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Developmental Biology

बहुकोशिकीय मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड्स का उत्पादन

doi: 10.3791/60384 Published: October 4, 2019
* These authors contributed equally

Summary

मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल organoids कि उपकला और stromal कोशिकाओं से मिलकर बनता है और देशी एंडोमेट्रियल ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखने उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. यह प्रोटोकॉल गर्भाशय ऊतक अधिग्रहण से एंडोमेट्रियल organoids के हिस्टोलॉजिक प्रसंस्करण के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

मानव एंडोमेट्रियम शरीर में सबसे हार्मोनल उत्तरदायी ऊतकों में से एक है और गर्भावस्था की स्थापना के लिए आवश्यक है। यह ऊतक भी रोगग्रस्त हो सकता है और रुग्णता और यहां तक कि मौत का कारण बन सकता है। मानव एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मॉडल सिस्टम एकल प्रकार के इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों तक सीमित किया गया है. इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं, एंडोमेट्रियम के प्रमुख सेल प्रकार ों में से एक, अच्छी तरह से प्रचार या संस्कृति में उनके शारीरिक लक्षण बनाए रखने नहीं है, और इस प्रकार एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान की हमारी समझ सीमित रहता है। हम उत्पन्न किया है, पहली बार के लिए, एंडोमेट्रियल organoids कि दोनों उपकला और मानव एंडोमेट्रियम के stromal कोशिकाओं से मिलकर बनता है. इन organoids किसी भी exogenous पाड़ सामग्री की आवश्यकता नहीं है और विशेष रूप से इतना है कि उपकला कोशिकाओं गोलाभ की तरह संरचना को शामिल करने और केंद्र है कि उत्पादन और स्रावित कोलेजन में stromal कोशिकाओं के साथ polarized हो व्यवस्थित. एस्ट्रोजन, प्रोजेस्टेरोन और एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स उपकला और स्ट्रॉमल कोशिकाओं और एस्ट्रोजन और टेस्टोस्टेरोन के शारीरिक स्तर के साथ उपचार में व्यक्त कर रहे हैं organoids के संगठन को बढ़ावा देने. इस नए मॉडल प्रणाली के तरीके है कि पहले संभव नहीं थे में सामान्य एंडोमेट्रियल जीव विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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मानव एंडोमेट्रियम गर्भाशय गुहा को लाइनों और प्रत्यारोपण के दौरान भ्रूण के लिए पहला संपर्क के रूप में कार्य करता है। एंडोमेट्रियम में ज्योतिर्मय और ग्रंथियों की उपकला कोशिकाएं, सहायक स्ट्रॉमल फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। एक साथ, इन सेल प्रकार एंडोमेट्रियल ऊतक जो सेक्स स्टेरॉयड हार्मोन के लिए सबसे संवेदनशील ऊतकों में से एक है1बनाते हैं। प्रत्येक मासिक धर्म चक्र के दौरान होने वाले परिवर्तन हड़ताली हैं। एंडोमेट्रियम के उचित विकास और remodeling भ्रूण प्रत्यारोपण होने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है। एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन के लिए एबरेंट प्रतिक्रिया एक रिफ्रैक्टरी एंडोमेट्रियम में परिणाम कर सकती है जो गर्भावस्था की सफल स्थापना की अनुमति नहीं देती है और एंडोमेट्रियल नियोप्लासिया सहित रोगों में भी परिणाम कर सकती है।

एंडोमेट्रियम में होने वाले हार्मोन प्रतिक्रियाओं और आवश्यक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए, एंडोमेट्रियल ऊतकों से कोशिकाओं को सर्जरी या एंडोमेट्रियल बायोप्सी के दौरान रोगियों से उत्पादित सेल संस्कृति में प्रचारित किया गया है। एंडोमेट्रियल स्ट्रोमल कोशिकाओं को वरीयता से बढ़ने और आसानी से प्रचारित किया जा सकता है, और प्रोजेस्टेरोन द्वारा प्रेरित भेदभाव की प्रक्रिया को विट्रो में recapitulated किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप, इस विभेदन प्रक्रिया के दौरान बहुत कुछ सीखा गया है, जिसे decidualization2,3 कहा जाताहै. एंडोमेट्रियम में अन्य प्रमुख सेल प्रकार, luminal और ग्रंथियों उपकला कोशिकाओं, तथापि, के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक monolayers विकसित नहीं करते, polarity खोने, जीर्ण हो जाते हैं, और सीमित proliferative क्षमता होने. नतीजतन, कम उनके जीव विज्ञान और मानव एंडोमेट्रियम में उनकी भूमिका के बारे में जाना जाता है. चूंकि कई नेओप्लासिया उपकला कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, हाइपरप्लासिया या कैंसर कोशिकाओं में परिवर्तन से जुड़े तंत्र पूरी तरह से परिभाषित किए जाते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से यह साबित हो गया है कि हार्मोन की प्रतिक्रिया में एंडोमेट्रियम4,5के उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं के बीच अंतरंग पैराक्रिन क्रियाएं शामिल हैं.

हाल ही में, एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं की एक तीन आयामी (3 डी) organoid संस्कृति दो स्वतंत्र समूहों6,7, जो एंडोमेट्रियल ऊतक से गठित organoids की पहली रिपोर्ट कर रहे हैं द्वारा स्थापित किया गया था। इन organoids एक प्रोटीन मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं के शामिल थे (सामग्री की तालिका) और एंडोमेट्रियल एंडोमेट्रियम के एक महत्वपूर्ण हार्मोनल उत्तरदायी डिब्बे शामिल नहीं था, stromal फाइब्रोब्लास्ट्स. मैट्रिक्स प्रोटीन बहुत से बहुत भिन्न हो सकते हैं और जरूरी ऊतक में नहीं होते हैं कि संकेतन रास्ते को गति प्रदान कर सकते हैं, यह एंडोमेट्रियम के घटकों के साथ मैट्रिक्स प्रोटीन की जगह आदर्श होगा. वर्तमान अध्ययन में, एक प्रोटोकॉल पाड़ मुक्त मानव एंडोमेट्रियल organoids उपकला और मानव एंडोमेट्रियम के stromal कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए प्रस्तुत किया है. स्ट्रोमल कोशिकाओं की उपस्थिति न केवल उपकला कोशिकाओं के लिए समर्थन प्रदान करती है बल्कि एंडोमेट्रियल हार्मोन प्रतिक्रिया4,8,9 के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए स्थापित किए गए आवश्यक पैराक्रिन क्रियाएँ भी प्रदान करतीहै .

नई बहुकोशिकीय एंडोमेट्रियल ऑर्गनॉइड एंडोमेट्रियम की एक मॉडल प्रणाली प्रदान करती है जो उत्पन्न करने के लिए सरल है और इसमें उपकला और स्ट्रोमल दोनों कोशिकाओं को शामिल किया गया है। इन organoids लंबे समय तक हार्मोनल परिवर्तन और हार्मोनल असंतुलन या exogenous अपमान के कारण tumorigenesis जैसे रोग की प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन organoids की जटिलता अंततः अन्य सेल प्रकार शामिल करने के लिए विस्तार किया जा सकता है, endothelial और संभवतः मायोमेट्रियल कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित वास्तव में मानव ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान की नकल करने के लिए.

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Protocol

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एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय प्रेंटिस महिला अस्पताल में सौम्य गर्भाशय की स्थिति के लिए नियमित गर्भाशयोच्छेदन के दौर से गुजर रही प्रीमेनोपॉज़ल महिलाओं से एंडोमेटेरियल नमूने एकत्र किए गए थे। अध्ययन में शामिल सभी महिलाओं से लिखित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. Agarose मोल्ड्स की तैयारी

  1. सेल अलगाव शुरू करने से पहले, कलाकारों और बराबर 1.5% agarose माइक्रो मोल्ड (सामग्री की तालिका)निर्माता के निर्देशों के अनुसार organoids घर के लिए.

2. एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड्स की पीढ़ी

  1. हार्वेस्ट प्राथमिक स्ट्रॉमल और उपकला कोशिकाओं
    1. एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करके एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एंजाइम समाधान तैयार करें (2.5 mg/mL कोलाजनेस प्रकार I + 0.1 mg/mL DNase I में 10 एमएल dispase [500 इकाइयों]) पर 37 डिग्री सेल्सियस, और बाँझ-फिल्टर समाधान का उपयोग कर एक 0.2 m फिल्टर एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में।
    2. एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करके एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, गर्भाशय बायोप्सी से एंडोमेट्रियम को खत्म करें और हुड के नीचे कीमा ऊतक एक स्केलपेल के साथ बहुत छोटे टुकड़ों में।
      नोट: एंडोमेट्रियल ऊतक है कि कम से कम है 20 मिमी x 10 मिमी x 1 मिमी organoids की पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है.
    3. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में एंजाइम समाधान में ताजा कीमा बनाया ऊतक रखो. टोपी बंद करें और संदूषण को रोकने के लिए एक मोम फिल्म (सामग्री की तालिका) के साथ शीर्ष लपेटो।
    4. एक पानी के स्नान में ऊतक के साथ ट्यूब रखो या 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए 30 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए (80 डिग्री 100 आरपीएम) के साथ.
    5. 50 एमएल शंकुन ट्यूब पर 20 डिग्री मीटर सेल छलनी के शीर्ष पर 100 डिग्री मीटर सेल छलनी रखें। दो प्रशिक्षकों के माध्यम से समाधान फ़िल्टर, और फिर हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 10 एमएल के साथ 15 एमएल शंकु ट्यूब कुल्ला; सामग्री की तालिका) और सभी कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए छलनी के माध्यम से धोने डाल दिया।
      नोट: प्रवाह के माध्यम से तरल स्ट्रॉमल कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं ($ 20 एमएल कुल) शामिल हैं। एपिथेलियल कोशिकाओं को 20 डिग्री मीटर छलनी पर एकत्र किया जाता है। अपाच्य ऊतक के चंक्स 100 डिग्री मीटर छलनी के शीर्ष पर रहते हैं। एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर में अपाच्य ऊतक छोड़ ें.
    6. चरण 2.1.5 से एक नई 50 एमएल शंकु नली पर 20 डिग्री कोशिका छलनी को उलटें और 20 एमएल organoid मीडिया के साथ छलनी से उपकला कोशिकाओं को धो लें (सामग्री की तालिका) 1% कलम /
    7. शंकु ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर 2.1.5 और 2.1.6 से सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. एकत्र स्ट्रॉमल कोशिकाओं के साथ, supernatant को हटाने और लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 10 एमएल के साथ गोली resuspend.  10 डिग्री 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, शंकु ट्यूब को 5 मिनट के लिए 5 00 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनॉटेंट को हटा दें, और ऑर्नॉयड मीडिया के 200 डिग्री 300 $L के साथ गोली को पुन: स्फूर्ति दें (आगे के निर्देशों के लिए चरण 2.2.2 देखें)।
    9. एकत्र उपकला कोशिकाओं के साथ, supernatant निकालें और organoid मीडिया के 100 $L के साथ फिर से निलंबित (आगे के निर्देशों के लिए चरण 2.2.2 देखें).
  2. सीडिंग कोशिकाओं
    1. एक 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 1.5% agarose मोल्ड (1 मोल्ड प्रति अच्छी तरह से) को बराबर करने के बाद, agarose मोल्ड के बाहर organoid मीडिया को हटाने और ऊतक संस्कृति प्लेट झुकाव इतना है कि agarose व्यंजन के सेल बोने कक्ष से माध्यम भी हो सकता है ध्यान से हटा दिया.
    2. उपकला (चरण 2.1.9 से) और स्ट्रॉमल (चरण 2.1.8 से) सूक्ष्मदर्शी के नीचे सेल निलंबन देखें।  एक समय में या तो एपिथेलियल या स्ट्रोमल सेल निलंबन 100 डिग्री सेल्सियस के लिए अधिक organoid मीडिया जोड़ें, ताकि निलंबन घनत्व में मोटे तौर पर बराबर हैं।
      नोट: Epithelial कोशिकाओं को एक साथ clump जाएगा, और यह पचाने के लिए उचित नहीं है /
    3. मात्रा से उपकला कोशिकाओं के 3 भागों के साथ स्ट्रॉमल कोशिकाओं के 1 भाग का मिश्रण।
    4. अगरोज़ मोल्ड के सेल सीडिंग चैम्बर में संयुक्त सेल निलंबन के पिपेट 50 डिग्री एल (60,000 कोशिकाओं)।
    5. एक बार agarose मोल्ड कोशिकाओं से भर रहे हैं, ध्यान से 24 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से ताजा organoid मीडिया के 400 $L जोड़ें.
      नोट: माध्यम agarose व्यंजन की सतह के ठीक नीचे तक पहुँचता है और कोशिकाओं को मोल्ड से बाहर तैरने के लिए कारण नहीं होगा. 2 डिग्री 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं को व्यवस्थित और organoids बनाने के लिए शुरू कर देंगे।
    6. organoid मीडिया के 500 $L के साथ हर दूसरे दिन मध्यम बदलें.
    7. 2-3 दिनों के बाद, एक है कि 0.1 एनएम एस्ट्राडियोल (ई) और 0.8 एनएम टेस्टोस्टेरोन (टी) उपकला और stromal कोशिकाओं के संगठन को बढ़ावा देने के साथ पूरक है करने के लिए मध्यम बदलें.
      नोट: हालांकि उपकला और stromal कोशिकाओं के संगठन के साथ या हार्मोन के बिना हो सकता है, अधिक organoids हार्मोन की उपस्थिति में आयोजित करेगा.

3. प्रयोगों के लिए कटाई एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड्स

नोट: प्रयोग किया जाता है के बाद, एंडोमेट्रियल organoids ऊतक विज्ञान या आरएनए विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है। निम्न चरणों में organoids संसाधित करने के तरीके का वर्णन.

  1. प्रोटोकॉल
    1. उबलते हुए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में 1.5% आगारोस को भंग करें। तरल agarose लगभग 50 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
    2. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, 24-वेल प्लेट को झुकाएं और ध्यान से अगरोस मोल्ड के बाहर से माध्यम को बाहर निकाल लें। ऑर्गनॉइड्स को बाधित करने से बचने के लिए आगारोस मोल्ड के इंटीरियर से माध्यम को ध्यान से पिपेट आउट करें।
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से पिपेट 70-75 गर्म (50 डिग्री सेल्सियस) के एल agarose पकवान के कक्ष में agarose. organoids परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहें।
    4. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करते हैं।
    5. 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) जोड़ें और पूरे सील agarose मोल्ड को ठीक करें जिसमें रात भर organoids 4 डिग्री सेल्सियस पर होते हैं। फिर पैराफिन embedding के लिए प्रक्रिया करने के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में स्टोर।
  2. आरएनए विलगन
    1. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, 24-वेल प्लेट को झुकाएं और ध्यान से अगरोस मोल्ड के कक्ष से माध्यम को पाइपेट करें।
    2. जबरदस्ती पिपेट 1 एमएल ताजा ऑर्गेन्गॉइड मीडियम सीधे अगारोस मोल्ड में होता है ताकि ऑर्गनॉइड्स को माइक्रोवेल्स से बाहर निकाल दिया जाता है। बहुत सारे बुलबुले बनाने के लिए नहीं सावधान रहें।
    3. 3.2.2 कदम से एक ही माध्यम के साथ फिर से पाइपिंग दोहराएँ.
    4. सभी माध्यम organoids युक्त लीजिए. organoids इकट्ठा करने और आरएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ने के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज।

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Representative Results

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प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दर्शाया गया है। पैथोलॉजिस्ट द्वारा जांच किए जाने के बाद गर्भाशय ऊतक सर्जरी से प्राप्त किया गया था। एंडोमेट्रियल अस्तर स्क्रैपिंग द्वारा मायोमेट्रियम से अलग किया गया था और एंडोमेट्रियल ऊतक प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में कोशिकाओं को एंजाइमी रूप से पचा गया था। एपिथेलियल और स्ट्रॉमल कोशिकाओं को अगारोस मोल्ड में माइक्रोवेल्स में जोड़ा गया था। संस्कृति में 7 दिनों के बाद, organoids एक अतिरिक्त 7 डिग्री 14 दिनों के लिए ई और टी के साथ इलाज किया गया.

हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग के लिए, एंडोमेट्रियल ऑर्गनॉइड्स वाले एग्रोस मोल्ड्स को एग्रोस के साथ सील कर दिया गया था जिसके बाद रात भर 4% पीएफए के साथ निर्धारण किया गया था। इन मोल्डों को मानक पैराफिन embedding के लिए संसाधित किया गया, खंड और ऊतक विज्ञान, इम्यूनोफ्लोरेसींस या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए दाग। हेमेटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला (चित्र 2) ने एक गोलभ-जैसी संरचना का पता लगाया जिसमें बाहर की कोशिकाओं और केंद्र में कोशिकाओं की एक परत होती है। एंडोमेट्रियल उपकला (ई-कैडेरिन) और स्ट्रोमल कोशिकाओं (विमेंटिन) के लिए सेल-विशिष्ट मार्करों ने केंद्र में स्ट्रॉमल कोशिकाओं के साथ ऑर्गनॉइड के आसपास की उपकला कोशिकाओं का पता लगाया (चित्र 2बी)।

एंडोमेट्रियल फिजियोलॉजी के मार्करों ने पुष्टि की कि एंडोमेट्रियल organoids देशी ऊतक की कुछ विशेषताओं को बनाए रखा. Trichrome धुंधला, जो कोलेजन नीले और लाल कोशिकाओं दाग, केंद्र के भीतर कोलेजन की उपस्थिति से पता चला जहां stromal कोशिकाओं रहते थे, सक्रिय उत्पादन और देशी ऊतक के समान stromal कोशिकाओं द्वारा कोलेजन के स्राव का प्रदर्शन (चित्र 3 एक) इसके अलावा, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स की उपस्थिति से पता चला (ईआर), एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स (एआर), और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर्स (पीआर) दोनों उपकला और स्ट्रॉमल कोशिकाओं में (चित्रा 3बी)।

Figure 1
चित्रा 1: मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल कोशिकाओं से पाड़ मुक्त 3 डी एंडोमेट्रियल organoids की पीढ़ी. गर्भाशय के ऊतकों को पूर्व मेमेनोपॉज़ल एंडोमेट्रियल ऊतकों से सौम्य विकृति के साथ प्राप्त किया गया था और एंडोमेट्रियल अस्तर ऊतक के टुकड़े से निकाला गया था। एंजाइमी पाचन पर, एंडोमेट्रियल उपकला और स्ट्रॉमल कोशिकाओं को मात्रा से 3:1 अनुपात में 1.5% agarose मोल्ड में बीज ित किया गया और 7 दिनों तक सेक्स हार्मोन मुक्त माध्यम में बनाए रखा गया। एस्ट्राडियोल (ई) और टेस्टोस्टेरोन (टी) को 3 डी संस्कृतियों में जोड़ा गया था ताकि मासिक धर्म चक्र10 के कूपिक चरण के दौरान ई और टी के स्तर की नकल की जा सके और organoids के संगठन को बढ़ावा दिया जा सके। Teerawat एट अल से अनुकूलित, JCEM, (2019)11|

Figure 2
चित्र 2: एंडोमेट्रियल organoids पर सेल विशिष्ट मार्करों के ऊतकों और इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला. organoids चरणवार हार्मोन उपचार के 14 दिनों के बाद मनाया गया एक सामान्य मासिक धर्म चक्र के कूपिक चरण नकल (0.1 एनएम ई और 0.8 एनएम टी 7 दिनों के लिए, 1 एन एम ई और 0.8 एनएम टी एक अतिरिक्त 6 दिनों के लिए, उसके बाद 1 एनएम ई और 1.25 एन एम टी 1 दिन के लिए)। (ए)एच एंड ई दाग पैराफिन एम्बेडेड organoids पर किया गया था। (बी) सेल विशिष्ट मार्करों ई-कैडरिन (एपिथेलियल, लाल), विमेंटिन (स्ट्रोमल, हरे) और 4 ,6-diamidino-2-फेनिलिनो (डीएपीआई; नाभिक, नीले) के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जिसमें कोशिकाओं के संरचनात्मक संगठन का पता चला organoids. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. टेरावत एट अल., जेसीईएम, (2019) से अनुकूलित;11. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अंत:केंद्रीय अंगभों ने कूपिक प्रावस्था हार्मोन उपचार के 14 दिनों के बाद देशी ऊतक की विशेषताओंको प्रदर्शित किया है . (ए) ट्राइक्रोम धुंधला कोलेजन (नीले) और कोशिकाओं (लाल) कल्पना करने के लिए किया गया था। त्रिक्रोम दाग एंडोमेट्रियल ऊतक (बाएं पैनल) और एंडोमेट्रियल organoids (स्केल सलाखों ] 20 डिग्री मीटर, सही पैनल पर किया गया था। (बी) ईआर, ए आर और पीआर के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला एंडोमेट्रियल ऊतक (स्केल बार $ 100 डिग्री सेल्सियस नीचे पैनल) और एंडोमेट्रियल organoids (स्केल बार $ 20 डिग्री, शीर्ष पैनलों) में किया गया था। सकारात्मक दाग भूरे रंग में दिखाया गया है और hematoxylin दाग समाधान काउंटर दाग नीले रंग में दिखाया गया के रूप में जोड़ा गया था. Teerawat एट अल से अनुकूलित, JCEM, (2019)11कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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हमने बहिर्जात पाड़ सामग्री के उपयोग के बिना एंडोमेट्रियम के उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं के शामिल मानव एंडोमेट्रियल organoids उत्पन्न किया है। हालांकि यह पहले से ही दिखाया गया है कि प्राथमिक एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाएं organoids6,7बना सकती हैं , इन कोशिकाओं को माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन के एक जिलेटिन मैट्रिक्स में एम्बेडेड किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें ) मदद करने के लिए रूप गोलभयाड की तरह संरचनाओं. इसके अलावा, एंडोमेट्रियल स्ट्रॉमल कोशिकाएं अनुपस्थित थीं। हम सोचते हैं कि हमारे सिस्टम में stromal कोशिकाओं, जो एंडोमेट्रियल ऊतक का एक आवश्यक सहायक घटक है, उपकला कोशिकाओं के लिए पाड़ प्रदान करने के लिए का पालन करें और paracrine संकेतन सेल प्रकार के बीच हुई. स्ट्रोमल कोशिकाओं के चारों ओर उपकला कोशिकाओं के संगठन ने दो कोशिका प्रकारों के बीच सक्रिय संपर्क का संकेत दिया जो शारीरिक संकेत प्रदान करता है। एंडोमेट्रियम की हार्मोनल प्रतिक्रिया उपकला और स्ट्रोमल कोशिकाओं के बीच पैराक्रिन इंटरैक्शन पर निर्भर करती है4,8,9, हमारे बहुकोशिकीय organoids देशी के एक वैकल्पिक, अधिक जटिल नकल प्रदान करते हैं ऊतक.

organoids कि यहाँ उत्पन्न किए गए थे ज्यादातर दैहिक कोशिकाओं थे, हालांकि कोशिकाओं का एक छोटा सा प्रतिशत स्टेम की तरह था. हम अभी तक कई पीढ़ियों के लिए इन organoids पारित नहीं किया है और पता नहीं है अगर वे जीवित है और प्रचार होगा. इसके अलावा, एंडोमेट्रियल organoids प्रकृति में विषम हैं कि नहीं सभी organoids उपकला, stromal या स्टेम कोशिकाओं की एक ही संख्या निहित, यहां तक कि एक ही ऊतक से उत्पन्न उन. organoids के आकार भी भिन्न है और जबकि ज्यादातर कोशिकाओं संरचनाओं की तरह गोलभ का गठन, प्रत्येक microwell के भीतर ढीली कोशिकाओं मनाया गया. ई और टी की उपस्थिति केंद्र में बाहर और stromal कोशिकाओं अस्तर उपकला कोशिकाओं के विशिष्ट संगठन के साथ organoid गठन को बढ़ावा देने के लिए दिखाई दिया. हम परीक्षण नहीं किया है कि क्या ई या टी अकेले organoid गठन को बढ़ावा देने और क्या उपचार के इष्टतम लंबाई होगा. मानकों और शर्तों का अतिरिक्त परीक्षण योजना बनाई प्रयोग के लिए अनुकूल आदर्श एंडोमेट्रियल organoids उत्पन्न करने के लिए फायदेमंद होगा.

मध्यम विकास और अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए organoids culturing का एक महत्वपूर्ण घटक है. एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के साथ काम करने में हमारे अनुभव से, संस्कृति में उपकला कोशिकाओं का विकास स्ट्रॉमल कोशिकाओं के विपरीत सबसे चुनौतीपूर्ण है जो अच्छी तरह से प्रचार ित तेह्रथाप करते हैं। विभिन्न मीडिया का परीक्षण किया गया, पसंद के organoid मीडिया सहित (सामग्री की तालिका),जो स्तन कैंसर के mammospheres और ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो उपकला सेल मूल के हैं. हमारे परीक्षणों से पता चला है कि इस माध्यम organoids 14 डिग्री 28 दिन संस्कृतियों के दौरान अपनी संरचनात्मक अखंडता और व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अनुमति दी. स्ट्रॉमल कोशिकाओं पर इस माध्यम के प्रभाव, हालांकि, अतिरिक्त जांच की जरूरत है। organoid मीडिया में कोलेजन के अपने अस्तित्व और उत्पादन के बावजूद, 3 डी संस्कृति में मनाया प्रसार दर monolayers की तुलना में बहुत कम था. कमी प्रसार हालांकि 3 डी संरचना के कारण के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है. यह देखते हुए कि इस्तेमाल किया organoid मीडिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, मध्यम घटकों अपने स्वामित्व प्रकृति के कारण स्पष्ट नहीं रह.

भविष्य के अध्ययनों में, हम एंडोमेट्रियम और प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित एंडोमेट्रियम में पाए जाने वाले अन्य सेल प्रकारों को शामिल करने के लिए इन एंडोमेट्रियल organoids की जटिलता को बढ़ाने की कल्पना करते हैं। यह सिर्फ इंजीनियरिंग की शुरुआत है एक पूर्ण एंडोमेट्रियल नकल कि जीव विज्ञान, समारोह, रोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और दवाओं का परीक्षण.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनआईईएचएस/एनआईएच/एनकैट्स UG3 अनुदान (ES029073) और नॉर्थवेस्टर्न फेनबर्ग स्कूल ऑफ मेडिसिन ब्रिज फंड (जेजेके) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पैराफिन embedding के लिए निश्चित organoids प्रसंस्करण के लिए उत्तर पश्चिमी पैथोलॉजी कोर सुविधा स्वीकार करना चाहते हैं. हम व्यावहारिक विचार विमर्श और सहयोग के लिए वुडरफ, Burdette, और Urbanek प्रयोगशालाओं सहित पूरे UG3 टीम को स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix - Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film - Parafilm VWR 52858-000

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References

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बहुकोशिकीय मानव प्राथमिक एंडोमेट्रियल ऑर्गेनॉइड्स का उत्पादन
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Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).More

Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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