En statisk selvrettet metode for å generere hjerneorganoider fra humane embryonale stamceller

Summary

Denne protokollen ble generert som et middel til å produsere hjerneorganoider på en forenklet, rimelig måte uten eksogene vekstfaktorer eller kjellermembranmatrise samtidig som mangfoldet av hjernecelletyper og mange funksjoner i cellulær organisasjon opprettholdes.

Abstract

Menneskelige hjerneorganoider differensiert fra embryonale stamceller gir den unike muligheten til å studere kompliserte interaksjoner av flere celletyper i et tredimensjonalt system. Her presenterer vi en relativt grei og rimelig metode som gir hjerneorganoider. I denne protokollen er menneskelige pluripotente stamceller brutt inn i små klynger i stedet for enkeltceller og dyrket i grunnleggende medier uten en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer, slik at de iboende utviklingssignaler kan forme organoid vekst. Dette enkle systemet produserer et mangfold av hjernecelletyper, inkludert glial- og mikroglialceller, stamceller og nevroner i forhjernen, midbrain og bakhjernen. Organoider generert fra denne protokollen viser også kjennetegn på passende temporal og romlig organisasjon demonstrert av brightfield-bilder, histologi, immunofluorescens og sanntids kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon ( qRT-PCR). Fordi disse organoider inneholder celletyper fra ulike deler av hjernen, kan de brukes til å studere en rekke sykdommer. For eksempel, i en nylig artikkel demonstrerte vi bruk av organoider generert fra denne protokollen for å studere effekten av hypoksi på den menneskelige hjernen. Denne tilnærmingen kan brukes til å undersøke en rekke ellers vanskelige å studere tilstander som neurodevelopmental handicap, genetiske lidelser, og nevrologiske sykdommer.

Introduction

På grunn av utallige praktiske og etiske begrensninger har det vært store problemer med å studere den menneskelige hjernen. Mens studier som bruker gnagere har vært avgjørende for vår forståelse av den menneskelige hjerne, har musehjernen mange ulikheter^1,2. Interessant, mus har en nevronal tetthet som er minst 7 ganger mindre enn primat hjernen^3,4. Selv om primater er nærmere mennesker enn gnagere fra et evolusjonært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere å jobbe med dem. Formålet med denne protokollen var å rekapitulere mange viktige trekk ved den menneskelige hjerne ved hjelp av en forenklet og billigere metode uten behov for en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer samtidig som hjernecellemangfold og cellulær organisasjon opprettholdes.

Formativt arbeid fra Sasai-laboratoriet brukte serumfri kultur av embryoidorganer (SFEBq) metode for å generere to- og tredimensjonale nevronale celletyper fra signaliserte embryonale stamceller (ESCs)^5,6. Mange menneskelige hjerneorganoide metoder har fulgt en relativt lignende vei fra signaliserte ESCs^7,8. I motsetning starter denne protokollen med klynger av frittliggende humane ESCer (hESCs), lik de første trinnene i banebrytende arbeid av Thomson og Zhang laboratorier før plating trinn^9,10 samt det første trinnet i hjernen organoid protokollen av Pasca laboratoriet før tillegg av eksogene vekstfaktorer¹¹. Kjellermembranmatriser (f.eks. matrigel) har blitt brukt i mange hjerneorganoidprotokoller, og det har vist seg å være et effektivt stillas⁸. Men, mest brukte kjeller membran matriser kommer ikke uten komplikasjoner som de co-purifisere med ukjente mengder vekstfaktorer med batch til batch variabilitet under produksjon¹². I tillegg kan disse matrisene komplisere bildebehandling, og øke risikoen for forurensning og kostnader.

Mens menneskelige hjerneorganoider kan brukes til å svare på mange spørsmål, er det visse begrensninger å huske på. For det første, fra embryonale stamceller, organoider ligner nærmere umodne hjerner enn alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sykdommer som oppstår i alderdommen, som Alzheimers sykdom. For det andre, mens vår protokoll fant markører for forebrain, midbrain og hindbrain utvikling som er nyttige for å studere effekten av en behandling eller sykdom på celler fra flere hjerneregioner i konsert, andre protokoller kan følges for å konsentrere seg om bestemte hjerneregioner^13,14. Til slutt, en annen begrensning av organoid modeller er at av størrelse, mens den gjennomsnittlige lengden på en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjerneorganoider laget med bruk av agitasjon vokse opp til 4 mm⁸ og organoider dannet av denne protokollen vokse til 1-2 mm av 10 uker. Likevel gir denne protokollen et viktig verktøy for å studere menneskelig hjernevev og samspillet mellom flere celletyper.

Protocol

1. Stamcellevedlikehold Vedlikehold H9 hESCer på et lag med vekstfaktor redusert kjeller membran matrise (se Materialbordet, heretter bare referert til som matrise) i henhold til produsentens instruksjoner. For å belegge en 6-brønns tallerken eller en 10 cm tallerken, kombiner 100 μL matrise med 5,9 ml iskald Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) / F12 media. Pakk plater i parafinfilm og oppbevar over natten ved 4 °C. Bruk dem neste dag for å passere celler etter at overflødi…

Representative Results

Figur 1 viser representative brightfield-bilder av flere tidspunkter for å demonstrere hvordan cellene/organoidene ser ut gjennom de forskjellige stadiene av protokollen. HESCs ble fjernet fra vevkulturplaten, brutt i små biter, og plassert i en T75 ultra-lav festekolbe hvor de dannet kuler. Det er viktig å merke seg at cellene ser lyse og like ut i størrelse, uten mørke, døende celler i sentrene i disse klyngene. Cellene ble gradvis avvennet av bFGF. På dag 5 ble de plassert i nevral…

Discussion

I likhet med andre organoidmodeller er dette et kunstig system som kommer med flere advarsler. Selv om det var lite batch til batch variasjon i form av generelle uttrykknivåer, individuelle organoider viste forskjeller. For eksempel var plasseringen av Sox-2 positive områder ikke identiske i hver organoid (Figur 3). Mens qPCR er egnet til å se etter generelle endringer i grupper av celler, vil flere teknikker som encellet RNAseq bli brukt i fremtidige studier for å samle inn mer informasjon på celle…

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814