मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल organoids कि उपकला और stromal कोशिकाओं से मिलकर बनता है और देशी एंडोमेट्रियल ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखने उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. यह प्रोटोकॉल गर्भाशय ऊतक अधिग्रहण से एंडोमेट्रियल organoids के हिस्टोलॉजिक प्रसंस्करण के तरीकों का वर्णन करता है।
मानव एंडोमेट्रियम शरीर में सबसे हार्मोनल उत्तरदायी ऊतकों में से एक है और गर्भावस्था की स्थापना के लिए आवश्यक है। यह ऊतक भी रोगग्रस्त हो सकता है और रुग्णता और यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है। मानव एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मॉडल सिस्टम एकल प्रकार के इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों तक सीमित किया गया है. इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं, एंडोमेट्रियम के प्रमुख सेल प्रकार ों में से एक, अच्छी तरह से प्रचार या संस्कृति में उनके शारीरिक लक्षण बनाए रखने नहीं है, और इस प्रकार एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान की हमारी समझ सीमित रहता है। हम उत्पन्न किया है, पहली बार के लिए, एंडोमेट्रियल organoids कि दोनों उपकला और मानव एंडोमेट्रियम के stromal कोशिकाओं से मिलकर बनता है. इन organoids किसी भी exogenous पाड़ सामग्री की आवश्यकता नहीं है और विशेष रूप से इतना है कि उपकला कोशिकाओं गोलाभ की तरह संरचना को शामिल करने और केंद्र है कि उत्पादन और स्रावित कोलेजन में stromal कोशिकाओं के साथ polarized हो व्यवस्थित. एस्ट्रोजन, प्रोजेस्टेरोन और एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स उपकला और स्ट्रॉमल कोशिकाओं और एस्ट्रोजन और टेस्टोस्टेरोन के शारीरिक स्तर के साथ उपचार में व्यक्त कर रहे हैं organoids के संगठन को बढ़ावा देने. इस नए मॉडल प्रणाली के तरीके है कि पहले संभव नहीं थे में सामान्य एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मानव एंडोमेट्रियम गर्भाशय गुहा को लाइनों और प्रत्यारोपण के दौरान भ्रूण के लिए पहला संपर्क के रूप में कार्य करता है। एंडोमेट्रियम में ज्योतिर्मय और ग्रंथियों की उपकला कोशिकाएं, सहायक स्ट्रॉमल फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। एक साथ, इन सेल प्रकार एंडोमेट्रियल ऊतक जो सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन के लिए सबसे संवेदनशील ऊतकों में से एक है1बनाते हैं। प्रत्येक मासिक धर्म चक्र के दौरान होने वाले परिवर्तन हड़ताली हैं। एंडोमेट्रियम के उचित विकास और remodeling भ्रूण प्रत्यारोपण होने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन के लिए एबरेंट प्रतिक्रिया एक रिफ्रैक्टरी एंडोमेट्रियम में परिणाम कर सकती है जो गर्भावस्था की सफल स्थापना की अनुमति नहीं देती है और एंडोमेट्रियल नियोप्लासिया सहित रोगों में भी परिणाम कर सकती है।
एंडोमेट्रियम में होने वाले हार्मोन प्रतिक्रियाओं और आवश्यक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, एंडोमेट्रियल ऊतकों से कोशिकाओं को सर्जरी या एंडोमेट्रियल बायोप्सी के दौरान रोगियों से उत्पादित सेल संस्कृति में प्रचारित किया गया है। एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल कोशिकाओं को वरीयता से बढ़ने और आसानी से प्रचारित किया जा सकता है, और प्रोजेस्टेरोन द्वारा प्रेरित भेदभाव की प्रक्रिया को विट्रो में recapitulated किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप, इस विभेदन प्रक्रिया के दौरान बहुत कुछ सीखा गया है, जिसे decidualization2,3 कहा जाताहै. एंडोमेट्रियम में अन्य प्रमुख सेल प्रकार, luminal और ग्रंथियों उपकला कोशिकाओं, तथापि, के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक monolayers विकसित नहीं करते, polarity खोने, जीर्ण हो जाते हैं, और सीमित proliferative क्षमता होने. नतीजतन, कम उनके जीव विज्ञान और मानव एंडोमेट्रियम में उनकी भूमिका के बारे में जाना जाता है. चूंकि कई नेओप्लासिया उपकला कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, हाइपरप्लासिया या कैंसर कोशिकाओं में परिवर्तन से जुड़े तंत्र पूरी तरह से परिभाषित किए जाते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से यह साबित हो गया है कि हार्मोन की प्रतिक्रिया में एंडोमेट्रियम4,5के उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं के बीच अंतरंग पैराक्रिन क्रियाएं शामिल हैं.
हाल ही में, एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं की एक तीन आयामी (3 डी) organoid संस्कृति दो स्वतंत्र समूहों6,7, जो एंडोमेट्रियल ऊतक से गठित organoids की पहली रिपोर्ट कर रहे हैं द्वारा स्थापित किया गया था। इन organoids एक प्रोटीन मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं के शामिल थे (सामग्री की तालिका) और एंडोमेट्रियल एंडोमेट्रियम के एक महत्वपूर्ण हार्मोनल उत्तरदायी डिब्बे शामिल नहीं था, stromal फाइब्रोब्लास्ट्स. मैट्रिक्स प्रोटीन बहुत से बहुत भिन्न हो सकते हैं और जरूरी ऊतक में नहीं होते हैं कि संकेतन रास्ते को गति प्रदान कर सकते हैं, यह एंडोमेट्रियम के घटकों के साथ मैट्रिक्स प्रोटीन की जगह आदर्श होगा. वर्तमान अध्ययन में, एक प्रोटोकॉल पाड़ मुक्त मानव एंडोमेट्रियल organoids उपकला और मानव एंडोमेट्रियम के stromal कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए प्रस्तुत किया है. स्ट्रोमल कोशिकाओं की उपस्थिति न केवल उपकला कोशिकाओं के लिए समर्थन प्रदान करती है बल्कि एंडोमेट्रियल हार्मोन प्रतिक्रिया4,8,9 के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए स्थापित किए गए आवश्यक पैराक्रिन क्रियाएँ भी प्रदान करतीहै .
नई बहुकोशिकीय एंडोमेट्रियल ऑर्गनॉइड एंडोमेट्रियम की एक मॉडल प्रणाली प्रदान करती है जो उत्पन्न करने के लिए सरल है और इसमें उपकला और स्ट्रोमल दोनों कोशिकाओं को शामिल किया गया है। इन organoids लंबे समय तक हार्मोनल परिवर्तन और हार्मोनल असंतुलन या exogenous अपमान के कारण tumorigenesis जैसे रोग की प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन organoids की जटिलता अंततः अन्य सेल प्रकार शामिल करने के लिए विस्तार किया जा सकता है, endothelial और संभवतः मायोमेट्रियल कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित वास्तव में मानव ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान की नकल करने के लिए.
हमने बहिर्जात पाड़ सामग्री के उपयोग के बिना एंडोमेट्रियम के उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं के शामिल मानव एंडोमेट्रियल organoids उत्पन्न किया है। हालांकि यह पहले से ही दिखाया गया है कि प्राथमिक एंडोमेट्रियल उ?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को एनआईईएचएस/एनआईएच/एनकैट्स UG3 अनुदान (ES029073) और नॉर्थवेस्टर्न फेनबर्ग स्कूल ऑफ मेडिसिन ब्रिज फंड (जेजेके) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पैराफिन embedding के लिए निश्चित organoids प्रसंस्करण के लिए उत्तर पश्चिमी पैथोलॉजी कोर सुविधा स्वीकार करना चाहते हैं. हम व्यावहारिक विचार विमर्श और सहयोग के लिए वुडरफ, Burdette, और Urbanek प्रयोगशालाओं सहित पूरे UG3 टीम को स्वीकार करना चाहते हैं.
Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
Dispase | Corning | 354235 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |