksjoner i helse og sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia aktivt samhandle med andre celletyper i CNS, og de er svært følsomme for miljømessige stimuli. For å minimere inflammatoriske reaksjoner og avvikende endringer i deres genuttrykk i løpet av isolasjons prosessen, har denne protokollen blitt strømlinjeformet fra en tidligere publisert metode9, og det er nå egnet til å isolere mikroglia fra flere regioner av en enkelt mus hjerne halvkule parallelt. Vev og reagenser holdes ved kald temperatur og eksperimenter utføres innen rimelig t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mariko L. Bennett, Liana Nicole bonanno, og Spyros Darmanis for deres hjelp under utviklingen av denne protokollen. Vi takker også Stanford Shared FACS Facility, særlig Meredith Weglarz og Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart fra Stanford protein og nukleinsyre acid Facility (PAN) for sin store støtte til filming. Dette arbeidet er finansiert av JPB Foundation og Vincent J. Coates Foundation.
Materials
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' – AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' – AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer’s disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).
