Denne protokol indeholder instruktioner til implementering af multiphoton litografi til at fabrikere tredimensionelle arrays af fluorescerende fiducial markører indlejret i poly (ethylenglycol)-baserede silicagelrogeler til brug som reference-fri, trækkraft mikroskopi Platforme. Ved hjælp af disse instruktioner forenkles måling af 3D-materiale stamme og beregning af cellulære distraktionerne for at fremme målinger af trækkraft med høj gennemløb.
Kvantificering af celle induceret materiale deformation giver nyttige oplysninger om, hvordan cellerne fornemmer og reagerer på de fysiske egenskaber i deres mikromiljø. Mens mange tilgange findes til måling af celle-induceret materiale stamme, her giver vi en metode til overvågning af stamme med sub-micron opløsning på en reference-fri måde. Ved hjælp af en to-foton aktiveret photolithographic mønster proces, viser vi, hvordan man genererer mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske substrater, der indeholder indlejrede arrays af fluorescerende fiducial markører til nemt at måle tredimensionelle ( 3D) materiale deformation profiler som reaktion på overflade tractions. Ved hjælp af disse substrater kan celle spændings profiler tilknyttes ved hjælp af en enkelt 3D-billedstak af en celle af interesse. Vores mål med denne metode er at gøre Traction Force mikroskopi en mere tilgængelig og lettere at implementere værktøj til forskere, der studerer cellulære mekanisotransduktionsprocesser, især nytilkomne til marken.
Trækkraft mikroskopi (TFM) er processen med at tilnærme cellulære distraktionerne ved hjælp interpoleret forskydning felter af fiducial markører genereret af en vedhængende og kontraktile celle. Ved hjælp af TFM kan indflydelsen fra mekaniske signaler i det ekstracellulære miljø på vigtige cellulære processer såsom spredning, differentiering og migration undersøges1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Desværre kan mange eksisterende tilgange være vanskelige at gennemføre eller kræve kendskab til højt specialiserede analytiske og beregningsmæssige værktøjer gør TFM vanskeligt for uerfarne forskere til at bruge. Vi beskriver en metode til at generere en TFM platform, der eliminerer nogle af de vanskeligheder i analysen, samtidig med at høj gennemløb dataindsamling.
Af de eksisterende TFM-tilgange omfatter de hyppigst anvendte til kvantificering af materiale stammen inkorporering af små fluorescerende markører (typisk fluorescerende perler i nano-eller mikrometer størrelse) i en deformerbar hydrogel, såsom polyacrylamid (PAA) eller poly (ethylenglycol) diacrylat (pegda)13,14,15. Disse perle baserede tilgange giver mulighed for tæt klynge fiducial markører omkring en celle af interesse for at maksimere forskydning prøveudtagning. Desværre kan fordelingen af perlerne i hele hydrogel ikke styres direkte, så den rumlige organisation er tilfældig. Denne tilfældige placering fører til problemer såsom perler, der er for tæt på hinanden til præcist at løse, eller så sprede, at patches af substrat udbytte lav kvalitet data. Den manglende evne til at forudsige, hvor fiducial markører ligger i fravær af celler også skaber en begrænsning, at for hver indsamlede sæt af celle trækkraft data, en yderligere referencebillede af de underliggende markører i en afslappet tilstand skal også tages til fange. Referencebilledet er påkrævet, så forskydningen i det stressede billede kan tilnærses som forskellen mellem de stressede og ustressede billeder. For at opnå en afslappet tilstand, de celler, der måles, er enten kemisk afslappet eller helt fjernet. Denne proces forhindrer ofte erhvervelse af yderligere eksperimentelle målinger, hæmmer langsigtede celle undersøgelser, og begrænser gennemløb. En referencebillede kræver også billedregistrering teknikker til at rumme for drift, som kan have fundet sted under eksperimenter, ofte fører til besværlig manuel matchning af stress tilstand billeder til reference billeder.
Andre TFM-metoder, som anses for reference frie, gennemfører en eller anden form for kontrol over fordelingen af fiducial markører, enten ved højopløsnings litografi, mikrokontakttrykning eller mikromolding16,17,18 ,19,20. Den reference frie TFM opnås ved at antage, at den afslappede tilstand for hver fiducial markør kan forudsiges ud fra, hvordan markør positioner blev ordineret under fremstillingsprocessen. Disse metoder giver mulighed for fuldstændig opsamling af en celles spændingstilstand inden for et enkelt billede, hvor fiducial markør forskydninger måles i forhold til en implicit reference, end der kan udledes af den fiducial markør geometri. Selv om konsistens i markørplacering typisk opnås ved hjælp af disse platforme, lider de generelt af deres egne mangler i forhold til de udbredte perle baserede tilgange, herunder: 1) nedsat trækkraft opløsning; 2) nedsat nøjagtighed af out-of-plane forskydninger (i nogle tilfælde en fuldstændig manglende evne til at måle); og 3) nedsat customizability af platform substrater og materialer (f. eks. ligand præsentation, mekaniske egenskaber).
For at afhjælpe disse mangler designede vi en ny reference-fri TFM-platform. Platformen udnytter multiphoton aktiveret kemi til at link en lille volumen af en fluoroforet i specifikke 3D steder inden for hydrogel, der tjener som fiducial markører til at måle materiale stamme. På denne måde har vi designet en platform, der fungerer på samme måde som Bead-baserede tilgange, men med den betydelige fordel, at fiducial markører er organiseret i gridded arrays giver mulighed for reference-fri materiale stamme tracking. Denne reference-fri ejendom giver mange fordele. Først og fremmest, det giver mulighed for ikke-påtrængende overvågning af cellulære trækkraft stater (dvs., omgår behovet for at slappe af eller fjerne celler til at erhverve referencepositioner af fordrevne fiducial markører). Dette var vores primære mål i udformningen af dette system, da vi havde til hensigt at indarbejde andre downstream analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskeligt med destruktive end-punkt TFM tilgange. For det andet, ved hjælp af en implicit reference baseret på gridded arrays giver mulighed for nær-komplet automatisering af fortrængnings analyse. Den formelle rigtighed af arrays skaber en forudsigelig arbejdsgang, hvor forekomsten af ekstraordinære tilfælde (dvs. prøve celledata, der indeholder uventede artefakter såsom suboptimal markør afstand eller registrering mismatch) kan opretholdes på et minimum. For det tredje giver afkald på behovet for at erhverve et referencebillede frihed til at overvåge mange celler på en enkelt prøve over længere tidsperioder. Dette står i kontrast til traditionelle perle baserede tilgange, hvor fejl i positionering kan akkumulere og øge vanskeligheden ved korrekt registrering af reference billeder til celle spændinger, afhængigt af hvordan mikroskopet er i automatiseret fase bevægelser. Billeder. Samlet set, denne platform letter højere gennemløb i indsamling cellulære spænding data.
Med denne protokol, vi håber at gøre læserne med de to-foton, Laserscanning litografi teknik, som vi implementeret for at generere denne reference-fri TFM platform til at måle in-plane og out-of-plane trækkraft komponenter genereret af celler seedet på overfladen. Ikke omfattet af denne protokol er syntesen af nogle af de monomeriske komponenter. Generelt omfatter disse reaktioner næsten identiske “One-pot”-syntese reaktions ordninger, der er beskrevet tidligere21, og alternativer til disse produkter kan også købes. Vi sigter også mod at gøre læserne bekendt med de softwarebaserede værktøjer, vi har genereret for at fremme brugen af kommercielt tilgængelige laser scannings mikroskoper som 3D-udskrivnings værktøjer og for at lette analysen af de fiducial markør forskydninger.
Målet med denne protokol er at tilvejebringe en arbejdsgang, der letter en stor mængde af vanskelighederne i forbindelse med generering og analyse af TFM-data. Når de er tilberedt, er de photopatterned silicagelrogeler enkle at bruge, kræver kun viden om standard vævskultur praksis og Fluorescens mikroskopi. Det referencefri aspekt muliggør ubekymret navigation på celle belastede silicagelrogeler og eliminerer besværlige billedbehandlings trin såsom billedregistrering mellem reference og deformerede billeder. De…
The authors have nothing to disclose.
O. A. Banda blev støttet af midler fra en NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), Startup midler fra University of Delaware, og National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS understøttes af midler fra National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) og National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi adgang blev støttet af tilskud fra NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) og staten Delaware. Den strukturerede belysning mikroskop blev erhvervet med midler fra staten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 confokale mikroskop anvendes til to-photon Laserscanning litografi blev erhvervet med en delt instrumentering Grant (S10 OD016361).
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips | in-house | in-house | Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24 |
Axio-Observer Z1 w/Apotome | Zeiss | Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM. | |
Chameleon Vision ii | Coherent Inc. | Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography. | |
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | 3M | Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes. | |
Flexmark90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter. |
LSM-880 | Zeiss | Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography. | |
MATLAB | Mathworks | R2018a | Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data. |
Model SC Plotter | USCutter | SC631E | Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes. |
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 | Zeiss | Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM. | |
PEG-AF633 | in-house | in-house | Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21 |
PEG-DA | in-house | in-house | Base material for hydrogels. See reference: 21 |
PEG-RGDS | in-house | in-house | RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21 |
Petri Dishes | CELLTREAT | 229638 | 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS). |
Syringe, Leur-Lok, 1 mL | BD | 309628 | Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps. |
UV Lamp | UVP | Blak-Ray® B-100AP | Polymerizes base hydrogel. |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography. |