Summary

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

Abstract

O endométrio humano é um dos tecidos mais responsivos hormonalmente no corpo e é essencial para o estabelecimento da gravidez. Este tecido também pode tornar-se doente e causar morbidade e até mesmo a morte. Os sistemas modelo para estudar a biologia endometrial humana foram limitados aos sistemas in vitro da cultura de únicos tipos da pilha. Além disso, as células epiteliais, um dos principais tipos de células do endométrio, não se propagam bem ou mantêm suas características fisiológicas na cultura e, portanto, nossa compreensão da biologia endometrial permanece limitada. Nós geramos, pela primeira vez, os organóides endometrial que consistem em pilhas epithelial e stromal do endométrio humano. Estes organóides não exigem nenhuns materiais exógenos do andaime e organizam-se especificamente de modo que as pilhas epithelial engloquem a estrutura spheroid-like e se tornem polarizada com as pilhas stromal no centro que produzem e secretam o colagénio. Os receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno são expressos nas células epiteliais e estromais e tratamento com níveis fisiológicos de estrogênio e testosterona promovem a organização dos organóides. Este novo modelo de sistema pode ser usado para estudar a biologia endometrial normal e doença de maneiras que não eram possíveis antes.

Introduction

O endométrio humano alinha a cavidade uterine e sere como o primeiro contato para o embrião durante a implantação. O endométrio é composto de células epiteliais luminais e glandulares, fibroblastos estromais favoráveis, células endoteliais e células imunes. Juntos, esses tipos de células compõem o tecido endometrial, que é um dos tecidos mais responsivos aos hormônios esteróides sexuais1. As mudanças que ocorrem durante cada ciclo menstrual são impressionantes. O crescimento e a remodelação apropriados do endométrio são exigidos para permitir que a implantação do embrião ocorra. A resposta aberrante ao estrogênio e progesterona pode resultar em um endométrio refratário que não permite o estabelecimento bem-sucedido da gravidez e pode até resultar em doenças, incluindo neoplasia endometrial.

A fim de estudar as respostas hormonais e alterações essenciais que ocorrem no endométrio, as células dos tecidos endometriais extirpada de pacientes durante a cirurgia ou biópsia endometrial têm sido propagadas na cultura celular. Células estromais endometriais preferencialmente proliferam e se propagam prontamente, e o processo de diferenciação induzido pela progesterona pode ser recapitulado in vitro. Como resultado, muita coisa foi aprendida durante esse processo de diferenciação, denominada decidualização2,3. O outro tipo principal da pilha no endométrio, as pilhas epithelial Luminal e glandular, entretanto, não cresce bem como monolayers tradicionais, perdendo a polaridade, tornando-se senescent, e tendo o potencial proliferative limitado. Como resultado, menos é conhecido de sua biologia e seu papel no endométrio humano. Como muitas Neoplasias se originam das células epiteliais, os mecanismos associados à hiperplasia ou transformação de células cancerosas permanecem totalmente definidos. Além disso, estudos estabeleceram que a resposta hormonal envolve as ações paracrinas íntimas entre as células epiteliais e estromais do endométrio4,5.

Recentemente, umacultura organoid tridimensional (3D) de pilhas epithelial endometrial foi estabelecida por dois grupos independentes6,7, quesão os primeiros relatórios dos organóides dados forma do tecido endometrial. Estes organóides foram compreendidos das pilhas epithelial endometrial encaixadas dentro de uma matriz da proteína (tabela dos materiais) e não incluiu um compartimento hormonalmente responsivo importante do endométrio endometrial, os fibroblasto stromal. Como as proteínas da matriz podem variar de lote para lote e pode desencadear vias de sinalização que não ocorrem necessariamente no tecido, seria ideal para substituir as proteínas da matriz com componentes do endométrio. No estudo atual, um protocolo para gerar organóides endometrial humanos Scaffold-livres de pilhas epithelial e stromal do endométrio humano é apresentado. A presença de células estromais não só fornece o suporte para células epiteliais, mas também fornece as ações paracrinas necessárias que foram estabelecidas para serem importantes para a resposta hormonal endometrial4,8,9 .

O organoid endometrial multicelular novo oferece um sistema modelo do endométrio que é simples de gerar e que incorpora pilhas epithelial e stromal. Estes organóides podem ser usados para estudar as mudanças hormonais a longo prazo e os eventos adiantados da doença tais como o tumorigênese devido ao desequilíbrio hormonal ou aos insultos exógenos. A complexidade destes organóides poderia eventualmente ser expandida para incluir outros tipos da pilha, incluindo pilhas endothelial e imunes com as pilhas possivelmente myometrial para imitar verdadeiramente a fisiologia humana do tecido.

Protocol

Amostras endometriais foram coletadas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia de rotina para condições uterinas benignas no hospital das mulheres da Universidade do noroeste, de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional. O consentimento por escrito foi obtido de todas as mulheres incluídas no estudo. 1. preparação de moldes de agarose Antes do início da célula de isolamento, elenco e equilibrar 1,5% agarose micro moldes (ta…

Representative Results

Um esquema do protocolo é representado na Figura 1. O tecido uterine foi obtido da cirurgia depois que foi examinado por patologistas. O forro endometrial foi separado do miométrio raspando e o tecido endometrial foi digerido enzimaticamente às pilhas como esboçado no protocolo. As pilhas epithelial e stromal foram adicionadas em micropoços nos moldes do agarose. Após 7 dias na cultura, os organóides foram tratados com o e e o T por uns 7 − 14 dias adicionais. <p class="jove_con…

Discussion

Nós geramos os organóides endometrial humanos compreendidos das pilhas epithelial e stromal do endométrio sem o uso de materiais exógenos do andaime. Embora já tenha sido demonstrado que as células epiteliais do endométrio primário podem formar organóides6,7, essascélulas foram encaixadas em uma matriz gelatinosa de proteínas secretadas por células de sarcoma de camundongo (ver tabela de materiais) para ajudar forma spheroid-como estr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado pela NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) e pela Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Nós gostaríamos de reconhecer a facilidade do núcleo da patologia do noroeste para processar os organóides fixos para a incorporação da parafina. Gostaríamos de reconhecer toda a equipe UG3, incluindo os laboratórios Woodruff, Burdette e Urbanek para as discussões e colaborações perspicazes.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

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Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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