Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60369
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Sciences, Smith College, 2Center for Microscopy and Imaging, Smith College

Summary

Målet med denne protokollen er å danne ensembler av molekylære motorer på DNA Origami nanostrukturer og observere ensemblet motilitet bruker Total intern refleksjon fluorescens mikroskopi.

Abstract

Cytoskjelettkomponenter motorer er ansvarlig for en rekke funksjoner i eukaryote celler, inkludert mitose, Last transport, cellulær motilitet, og andre. Mange av disse funksjonene krever motorer for å operere i ensembler. Til tross for et vell av kunnskap om mekanismer for individuelle cytoskjelettkomponenter motorer, relativt mindre er kjent om mekanismer og emergent atferd av motor ensembler, eksempler som inkluderer endringer i ensemble processivity og hastighet med endre motor nummer, plassering og konfigurasjon. Strukturelle DNA nanoteknologi, og den spesifikke teknikken av DNA Origami, gjør at molekylær konstruksjon av veldefinerte arkitekturer av motor ensembler. Formen på Last strukturer så vel som type, antall og plassering av motorer på strukturen kan alle styres. Her gir vi detaljerte protokoller for å produsere disse ensembler og observere dem ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi. Selv om disse teknikkene er spesielt søkt om cytoskjelettkomponenter motorer, metodene er generaliserings til andre proteiner som monterer i komplekser å utføre sine oppgaver. Overall, DNA Origami metoden for å skape veldefinerte ensembler av motor proteiner gir et kraftig verktøy for dissekere mekanismene som fører til emergent aktive oppførsel.

Introduction

Dynein og kinesin er cytoskjelettkomponenter motor proteiner som er ansvarlige for utallige funksjoner i eukaryote celler1. Ved å konvertere den kjemiske energien av ATP hydrolyse til produktivt arbeid, disse motorene translocate på mikrotubuli å hale og distribuere ulike intracellulære cargos. De koordinerer også i den massive intracellulære rearrangements assosiert med mitose, der de viser organiserte styrker som bidrar til posisjonering og separasjon av kromosomer. Strukturelle, biokjemiske og Biofysiske analyser, inkludert enkelt molekyl observasjoner, har avdekket mekanismene til disse motorene på det individuelle nivå (godt gjennomgått i tidligere arbeider2,3,4). Mange av Motors oppgavene krever imidlertid at de arbeider i små ensembler av både lignende og blandede motortyper. Relativt mindre er forstått om mekanismene som koordinerer aktiviteten og Ultimate emergent motilitet av disse ensembler5,6. Denne kunnskaps gapet skyldes delvis til vanskeligheter med å skape ensembler med kontrollerbar funksjoner, for eksempel motortype og kopi nummer. I løpet av det siste tiåret, den molekylære konstruksjonen teknikker av DNA Origami har vært ansatt for å løse dette problemet. For mikrotubulinettverket baserte motorer inkluderer noen eksempler på disse undersøkelsene enkelt molekyl observasjoner av ensembler av cytoplasmatiske dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, ulike kinesin Motors12,13, og blandinger av både dyneins og kinesins7,14,15. Her gir vi detaljer om rensing og oligonukleotid merking av motorer fra gjær7,16,17,18,19,20, den folding og rensing av segmentert DNA Origami med tunable Compliance8, og Imaging av gjær motorer propelling chassis strukturer7,18.

Konstruere motor ensembler for in vitro enkelt molekyl observasjon krever tre primære innsats. Den første er uttrykket, rensing og merking av motor konstruksjoner egnet for å feste til DNA Origami. Den andre er produksjon og rensing av definerte DNA Origami strukturer (ofte betegnet som "chassis"). Og den tredje er Bøyning av motorene til chassis strukturen etterfulgt av observasjon ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Her gir vi etablerte protokoller for denne prosessen for rekombinant mikrotubulinettverket-baserte motorer renset fra gjær Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. DNA Origami-baserte motor ensembler har blitt undersøkt ved hjelp av både rekombinant kinesin15 og dynein7,8,18 konstruksjoner produsert i denne gjær Expression system16 ,17,18,19. Denne protokollen er gyldig for disse konstruerer, gitt at de er kontrollert av galaktose indusert promoter, og smeltet til samme protein koder for rensing (ZZ og TEV protease linker) og for DNA oligo Bøyning (SNAPtag).

Spesifikke gjær stammer produsere spesifikke motor konstruksjoner. For eksempel ble dynein brukt til å studere rollen som Cargo Compliance ble renset fra stamme RPY10847,8. Generelt, stammer som inneholder motor konstruksjoner med riktig genetiske modifikasjoner for uttrykk og rensing kan forespørres fra laboratoriene har publisert bruken av disse motorene. Konstruerer med romanen attributter som mutasjoner eller koder kan gjøres ved hjelp av rekombinant genetiske teknikker, slik som litium acetate transformasjon21 og kommersielle kits. Detaljerte protokoller for å lage modifiserte motor proteiner i gjær for enkelt molekyl studier har blitt publisert19. I tillegg til motorene som blir smeltet til SNAPtag, må oligos som brukes til å merke motorene, bøyes til SNAP-underlaget, benzylguanine (BG); tidligere publiserte protokoller beskriver dannelse og rensing av BG-oligo konjugater18. Den overordnede strategien som er beskrevet her, har også vært ansatt for utgangen-baserte motorer (se tidligere arbeider for eksempel22,23,24) og motorer renset fra andre organismer og uttrykks systemer (se forrige fungerer for eksempel7,9,10,11,12,13,14).

Polymerisert mikrotubuli (MTs) brukes i disse eksperimentene i to forskjellige prosedyrer. MT affinitet rensing av funksjonelle motorer krever MTs som ikke er merket med andre funksjonelle grupper, mens motor-ensemble motilitet TIRF analysen krever MTs merket med biotin og fluorophores. I alle tilfeller stabiliseres MTs med taxol for å hindre denaturering. MT affinitet rensing trinn brukes til å fjerne alle ikke-aktive motorer med høy MT affinitet, som disse motorene kan endre ensemble motilitet hvis bøyd til et chassis. Under denne prosessen vil aktive motorer frigi MTs og forbli i løsningen, mens tette motorer spinner ned i MT-pellet. Dette bidrar til å sikre at alle motorene på kabinettet er fra en aktiv populasjon.

En rekke DNA Origami strukturer har blitt brukt til å studere cytoskjelettkomponenter motor ensembler. Som mekanistisk forståelse av ensemblet transport har økt, DNA Origami strukturer ansatt i eksperimenter har vokst i kompleksitet. I prinsippet kan enhver struktur være tilpasset dette formålet forutsatt at det er modifisert til å omfatte single-strandet DNA feste steder for motorer og fluorophores. Spesifikke chassis design og attributter kan være nyttig for undersøkelser spesielle spørsmål om emergent atferden til motorer ensembler. For eksempel har stive stenger blitt brukt til å utvikle grunnleggende kunnskap om hvordan kopi nummer påvirker transport av lag med dyneins og kinesins7,15,18og 2D-plattformer har blitt brukt til å studere myosin ensemble navigering i utgangen nettverk22. Strukturer med variabel eller tunable fleksibilitet har blitt brukt til å forstå rollene til elastisk kopling mellom motorer og å granske hvordan stepping synkronisering påvirker motilitet8,24. Flere nylig, sfærisk strukturer blir brukt til å få innsikt i hvordan geometriske begrensninger til motor-spor bindende påvirker dynamikken i motilitet25.

I denne protokollen tilbyr vi spesifikke trinn for ensemble eksperimenter på segmentert chassis med variabel stivhet. Bindende områder på kabinettet er noen ganger referert til som "håndtak", mens komplementære DNA-sekvenser som binder disse håndtakene kalles "antihandles". Antall motorer på disse chassis bestemmes av hvilke segmenter inneholder utvidet håndtak stifter med komplementaritet til antihandle oligo på oligo-merkede motorer. Bruk av forskjellige håndtak sekvenser på ulike segmenter gjør det mulig å binde forskjellige typer motorer til bestemte steder på kabinettet. Chassiset som er beskrevet her, består av 7 sekvensielle stive segmenter, som hver består av 12 dobbelt strandet DNA-helikser arrangert i 2 konsentriske ringer8. De stive segmenter inneholder motor håndtak og er koblet gjennom regioner som kan være enten fleksibel single-strandet DNA eller stive dobbel-strandet DNA, avhengig av fravær eller tilstedeværelse, henholdsvis av "linker" stifter. Overholdelse av chassis strukturen er således bestemt av tilstedeværelsen eller fraværet av disse "linker" stifter. Se tidligere rapporter for ytterligere detaljer og spesifikke DNA-sekvenser8. I tillegg kan flere metoder brukes til å rense chassis26. The rate-sonebasert glyserol gradient sentrifugering metode27 er beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vekst, uttrykk og høsting av motor proteiner styrt av en galaktose indusert promoter

  1. Ved hjelp av en gjær-peptone-druesukker (YPD) kultur plate og en steril vaksinere pinne, strek ønsket frossen gjær belastning og ruge for 3-4 dager ved 30 ° c.
  2. Dag 1 av kultur vekst: på ettermiddagen, tilsett 10 mL YP kultur medier med 2% druesukker til en 1 "diameter glass kultur rør og vaksinere det med en enkelt koloni fra tallerkenen. Vokser i en raskt roterende valse trommel ved 30 ° c over natten.
  3. Dag 2: på ettermiddagen overfører du 10 mL kultur til en 250 mL kolbe som inneholder 50 mL YP kultur medier med 2% raffinose. Ruge over natten ved 30 ° c mens du rister ved 250 RPM på en orbital shaker.
  4. Dag 3: på ettermiddagen overfører du 60 mL av kulturen til en 3 L kolbe som inneholder 1 L YP kultur Media med 2% galaktose. Ruge over natten ved 30 ° c mens du rister ved 250 RPM på en orbital shaker.
  5. Dag 4: starter i midten av morgenen, overvåke den optiske tettheten (OD) av kulturen ved 600 NM hver 2 h. Når kulturen er mellom en OD 1,5 og 2, fortsetter du med følgende trinn for å høste cellene. Høsting utenfor denne OD-serien kan redusere avkastningen på grunn av lave celle tellinger før OD 1,5, eller cellulær fredfulle omgivelser og protein forringelse over OD 2.
  6. Dekanter celle kulturen i sentrifuge flasker og spinner ved ~ 6200 x g ved 4 ° c i 8 min. pour supernatanten og kast.
  7. Resuspend cellen pellet i flasken med dobbel-destillert H2o (ddH2O).
  8. Snurr cellene på ~ 6200 x g ved 4 ° c i 8 min. hell av supernatanten og kast den.
  9. Avhengig av viskositet av cellen pellet, tilsett opptil 2 mL ddH2O å skape en løsning væske nok for pipettering.
  10. Ved hjelp av en motorisert pipette Controller utstyrt med en 10 mL pipette, sakte dispensere cellen slurry i flytende nitrogen en dråpe om gangen. Dette vil produsere frosne pellets av gjærceller.
  11. Oppbevar de frosne cellene ved-80 ° c til de er klare til å rense.

2. rensing av motor proteiner fra gjærceller

  1. Cellelyse og løselig protein utvinning
    1. Forbered 1 mL av en frisk løsning av 0,1 M PMSF i ren etanol. Vent å legge til PMSF til vandige buffere som det er ustabilt i vann; også unngå eksponering for vann før innen 20 min (omtrentlig halveringstid av PMSF i vann) av bruk.
    2. Forbered 50 mL av 4X lyseringsbuffer på is med kosttilskudd fra 5x lager av lyseringsbuffer, men ikke Legg til PMSF før like før bufferen påføres gjær pellet.
    3. Grind den flytende nitrogen-frosne gjær pellets til et fint pulver med en blad-type kaffekvern som er pre-kjølt med flytende nitrogen.
      Merk: Dette protein utvinning vanligvis starter med cellen pellet høstet fra 2 L av gjær kultur. Den første mengden gjær kultur kan justeres opp eller ned med tilsvarende justeringer i volumene av IgG-perler og DNA-oligos i trinn 2.2.2 og 2.3.1 nedenfor.
    4. Alikvot 15 mL av 4X lyseringsbuffer med DTT og mg-ATP på is og Legg PMSF til buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 mM, fullføre utarbeidelsen av 4X lyseringsbuffer med kosttilskudd.
    5. Samle gjær pulver i en pre-kjølt ~ 100 mL glass beger på isen. Legg til et lite volum av 4X lyseringsbufferen med kosttilskudd i pulveret, slik at den endelige konsentrasjonen av bufferen ikke overstiger 1x. Vanligvis legger ~ 1,5 mL av buffer for hver 10 mL av gjær pulver.
    6. Tine raskt pulveret til væskefasen ved å plassere begeret i et vannbad på 37 ° c med konstant omrøring ved hjelp av en slikkepott.
    7. Plasser begeret med lysat tilbake på isen umiddelbart etter tine, anslå lysat volum ved hjelp av en 50 mL konisk rør, og legge til flere 4X lyseringsbuffer med kosttilskudd slik at den endelige konsentrasjonen av bufferen er ~ 1x. Vanligvis gir 2 L gjær kultur totalt 25-35 mL lysat som inneholder 1x lyseringsbuffer.
    8. Jevnt fordele lysat til sentrifuge flasker på is. Nøye balansere flaskene til en masse forskjell ikke mer enn 0,01 g mellom hvert par, slik at hver flaske er over minimums volumet som kreves for å hindre flaske kollaps. Sentrifuger på ~ 290 000 x g for 25 min ved 4 ° c.
    9. Samle supernatanten som inneholder løselige proteiner i en 50 mL konisk slange på is, og kast pellet som inneholder celle rusk og store organeller. Unngå å samle inn noen skyet deler av supernatanten, som de kan tette tyngdekraften-Flow kolonne som brukes i etterfølgende trinn. Lagre 10 μL av supernatanten for SDS-side analyse.
  2. Rensing av IgG-affinitet
    1. Under spin ovenfor, sette opp en tyngdekraft-Flow kromatografi kolonne på is eller i et kaldt rom.
    2. Overføring 200 μL av 50% IgG affinitet perle slurry til kolonnen ved hjelp av en P-1000 pipette spissen kuttet med et barberblad for å forstørre diameteren på sin inngangsport. Ved rensing mer eller mindre enn 2 L cellekultur pellet, Juster volumet av perle slurry proporsjonalt, med et minimum volum på 100 μL.
    3. Alikvot en annen 15 mL av 4X lyseringsbuffer med DTT og mg-ATP og legge PMSF til buffer for å oppnå en endelig konsentrasjon av 2mM. Fortynne 4X buffer på isen til 1x ved å legge ddH2O.
    4. Vask perlene 2x med 5 mL 1x lyseringsbuffer med kosttilskudd.
    5. Resuspend av perlene i 200, μL av 1x lyseringsbuffer med kosttilskudd.
    6. Tilsett perle suspensjonen til protein ekstrakt Hentet fra sentrifugering og ruge blandingen ved 4 ° c for 1 t med skånsom rotasjon.
    7. Under inkubasjons forbereder du 25 mL av vaske bufferen (oppskriften beskrevet i tabell 1) på is og 50 ml 1x TEV buffer (oppskriften beskrevet i tabell 1) på isen.
    8. Etter 1 h inkubasjons, Filtrer lysat-perlen blandingen på is eller i kaldt rom gjennom samme kromatografi kolonne som brukes i trinn 2.2.2 ovenfor. Spar 10 μL av gjennomstrømning for SDS-side analyse.
    9. Vask de resterende motor-bundet perler på is 2x med 5 mL vaskebuffer. Spar 10 μL av den første vasken for SDS-side analyse.
    10. Vask perlene på isen en gang med 5 mL 1x TEV buffer. Tillat at bufferen tømmes helt fra kolonnen.
  3. Merking med DNA-oligonukleotider og TEV-kløft
    1. Fjern den kromatografi kolonnen fra oppsettet og cap bunnen av kolonnen. I samme kolonne ruge motor perlene med 100 μL av 1x TEV buffer inneholdende 10-20 μM av renset BG-oligo ved romtemperatur (RT) i 10-15 min. Ved rensing mer eller mindre enn 2 L av cellekultur pellet, justere volumet av 1x TEV buffer og renset BG-oligos proporsjonalt. Øk inkubasjonstid i henhold til produsentens instruksjoner hvis nødvendig for å øke avkastningen og hastigheten på motor merking, men vær oppmerksom på at lengre inkubasjons ganger kan også øke andelen dysfunksjonelle motorer på grunn av protein denaturering ved RT.
    2. Resuspend forsiktig perlene hvert minutt av inkubasjons.
    3. Vask den merkede motor-perler 4X med 4 mL 1x TEV buffer ved hjelp av samme kromatografi kolonne og oppsett som før. La den endelige vasken renne helt fra søylen.
    4. Cap bunnen av kolonnen, resuspend motor-perler i mer enn 200 μL av 1x TEV buffer, og overføre til en 2 mL runde-Bottom mikrosentrifugen tube.
    5. Ruge suspensjonen med ~ 0,3 enheter av TEV protease per μL av motor perle blanding ved 16 ° c for 1 time med skånsom rotasjoner. Røret bør monteres for å minimere den totale overflateareal av røret som perlene kommer i kontakt.
    6. Sentrifuger røret i en mikrosentrifugen ved 21 130 x g for 30 s i et kaldt rom for å konsentrere blandingen på bunnen av røret.
    7. Fortsatt i kaldt rom, bruk en cut P-1000 pipette spissen for å overføre blandingen til en spin kolonne og sentrifuger på 21 130 x g for 30 s. samle Filtrer som inneholder TEV-kløyvde, renset motorer. TEV-protease vil være i Filtrer så vel som motorene.
    8. Lagre 10 μL av Filtrer for SDS-side analyse. Alikvot de resterende Filtrer i volumer på 2 μL for TIRF eksperimenter eller 50 μL for mikrotubulinettverket affinitet rensing. Flash fryse alikvoter i flytende nitrogen og lagre ved-80 ° c.
    9. Resuspend perlene igjen i filteret 1x TEV buffer for SDS-side analyse. Bruk samme volum av 1x TEV buffer som i trinn 2.3.4 ovenfor.

3. mikrotubulinettverket (MT) polymerisering

  1. Utarbeidelse av tubulin blandinger for TIRF-analyser
    1. I et kaldt rom, separat oppløse den lyofilisert tubulin av hver type (umerkede storfe tubulin, biotinylated tubulin, og fluorescerende tubulin) i rekonstituering buffer (oppskriften beskrevet i tabell 2) for å gjøre en endelig konsentrasjon av 10 mg/ml. La sitte på isen i 10 min.
      1. Bland følgende komponenter og la sitte på isen i 10 min i kaldt rom (endelige konsentrasjoner er indikert parenthetically): 18 μL av storfe tubulin (~ 8,2 mg/mL), 2 μL av biotinylated tubulin (~ 0,9 mg/mL), og 2 μL av fluorescerende tubulin (~ 0,9 mg/mL).
    2. Forbered 3 μL alikvoter av tubulin blandingen og blits fryse i flytende nitrogen. Oppbevar blandinger ved-80 ° c.
  2. Utarbeidelse av tubulin for MT affinitet rensing av motorer
    1. I et kaldt rom, oppløse lyofilisert storfe tubulin i rekonstituering buffer for å gjøre en endelig konsentrasjon av 10 mg/mL. La sitte på isen i 10 min.
    2. Forbered 3 μL alikvoter av tubulin blandingen og blits fryse i flytende nitrogen. Oppbevar blandinger ved-80 ° c.
  3. Polymerisering av tubulin inn i MTs
    1. Fjern en 3 μL alikvot av tubulin fra-80 ° c fryseren og svært raskt og kort tine til væskefasen ved å holde bunnen av røret. Plasser umiddelbart på is og ruge i minst 3 min.
    2. Lag 3 μL av 2x polymerisering mix (oppskriften beskrevet i tabell 2) oppå den tubulin løsningen. Bland ved å sveipe forsiktig i røret, men ikke bland med pipettering, som skjærkraft kan forstyrre MT kjernedannelse og forlengelse.
    3. Ruge blandingen i et vannbad ved 37 ° c i 30 min.
    4. Lag 6 μL av RT 1x BRB80 med kosttilskudd (oppskrift beskrevet i tabell 2) på toppen og bland ved å sveipe. Ikke bland med pipettering.
    5. Ruge blandingen ved 37 ° c i minst 10 min.
    6. Fortsett til MT affinitet rensing, eller hvis du gjør TIRF analyser, ruge MTs i mørket på RT over natten for å danne lengre MTs.
    7. Lagre polymerisert MTs for uker i mørket på RT.

4. mikrotubulinettverket (MT) affinitet rensing

  1. Fjerning av Upolymerisert tubulins av sentrifugering
    1. Bland følgende komponenter for å lage en 60% glyserol pute: 1x BRB80 (uten kosttilskudd; oppskriften beskrevet i tabell 2), 20 μM Taxol (OPPLØST i DMSO), 1 mm DTT, og 60% glyserol.
    2. Overfør 60 μL av glyserol puten til et ultracentrifuge rør. Lag 12 μL av den umerkede MTs-polymerisert tidligere oppå puten. For å hindre klipping av MTs, Overfør dem ved hjelp av en kuttet pipette spissen.
    3. Sentrifuger blandingen ved ~ 97 300 x g ved 22 ° c i 15 min. Etter spin blir overflødig tubulins værende i det øverste væske laget, mens MTs danner en pellet nederst. Merk ytterkanten av røret før spin for å hjelpe finne pellet, som pellet ikke kan være synlig med det blotte øye.
    4. Fjern forsiktig væske laget (~ 12 μL) over glyserol puten og lagre 10 μL for SDS-side analyse.
    5. Skyll forsiktig grensesnittet mellom væske laget og puten med 20 μL 1x BRB80 med kosttilskudd. Fjern og kast den 20 μL-skylling.
    6. Fjern forsiktig glyserol puten (~ 60 μL) og Spar 10 μL for SDS-side analyse. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer MT pellet.
    7. Skyll forsiktig pellet med 60 μL av 1x BRB80 med kosttilskudd (oppskrift beskrevet i tabell 2). Vær forsiktig så du ikke forstyrrer MT pellet. Kast skylle løsningen.
    8. Resuspend MT pellet i 24 μL av Taxol-supplert lyseringsbuffer (oppskriften beskrevet i tabell 3) ved hjelp av et kutt pipette spissen.
  2. Rensing av funksjonelle motorer med MT-basert affinitet kromatografi
    1. Fjern 2 50 μL alikvoter motorer renset fra gjær fra-80C fryseren og raskt tine til væskefasen. Umiddelbart sted på isen.
    2. Legg følgende komponenter til et nytt ultracentrifuge rør i den indikerte rekkefølgen og ruge blandingen ved RT i 10 min: (1) 100 μL av motorene renset fra gjær, (2) 29 μL av 5x ATP/Taxol mix (oppskrift beskrevet i tabell 3), deretter (3) 12 μL av renset MTS Tran sferred med et kutt pipette spissen.
    3. Sentrifuger blandingen ved ~ 97 300 x g og 22 ° c i 15 min. Etter spin blir funksjonelle motorer værende i supernatanten, og MTs danner en pellet, sammen med de ikke-funksjonelle motorene som er bundet til dem.
    4. Samle supernatanten, blits frysing i 2 μL alikvoter, og oppbevar ved-80 ° c.
    5. Lagre 10 μL av supernatanten for SDS-side analyse. Resuspend av pellet i 141 av 1x BRB80 for SDS-PAGE analyse, også. Bruk protein standarder, for eksempel utgangen, for å lage en standard kurve for å kvantifisere konsentrasjonen av renset motorene som tidligere beskrevet17.
    6. Bruk denne konsentrasjons informasjonen når bøye motorer til kabinettet i trinn 6.1.3.

5. produksjon av segmentert DNA Origami chassis

  1. Dannelse av chassis
    1. Bestill stifte oligonukleotider oppført i tidligere publiserte tabeller8 i 96 brønn plater våt på 250 ΜM i Tris buffer, eller tørr og deretter resuspend dem til 250 ΜM med Tris buffer.
    2. Lag en pool av kjerne stifter ved å blande 5 μL av hver kjerne stift (se tabell S1 i driller-Colangelo 20168).
    3. Lag en pool av linker kramper ved å blande 5 μL av hver linker stift (se linker stifte tabellen i driller-Colangelo 20168).
    4. Lag en pool av fluoroforen bindende stifter ved å blande 5 μL av hver fluoroforen håndtak (se fluoroforen håndtaks tabell i driller-Colangelo 20168).
    5. Bland 50 μL folding reaksjoner med følgende komponenter: 1x folding buffer; 100 nM 8064 stillas; 600 nM kjerne stifte basseng; 600 nM fluoroforen stifte basseng; 9 μM fluoroforen strand (se fluoroforen antihandle bord i driller-Colangelo 20168); for hver motor bindende område, enten 4,2 μM utvidet håndtere tråder eller 600 nM tråder uten håndtak som ønsket (se motor håndtak/antihandle stifter bord i driller-Colangelo 20168); 600 nM Linkers som ønsket8; ytterligere 6 mM MgCl2; og vann.
    6. Fold i en termisk cycler ved hjelp av følgende program: rask oppvarming til 80 ° c, kjøling i enkelt graders trinn til 65 ° c over 75 min, deretter ytterligere kjøling i enkelt graders trinn til 30 ° c over 17,5 h.
    7. Analysen folding kvalitet på en 2% agarose gel i 0,5 x TBE buffer (se Tabell 4 for oppskriften) supplert med 11 mm MgCl2 og DNA gel stain (se tabell over materialer). Kjør gel i 0,5 x TBE buffer supplert med 11 mM MgCl2 ved 70 V for 60-90 min. Kjør gels i et isvannbad eller i et kaldt rom for å hindre overdreven oppvarming og påfølgende denaturering av chassis strukturer.
    8. Image gelen ved hjelp av forhold som passer for DNA gel flekken som brukes i trinn 5.1.7.
  2. Rensing av chassis
    1. På slutten av ettermiddagen dagen før rensing, lage glyserol graderinger ved forsiktig lagdeling 80 μL hver av 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, og 15% glyserol i 1x Origami folding buffer i et sentrifugerør (se Tabell 4 for oppskrift). Grenser mellom lag bør være litt synlige.
    2. Ruge graderinger ved 4 ° c over natten.
    3. Neste morgen, tilsett 45% glyserol i 1x Origami folding buffer til foldet chassis løsning til en endelig konsentrasjon på 10% glyserol. Bland forsiktig og lag på toppen av gradient i sentrifuge røret.
    4. Snurr graderingen med chassiset ved 243 000 x g for 130 min. ved 4 ° c.
    5. Samle 50 μL fraksjoner fra røret i en topp til bunn retning.
    6. Cast en 2% agarose gel i 0,5 x TBE buffer supplert med 11 mM MgCl2 og DNA gel stain.
    7. Last 5 μL av hver brøk på gel og kjøre gel i 0,5 x TBE buffer supplert med 11 mM MgCl2 for 90-120 min ved 70 V. Run gels i et isvannbad eller i et kaldt rom for å hindre overdreven oppvarming og påfølgende denaturering av chassis strukturer.
    8. Image gelen ved hjelp av forhold som passer for DNA gel flekken som brukes i trinn 5.2.6.
    9. Velg brøker for fremtidige eksperimenter som utviser godt foldet, monomere strukturer som er fri for stifter.
    10. Kvantifisert konsentrasjoner av utvalgte fraksjoner ved hjelp av egnede spektroskopiske metoder, slik som UV absorpsjon ved 260 NM. Bruk denne konsentrasjons informasjonen når bøye motorer til kabinettet i trinn 6.1.3.

6. Making Slide analysen kamre

  1. Lag et lysbilde analysen kammer ved å stikke to strimler av dobbeltsidig tape til et glass lysbilde og plassere en dekkglass på toppen. Kammeret er den smale plassen klemt mellom dekkglass og glass slide, flankert av de to strimler av tape. Figur 1 illustrerer analyse kammeret.
  2. Når du klargjør lysbildet med løsninger, bruk en pipette til å strømme væske inn i kammeret fra den ene siden, og bruk en stripe av filter papir for å samle flyten av væsken på den andre siden.

7. motor-ensemble motilitet TIRF analysen

  1. Bøyning av motorer til DNA-chassis
    1. På is, Forbered fersk 1 mL hver av DTT-supplert BRB80, Taxol-supplert lyseringsbuffer, og kasein-Taxol-supplert lyseringsbuffer (oppskrifter beskrevet i tabell 5). Overfør 200 μL av hver buffer til et RT-rør.
    2. Fortsatt på isen, bruker den kalde kasein-Taxol-supplert lyseringsbuffer for å forberede 4X energi og 4X gatefeier mikser (oppskrifter beskrevet i tabell 5).
    3. Ruge 10 μL av ~ 300 nM-renset motorer med 5 μL ~ 10 nM DNA-kabinett på is for 15-30 min. Disse konsentrasjonene av motorer har vist å mette chassis ' motor bindings steder for denne inkubasjonstiden.
      Merk: motor Occupancy er ikke 100%, sannsynligvis på grunn av stochastically manglende håndtak stifter i individuelle kabinett strukturer8,28.
    4. Under inkubasjons, fortynne biotin-og fluoroforen-merket MTs 100 med RT Taxol-supplert lyseringsbuffer, og forberede en gel filtrering harpiks hensiktsmessig for størrelse utelukkelse kolonne kromatografi ved å følge fremgangsmåten nedenfor.
  2. Fjerning av overflødig motorer fra motor-chassis konjugater av størrelse utelukkelse kolonne kromatografi
    1. I et 50 mL konisk rør, vask 5 mL av gel filtrerings harpiks 2x med 45 mL ddH2O. For hver vask, bland harpiks med vann i det koniske røret, og snurr blandingen ved 460 x g i 1 min. kast supernatanten og lagre harpiks.
    2. Vask harpiks 2x med 45 mL 1x lyseringsbuffer (oppskriften beskrevet i tabell 5) med samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor.
    3. Resuspend den vasket harpiks i 1x lyseringsbuffer i en 1:1 ratio, slik at harpiks blir en ~ 50% slurry i buffer. Den vasket harpiks kan oppbevares ved 4 ° c i minst 1 måned.
    4. Overfør 800 μL av harpiks suspensjonen til en spin-kolonne. Tøm overflødig buffer med tyngdekraften flyt i 5 min. Fjern eventuelle gjenværende buffer med en 2 s spin på 1 000 x g. Det endelige harpiks volumet bør være rundt 350-400 μL.
    5. Fortynne motor-chassis blanding med kasein-Taxol-supplert lyseringsbuffer til et endelig volum på 50 μL. Overfør den fortynnede blandingen til Spin-søylen som er fullpakket med harpiks.
    6. Sentrifuger den spin kolonnen på 1 000 x g for 6 s (denne gangen er inkluderende av akselerasjon og retardasjon tid). Samle den rene motor-chassis konjugater ved å lagre Filtrer og forkaste kolonnen som beholder overflødig motorer.
  3. Utarbeidelse av lysbilder for bildebehandling
    1. Flow 13 μL av 1 mg/mL biotinylated i storfe-serum albumin (biotin-BSA) i et analyse kammer. Ruge for 2 min for å tillate binding av BSA til glass.
    2. Vask kammeret 2x med 20 μL av RT DTT-supplert BRB80 ved å strømme i bufferen på den ene siden av kammeret og fukttransport av overflødig væske bort fra den andre siden ved hjelp av en stripe av filter papir.
    3. Strømning i 20 μL av 0,5 mg/mL streptavidin. Ruge for 2 min for å tillate binding av streptavidin til biotin på BSA.
    4. Vask kammeret 2x med 20 μL av RT Taxol-supplert lyseringsbuffer.
    5. Skyll forsiktig i 20 μL av den fortynnede MTs med et kutt pipette spissen. Ruge for 2 min for å tillate binding mellom biotin på MTs og streptavidin.
    6. Vask 2x med 20 μL av RT kasein-Taxol-supplert lyseringsbuffer. Ruge for 2 min slik at kasein å trenge gjennom hele kammeret.
    7. Fortynne renset motor-chassis konjugater 5x til 10x til enkelt-molekylet forhold (~ 10-100 pM) med den kalde kasein-Taxol-supplert lyseringsbuffer. Bland sammen følgende komponenter for å produsere en endelig blanding av motor chassis: 10 μL av fortynning av motor-chassis, 5 μL av 4X energimiks, og 5 μL av 4X renovasjons miks.
    8. Flow i 20 μL av den endelige motor-chassis blandingen til analysen lysbilde kammeret og gå videre til TIRF mikroskopi.
  4. Bildebehandling og datainnhenting
    1. Bilde lysbildet umiddelbart med et TIRF-mikroskop. Vanligvis forblir hvert lysbilde brukbar for mellom 30 og 60 min.
    2. Skaff deg et stillbilde i MT-kanalen, og en film i chassis kanalen. For motorene i denne protokollen, 10 min filmer med en bildefrekvens på 0,5 FPS og eksponeringstid på 200 MS er hensiktsmessig.
    3. Fra chassis filmen, generere en kymograph for hver MT i ImageJ eller en lignende bildebehandling programvare29. Analysere hastigheter og kjøre lengder av motor-chassis ensembler ved å måle bakkene og horisontale avstander av kjører på kymograph30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket renselser av motorer og chassis strukturer ble analyseres av gel elektroforese. SDS-PAGE analyse bekreftet vellykket ekstraksjon av dynein fra gjær (figur 2), som den endelige Filtrer samlet i trinn 2.3.7 viste et klart, skarpt band i posisjonen til ~ 350 KDA. Som forventet var dette dynein bandet fraværende fra sonore og vask som fjernet uønskede proteiner, og perlene som dynein ble kløyvde. Observasjonen tyder på at IgG affinitet rensing og TEV protease kløft var begge svært effektiv. I tillegg var TEV protease også til stede i den endelige Filtrer og dannet et klart band på ~ 50 kDa.

Den vellykkede MT affinitet rensing av dynein og kinesin proteiner ble også bekreftet med SDS-side analyse (Figur 3). Mens dynein dukket opp som et klart enkelt band på ~ 350 kDa, viste kinesin opp som litt smøre flere band på ~ 120 kDa, muligens på grunn av tilstedeværelsen av både fosforylert og dephosphorylated former av proteinet14 og variable avlinger i oligo-merking. En sammenligning mellom dynein og kinesin band før og etter dette MT affinitet rensing avdekket en reduksjon i motorens konsentrasjon, som indikert av nedgangen i bandet intensitet, som var sannsynlig på grunn av fjerning av ikke-funksjonelle motorer. Til tross for reduksjonen var konsentrasjonen av motorer beholdt tilstrekkelig for effektive TIRF-analyser. I tillegg til TEV-protease, var en merkbar mengde tubulin (~ 51 kDa) tilstede i den endelige supernatanten, mest sannsynlig på grunn av gradvis nedbryting av MTs under eksperimentet, eller ufullstendig fjerning av overflødig tubulin gjennom sentrifugering. Men den konsekvente motilitet av motor-chassis ensembler vist i TIRF analyser tyder på at tubulin og TEV protease ikke forstyrrer motoriske funksjoner (se figur 6).

Folding av DNA Origami strukturer ble analyseres av agarose gel elektroforese. Figur 4 viser resultatene av en gel som analyserer folding av et fleksibelt segmentert kabinett med 2 motoriserte bindings områder. Skiftet i mobilitet mellom ren utfoldet stillas strand (Lane 1) og folding reaksjon (Lane 2) indikerer Origami folding. I tillegg indikerer folding reaksjonen i Lane 2 tilstedeværelsen av noen multimerization av chassis strukturer. Multimerization oppstår vanligvis, og krever påfølgende rensing av godt foldet monomere strukturer. Den kommunefritt overskudd stifter var også synlig, viser en høy grad av mobilitet gjennom gel.

Foldet Origami reaksjonene ble renset for å fjerne overflødig kommunefritt stifter og multimers av chassis strukturen. Figur 5 viser resultatene av en glyserol gradient rensing av et fleksibelt chassis med 7 motor bindende områder. De tidlige fraksjoner tilsvarer lav glyserol tetthet på toppen av røret. De inneholder overflødig stifter. De sene fraksjoner tilsvarer den høye glyserol tettheten i bunnen av røret og inneholder multimers og aggregater av foldet strukturer. I denne gelen angir brøk 7 en passende brøkdel som inneholder godt foldet monomere chassis. Legg merke til at den godt foldet strukturen er isolert fra både overflødig stifter og multimers. Selv om denne gelen er representativ, og fraksjon 7 ofte inneholder brukbar chassis, gir hver rensing eksperimentet litt forskjellige resultater og fraksjoner bør alltid være analyseres å finne ut hvilken brøkdel er best for motilitet analyser.

Den motilitet av motor-chassis ensembler er lett synlig og målbar på kymographs generert fra TIRF filmer. For eksempel, kymographs (figur 6) av fleksibelt kabinett som ble bøyd til syv dynein proteiner ("7d" ensembler) viser svært processive runs ved relativt konsekvente hastigheter, som viser at ensembler var aktive og aktive i rekonstituert system, og at MT affinitet rensing hell fjernet de fleste av de ikke-funksjonelle, Immobile dyneins som kunne langsom eller stall i ensembler. Det samme TIRF eksperimentet har blitt utført på andre chassis typer med ulike samsvars-og motor numre for å avdekke virkningene av disse faktorene på dynein samarbeid8,9.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av lysbildet analysen kammeret. Dekkglass sitter på toppen av to strimler av dobbeltsidig tape. Løsninger er Pipet tert i den ene siden, og ekstrahert med filter papir på den andre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SDS-side analyse av rensing av dynein fra gjær. Gjærceller var lysert og sentrifugert å samle lysat (Lane 1) som inneholder totalt løselig proteiner. Affinitet mellom IgG på kolonne perler og ZZ koden på rekombinant dynein konstruere ble utnyttet for denne rensing. Flyten gjennom (Lane 2) ble Hentet fra blandingen av lysat og perler etter at den passerte gjennom en kromatografi kolonne. Den dynein-bundet perler ble vasket med buffere, og den første vask med vaskebuffer (Lane 3) ble samlet. Dynein ble deretter bøyd til en DNA-oligo. Etter TEV protease kløft, sentrifugering i en spin kolonne separert Filtrer som inneholder dynein (Lane 4) og de resterende perlene (Lane 5). Alle prøvene som ble samlet inn fra rensingen ble denaturert med 1x LDS sample buffer og 1x reduksjons agent, og lastet på en 4-12% BIS-Tris gel. Gelen ble kjørt i 1x MOPPER buffer på 200 V for ~ 1 h, og beiset med SYPRO Red protein gel stain for Imaging under UV-lys. Det klare, skarpe bandet på ~ 350 kDa i Lane 4 indikerer at det er konsentrert renset dynein i den endelige Filtrer, mens bandet på ~ 50 kDa i samme kjørefelt indikerer at TEV-protease er tilstede. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SDS-side analyse av Mt affinitet rensing av funksjonelle dynein og kinesin proteiner. Kinesin og dynein renset fra gjær (Lanes 1 og 3) ble blandet med polymerisert MTs og ATP, og ultracentrifugation ble utført for å skille de funksjonelle motorene i supernatanter (kjørefelt 2 og 4) fra de ikke-funksjonelle motorene som co-pellets med MTs. Motoren prøvene før og etter rensing ble denaturert med 1x LDS sample buffer og 1x redusere agent, og lastet opp på en 4-12% BIS-Tris gel. Gelen ble kjørt i 1x MOPPER buffer på 200 V for ~ 1 h, og beiset med SYPRO Red protein gel stain for Imaging under UV-lys. Intensiteten av motor båndene (~ 120 kDa for kinesin, og ~ 350 kDa for dynein) syntes å avta etter MT affinitet rensing, noe som indikerer en reduksjon i motor konsentrasjonen. Merkbare konsentrasjoner av tubulin og TEV protease var til stede i den etter rensing motor prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Agarose gel analyse av FOLDET DNA Origami struktur. Foldet DNA Origami strukturer er vurdert av gel elektroforese. Lane 1 er den rene utfoldet stillaset tråden mens Lane 2 er produktet av folding reaksjon. Gel ble kjørt på 70 V i et isvannbad for 90 min i 0,5 x TBE buffer supplert med 11 mM MgCl2. Et skifte i mobilitet indikerer Origami folding. Kommune stifter og chassis multimers var også synlig i Lane 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Agarose gel analyse av glyserol gradient rensing av DNA Origami chassis. Kvaliteten på glyserol gradient rensing kan bestemmes av gel elektroforese av fraksjoner fra sentrifuge gradient. Lavt antall fraksjoner er fra toppen av røret og tilsvarer lav tetthet av glyserol. Høy nummererte fraksjoner er fra bunnen av røret og tilsvarer høy tetthet av glyserol. Overflødig stifter, monomere chassis og multimeric chassis er alle synlige. Brøkdel 7 inneholder chassis som egner seg for TIRF-mikroskopi, da de er monomere og overflødig stifter er fraværende. Gel ble kjørt på 70 V i et isvannbad for 120 min i 0,5 x TBE buffer supplert med 11 mM MgCl2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Kymographs viser motilitet av dynein-chassis ensembler på én MTS. Dynein proteiner utvunnet fra gjær og renset med MTs ble bøyd til fleksible kabinett strukturer. Hvert chassis hadde syv bindings steder for dynein og dannet et "7D" Ensemble. Bevegelsen av disse ensembler på MTs ble spilt inn i en 10 min film (200 MS eksponering, 0,5 FPS) under en TIRF analysen. Kymographs fra to MTs ble generert fra denne filmen i ImageJ ved å spore langs en enkelt MT. De vertikale og horisontale røde stolpene i øverste venstre hjørne av hvert bilde indikerer henholdsvis 2 min og 20 μm. Hver lyse linje registrerer bevegelsen av en ensemble, med den inverse av skråningen indikerer hastighet og horisontal forskyvning indikerer kjørelengde. Med TIRF analyser og kymography, motilitet av motor-chassis ensembler blir lett synlig og direkte målbare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navn på buffer Sammensetning Trinn (er) brukt Kommentar
5x lyse Rings buffer 150 mM HEPES (pH 7,4) - Filteret sterilisere bufferen. Det kan lagres på RT i en riktig lukket beholder for et år.
250 mM KAcetate
10 mM MgAcetate
5 mM EGTA (pH 7,5)
50% glyserol
4X lyse Rings buffer med kosttilskudd 4X lyse Rings buffer 2.1-2.2 Gjør denne 4X bufferen fra 5x lyseringsbufferen ovenfor. Forbered en buffer uten PMSF først, og tilsett sammensatt (oppløst i ren etanol) til en liten alikvot av bufferen rett før hvert trinn som krever det.
4 mM DTT
0,4 mM mg-ATP
2 mM PMSF
Vask buffer 1x lyse Rings buffer med kosttilskudd 2,2 For å gjøre bufferen, Legg KCl, Triton X-100, og ddH2O til 4X lyseringsbuffer med DTT og mg-ATP, men ikke Legg PMSF før rett før bruk.
250 mM KCl
0,1% Triton X-100
5x TEV buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) - Filteret sterilisere bufferen. Det kan lagres på RT i en riktig lukket beholder for et år.
150 mM KCl
10% glyserol
1x TEV buffer 1x TEV buffer 2.2-2.3 For å gjøre buffer, legge DTT, mg-ATP, Triton X-100, og ddH2O til 5X lager TEV buffer, men ikke legge PMSF før rett før bruk.
1 mM DTT
0,1 mM mg-ATP
0,1% Triton X-100
0,5 mM PMSF

Tabell 1: buffere for IgG affinitet rensing av motor proteiner fra gjærceller (protokoll Seksjon 2).

Navn på buffer Sammensetning Trinn (er) brukt Kommentar
5x BRB80 400 mM rør - Filteret sterilisere bufferen. Det kan lagres på RT i en riktig lukket beholder for et år.
10 mM MgCl2
5 mM EGTA
Juster pH til 6,8 med KOH
1x BRB80 med kosttilskudd 1x BRB80 3,3 & 4.1-4.2 Må være fersk laget av 5x BRB80 lager for hvert eksperiment.
20 μM Taxol (oppløst i DMSO)
1 mM DTT
2x polymerisering Mix 2x BRB80 (uten tillegg) 3,3 Flash fryse blandingen i små alikvoter og lagre på-80 oC.
2 mM DTT
2 mM mg-GTP
20% DMSO
Buffer for rekonstituering 1x BRB80 (uten tillegg) 3,1 Må være ferskt laget for hvert eksperiment.
1 mM DTT
1 mM mg-GTP

Tabell 2: buffere for polymerisering av mikrotubuli (protokoll seksjon 3).

Navn på buffer Sammensetning Trinn (er) brukt Kommentar
Taxol-supplert lyse Rings buffer 1x lyse Rings buffer 4,1 Må være ferskt laget for hver rensing.
20 μM Taxol (oppløst i DMSO)
1 mM DTT
5x ATP/Taxol Mix 1x lyse Rings buffer 4,2 Må være ferskt laget for hver rensing.
25 mM mg-ATP
50 μM Taxol (oppløst i DMSO)
5 mM DTT

Tabell 3: buffere for mikrotubulinettverket affinitet rensing av funksjonelle motor proteiner (protokoll seksjon 4).

Navn på buffer Sammensetning Trinn (er) brukt Kommentar
20x Origami folding buffer 100 mM Tris pH 8,0 - Kan lagres på RT i en riktig forseglet container i opptil et år.
20 mM EDTA
200 mM MgCl2
1x Origami folding buffer 5 mM Tris pH 8,0 5.1-5.2 Gjør bufferen frisk ved å fortynne den 20x lager med ddH2O før hvert eksperiment.
1 mM EDTA
10 mM MgCl2
0,5 x TBE 45 mM TrispH 8,0 5.1-5.2 Kan lagres på RT i en riktig forseglet container i opptil et år.
45 mM borsyre syre
1 mM EDTA

Tabell 4: buffere for produksjon av segmentert DNA Origami-kabinett (protokoll seksjon 5).

Navn på buffer Sammensetning Trinn (er) brukt Kommentar
DTT-supplert BRB80 1x BRB80 7,3 Må være ferskt gjort før hver TIRF eksperimentet.
1 mM DTT
Taxol-supplert lyse Rings buffer 1x lyse Rings buffer 7,1 & 7,3 Må være ferskt gjort før hver TIRF eksperimentet.
20 μM Taxol (oppløst i DMSO)
1 mM DTT
En kasein-Taxol-supplert lyse Rings buffer 1x lyse Rings buffer 7.1-7.3 Må være ferskt gjort før hver TIRF eksperimentet.
20 μM Taxol (oppløst i DMSO)
1 mM DTT
~ 2,5 mg/ml kasein (oppløst i Tris-HCl ved pH 8,0)
1x lyse Rings buffer 30 mM HEPES (pH 7,4) 7,2 Gjør denne bufferen frisk ved å fortynne 5x bestanden (oppskriften beskrevet i tabell 1) med ddH2O.
50 mM KAcetate
2 mM MgAcetate
1 mM EGTA (pH 7,5)
10% glyserol
4X Energimiks 22,5 μL 1x kasein-Taxol-Supplemenfted lyse Rings buffer 7,3 Må være ferskt gjort før hvert TIRF eksperiment; angitte volumene er for et endelig volum på 25 μL.
1 μL 0,1 M mg-ATP
1 μL 40% glukose
0,5 til μL β-Mercaptoethanol
4X renovasjons miks 24 μL 1x kasein-Taxol lyse Rings buffer 7,3 Må være ferskt gjort før hvert TIRF eksperiment; angitte volumene er for et endelig volum på 25 μL.
1 μL 1x oksygen renovasjons system

Tabell 5: buffere og mikser for motor-ensemble MOTILITET TIRF-analysen (protokoll Seksjon 7). Detaljer om Oxygen renovasjons system brukes til å gjøre renovasjons systemet Mix finnes andre steder17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den molekylære konstruksjonen teknikker av DNA Origami gir en unik måte å konstruere motor ensembler med definerte arkitekturer, motor numre, og typer, slik at studier av hvordan emergent atferd oppstår fra bestemte motor konfigurasjoner31. Som strukturelle og cellulære studier fortsette å belyse eksempler på cytoskjelettkomponenter motorer som arbeider i team, teknikker for å isolere og undersøke Biofysiske og biokjemiske mekanismer av motorer i ensembler vokser i nytte. For eksempel har han vist at dynactin kan binde 2 individuelle dynein motorer, og at slike motstandere har ulik motilitet enn de enkelte motorene10. I tillegg ble DNA-basert konstruksjon brukt for å avgjøre om pattedyr dynein, når aktivert av dynactin og bicD2, kunne matche styrken av kinesin-1 i et tautrekking scenario14. I en annen Mixed-motor studie, DNA Origami ble brukt til å koble virkningene av motsatt polaritet motorer og deres regulatoriske bindende proteiner ved romlig skille dem på en Origami struktur15. Ettersom mer strukturelle og regulatoriske faktorer som bestemmer seg for motilitet er funnet, DNA-Origami-baserte teknikker bør være nyttig for å bestemme den spesifikke biokjemiske og Biofysiske bidragsytere til emergent motilitet av motor ensembler. Den molekylære konstruksjonen teknikker aktivert av DNA Origami er spesielt nyttig fordi emergent fenomenologisk utfall av ensembler er vanskelig å forutsi. Dette skyldes delvis til de utallige faktorer som bidrar til motilitet av de enkelte motorene i ensemblet5,6,31.

Eksempler på våre tidligere strukturer inkluderer monolittisk stenger og segmentert stenger med variabel stivhet. Nåværende innsats utforske sfæriske strukturer så vel25. Andre har ansatt morfologier som Planar strukturer og stenger22,24. På samme måte, ved hjelp av motor håndtak med ortogonale DNA-sekvenser, kan ulike typer motorer bindes til samme chassis struktur7,14,15,18. Denne tilnærmingen muliggjør studier av motstanderens handlinger av dyneins og kinesins, minus-og pluss-end rettet kinesins, og minus-og pluss-end rettet myosins. Det gjør det også mulig å innføre en mutant blant annet vill-type ensembler, slik at bestemte biokjemiske bidragsytere til emergent motilitet skal tydet7. På grunn av evnen til å binde flere fluorophores til hver enkelt struktur, er bildebehandling i TIRF og påfølgende analyse av kymography eller partikkel sporing mulig. Tidligere rapporter viser analyse av kymography data og statistisk evaluering av kabinett strukturer med variabel samsvar8. Mens cytoskjelettkomponenter motorer har vist seg å være en spennende tidlig anvendelse av å bruke DNA Origami som en molekylær brødfjel32, andre proteiner og protein systemer vil også dra nytte av disse metodene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker K. Chau, J. Morgan og A. driller-Colangelo for å bidra til teknikker av segmentert DNA Origami chassis. Vi takker også tidligere medlemmer av Reck-Peterson og Shih laboratorier for nyttige diskusjoner og bidrag til den opprinnelige utviklingen av disse teknikkene. Vi takker J. Wopereis og Smith College Center for mikroskopi og Imaging og L. Bierwert og Smith College Center for Molecular Biology. Vi takker Heldigvis for NSF MRI-programmet for anskaffelse av et TIRF-mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Round Bottom Tube USA Scientific 1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure Cytoskeleton.com T333P-A
Biotin-BSA Sigma A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm Beckman Coulter 356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm Beckman Coulter 355603
Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL GE Healthcare 17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty Bio-Rad 7326204EDU
P8064 Scaffold Tilibit 2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns Bio-Rad 731-1550
ProTev Protease Promega V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser amazon.com N/A
Sephacryl S-500 HR GE Healthcare 17061310
Streptavidin Thermo Fisher 434302
SYBR Safe DNA stain Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain Cytoskeleton.com T240-B
Tubulin, HiLyte 647 Cytoskeleton.com TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes Beckman Coulter 344090

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
  2. Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
  3. Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
  4. Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
  5. McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
  6. Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
  7. Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
  8. Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
  9. Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
  10. Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
  11. Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
  12. Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
  13. Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
  14. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  15. Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
  16. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  17. Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
  18. Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
  19. Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, Humana Press. New York, NY. (2018).
  20. Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
  21. Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, Humana Press. New York, NY. (2014).
  22. Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
  23. Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
  24. Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
  25. Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
  26. Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
  27. Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
  28. Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  31. Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , 2nd Edition, Stanford Publishing. (2019).
  32. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).

Tags

Biokjemi cytoskeleton dynein kinesin molekylære motorer DNA Origami enkelt molekyl metoder
Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, J., Derr, N. D. Production of… More

Hu, J., Derr, N. D. Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation. J. Vis. Exp. (152), e60369, doi:10.3791/60369 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter