Summary

Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

Published: October 04, 2019
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Summary

Un protocole pour produire des organoïdes endométrials primaires humains qui se composent des cellules épithéliales et stromales et pour retenir des caractéristiques du tissu endométrial indigène est présenté. Ce protocole décrit des méthodes de l’acquisition utérine de tissu au traitement histologique des organoïdes endométrials.

Abstract

L’endomètre humain est l’un des tissus les plus sensibles aux hormones dans le corps et est essentiel pour l’établissement de la grossesse. Ce tissu peut également devenir malade et causer la morbidité et même la mort. Les systèmes modèles pour étudier la biologie de l’endomètre humain ont été limités aux systèmes de culture in vitro de types de cellules uniques. En outre, les cellules épithéliales, l’un des principaux types cellulaires de l’endomètre, ne se propagent pas bien ou ne conservent pas leurs traits physiologiques en culture, et donc notre compréhension de la biologie de l’endomètre reste limitée. Nous avons généré, pour la première fois, des organoïdes endométrials qui se composent à la fois de cellules épithéliales et stromales de l’endomètre humain. Ces organoïdes ne nécessitent pas de matériaux exogènes d’échafaudage et s’organisent spécifiquement de sorte que les cellules épithéliales englobent la structure sphéroïde et deviennent polarisées avec des cellules stromales au centre qui produisent et sécrètent du collagène. Les récepteurs d’oestrogène, de progestérone et d’androgène sont exprimés dans les cellules épithéliales et stromal et le traitement avec des niveaux physiologiques d’oestrogène et de testostérone favorisent l’organisation des organoïdes. Ce nouveau système modèle peut être utilisé pour étudier la biologie de l’endomètre normal et la maladie d’une manière qui n’était pas possible auparavant.

Introduction

L’endomètre humain religne la cavité utérine et sert de premier contact pour l’embryon lors de l’implantation. L’endomètre est composé de cellules épithéliales luminestiques et glandulaires, de fibroblastes stromaux de soutien, de cellules endothéliales et de cellules immunitaires. Ensemble, ces types de cellules composent le tissu endométrial qui est l’un des tissus les plus sensibles aux hormones stéroïdes sexuelles1. Les changements qui se produisent au cours de chaque cycle menstruel sont frappants. La croissance et le remodelage appropriés de l’endomètre sont nécessaires pour permettre l’implantation d’embryons. La réponse aberrante à l’oestrogène et à la progestérone peut avoir comme conséquence un endomètre réfractaire qui ne permet pas l’établissement réussi de la grossesse et peut même avoir comme conséquence des maladies comprenant la néoplasie endométriale.

Afin d’étudier les réponses hormonales et les changements essentiels qui se produisent dans l’endomètre, les cellules des tissus endométrial excisés des patients pendant la chirurgie ou la biopsie endométriale ont été propagées dans la culture cellulaire. Les cellules stromales endométriales prolifèrent et se propagent facilement de préférence, et le processus de différenciation induit e par la progestérone peut être récapitulé in vitro. En conséquence, beaucoup a été appris au cours de ce processus de différenciation, appelé décidualisation2,3. L’autre type de cellule majeure dans l’endomètre, les cellules épithéliales luminal et glandulaire, cependant, ne se développent pas bien comme les monocouches traditionnels, perdant la polarité, devenant sénescent, et ayant le potentiel proliférant limité. En conséquence, on en sait moins de leur biologie et de leur rôle dans l’endomètre humain. Comme beaucoup de néoplasie proviennent des cellules épithéliales, les mécanismes associés à l’hyperplasie ou à la transformation aux cellules cancéreuses restent à être entièrement définis. En outre, des études ont établi que la réponse hormonale implique les actions paracrines intimes entre les cellules épithéliales et stromales de l’endomètre4,5.

Récemment, une culture organoïde tridimensionnelle (3D) des cellules épithéliales endométriales a été établie par deux groupes indépendants6,7, qui sont les premiers rapports des organoïdes formés à partir du tissu endométrial. Ces organoïdes étaient composés des cellules épithéliales endométriales incorporées dans une matrice de protéine (tableau des matériaux) et n’ont pas inclus un compartiment hormonalement sensible important de l’endomètre endométrial, les fibroblastes stromal. Comme les protéines matricielles peuvent varier d’un lot à l’autre et peuvent déclencher des voies de signalisation qui ne se produisent pas nécessairement dans le tissu, il serait idéal de remplacer les protéines matricielles par des composants de l’endomètre. Dans la présente étude, un protocole pour générer des organoïdes endométrialhumains humains sans échafaudage des cellules épithéliales et stromales de l’endomètre humain est présenté. La présence de cellules stromales fournit non seulement le soutien pour les cellules épithéliales mais fournit également les actions paracrines nécessaires qui ont été établies pour être importantes pour la réponse d’hormone endométriale4,8,9 .

Le nouvel organoïde endométrial multicellulaire offre un système modèle de l’endomètre qui est simple à générer et qui intègre à la fois des cellules épithéliales et stromales. Ces organoïdes peuvent être utilisés pour étudier les changements hormonaux à long terme et les premiers événements de la maladie comme la tumorigénèse due à un déséquilibre hormonal ou des insultes exogènes. La complexité de ces organoïdes pourrait éventuellement être élargie pour inclure d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales et immunitaires avec éventuellement des cellules myométriales pour imiter vraiment la physiologie des tissus humains.

Protocol

Des échantillons d’endomètre ont été prélevés sur des femmes préménopausées subissant une hystérectomie de routine pour des affections utérines bénignes à l’hôpital pour femmes Prentice de l’Université Northwestern, selon un protocole approuvé par la Commission d’examen institutionnel. Le consentement écrit a été obtenu de toutes les femmes incluses dans l’étude. 1. Préparation des moules d’Agarose Avant de commencer l’isolement cellulaire, la fonte et l’équilib…

Representative Results

Un schéma du protocole est représenté dans la figure 1. Le tissu utérin a été obtenu de la chirurgie après qu’il ait été examiné par des pathologistes. La doublure endométriale a été séparée du myometrium par le raclage et le tissu endométrial a été enzymatiquement digéré aux cellules comme décrit dans le protocole. Des cellules épithéliales et stromales ont été ajoutées dans des micropuits dans les moules d’agarose. Après 7 jours dans la culture, les organoïdes o…

Discussion

Nous avons produit des organoïdes endométrials humains composés de cellules épithéliales et stromales de l’endomètre sans l’utilisation de matériaux exogènes d’échafaudage. Bien qu’il ait déjà été démontré que les cellules épithéliales endométriales primaires peuvent former des organoïdes6,7, ces cellules ont été incorporées dans une matrice gélatineuse de protéines sécrétées par les cellules de sarcome de souris (voir tableau d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la subvention UG3 du NIEHS/NIH/NCATS (ES029073) et le fonds Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nous tenons à remercier l’installation de base de pathologie du Nord-Ouest pour le traitement des organoïdes fixes pour l’incorporation de paraffine. Nous tenons à remercier toute l’équipe de l’UG3, y compris les laboratoires Woodruff, Burdette et Urbanek pour les discussions et les collaborations perspicaces.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

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Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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