Summary

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Представлен протокол для генерации первичных органов эндометрия, которые состоят из эпителиальных и стромальных клеток и сохраняют характеристики родной ткани эндометрия. Этот протокол описывает методы от приобретения тканей матки до гистологической обработки эндометрийных органоидов.

Abstract

Эндометрий человека является одним из самых гормональны реагировать тканей в организме и имеет важное значение для установления беременности. Эта ткань также может стать больной и вызвать заболеваемость и даже смерть. Модельные системы для изучения биологии эндометрия человека были ограничены системами культуры in vitro одного типа клеток. Кроме того, эпителиальные клетки, один из основных типов клеток эндометрия, не распространяются хорошо или сохранить свои физиологические черты в культуре, и, таким образом, наше понимание биологии эндометрия остается ограниченным. Мы впервые создали органоиды эндометрия, которые состоят как из эпителиальных, так и из стромальных клеток эндометрия человека. Эти органоиды не требуют каких-либо экзогенных материалов эшафот и специально организовать так, что эпителиальные клетки охватывают сфероидной структуры и становятся поляризованными с стромальных клеток в центре, которые производят и выделяют коллаген. Эстроген, прогестерон и андрогенные рецепторы выражаются в эпителиальных и стромальных клетках и лечение физиологическими уровнями эстрогена и тестостерона способствуют организации органоидов. Эта новая модель системы может быть использована для изучения нормальной биологии эндометрия и болезней таким образом, что не было возможно раньше.

Introduction

Эндометрий человека выстраивал полость матки и служит первым контактом для эмбриона во время имплантации. Эндометрий состоит из светящихся и железистых эпителиальных клеток, поддерживающих стромальных фибробластов, эндотелиальных клеток и иммунных клеток. Вместе, эти типы клеток составляют ткани эндометрия, которая является одним из наиболее отзывчивых тканей для половых стероидных гормонов1. Изменения, которые происходят во время каждого менструального цикла поразительны. Надлежащий рост и реконструкция эндометрия необходимы для проведения имплантации эмбриона. Аномальная реакция на эстроген и прогестерон может привести к огнеупорной эндометрия, что не позволяет для успешного установления беременности и может даже привести к заболеваниям, включая неоплазию эндометрия.

Для того, чтобы изучить гормональные реакции и существенные изменения, которые происходят в эндометрии, клетки из тканей эндометрия, вырезанные из пациентов во время операции или биопсии эндометрия были распространены в клеточной культуре. Эндометрия стромальные клетки преимущественно размножаться и распространяться легко, и процесс дифференциации индуцированных прогестерона можно резюмировать в пробирке. В результате, многое было изучено в ходе этого процесса дифференциации, называется decidualization2,3. Другой основной тип клеток в эндометрии, светящиеся и железистые эпителиальные клетки, однако, не растут хорошо, как традиционные монослои, теряя полярность, становясь старческим, и имеющие ограниченный пролиферативный потенциал. В результате, меньше известно об их биологии и их роли в эндометрии человека. Поскольку многие неоплазии происходят из эпителиальных клеток, механизмы, связанные с гиперплазией или преобразованием в раковые клетки, еще предстоит полностью определить. Кроме того, исследованияустановили,что гормональный ответ включает в себя интимные действия паракрина между эпителией и стромальными клетками эндометрия4,5.

Недавно трехмерная (3D) органоидная культура эпителиальных клеток эндометрия была установлена двумя независимыми группами6,7,которые являются первыми сообщениями о органоидациях, образованных из ткани эндометрия. Эти органоиды состояли из эндометриальных эпителиальных клеток, встроенных в белковую матрицу(Таблица Материалов)и не включали в себя важный гормонально отзывчивый отсек эндометрия эндометрия, стромальных фибробластов. Поскольку матричные белки могут варьироваться от партии к партии и могут вызвать сигнальные пути, которые не обязательно происходят в тканях, было бы идеально заменить матричные белки компонентами эндометрия. В текущем исследовании представлен протокол для создания бесхозных эндометрийских органоидов эпителии и стромальных клеток эндометрия человека. Наличие стромальных клеток не только обеспечивает поддержку эпителиальных клеток, но и обеспечивает необходимые действия паракринных, которые были установлены, чтобы быть важным для реакции гормона эндометрия4,8,9 .

Новый многоклеточный органоид эндометрия предлагает модельную систему эндометрия, которая проста в генерации и которая включает в себя как эпителиальные, так и стромальные клетки. Эти органоиды могут быть использованы для изучения долгосрочных гормональных изменений и ранних событий болезни, такие как опухолевый из-за гормонального дисбаланса или экзогенных оскорблений. Сложность этих органоидов в конечном итоге может быть расширена, чтобы включить другие типы клеток, в том числе эндотелиальных и иммунных клеток с возможно миометрийных клеток, чтобы действительно имитировать физиологии тканей человека.

Protocol

Образцы эндометрия были собраны у женщин в предменопаузе, проходящих рутинную гистерэктомию для доброкачественных заболеваний матки в Северо-Западном университете Prentice Women’s Hospital, в соответствии с институциональным обзором Совета утвержденных протокола. Письменное согласие было пол?…

Representative Results

Схема протокола изображена на рисунке 1. Ткань матки была получена после операции после того, как была обследована патологоанатомами. Эндометрия подкладка была отделена от миометрия путем соскабливания и ткани эндометрия была ферментативно переваривается в клетки, ка?…

Discussion

Мы создали органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия без использования экзогенных эшафотных материалов. Хотя уже было показано, что первичные эпителиальные клетки эндометрия могут образовывать органоиды6,7<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было профинансировано NIEHS/NIH/NCATS UG3 грант (ES029073) и Северо-Западной Школы Фейнберга медицины мост фонда (JJK). Мы хотели бы отметить Северо-Западной патологии Основной фонд для обработки фиксированных органоидов для встраивания парафина. Мы хотели бы отметить всю команду UG3, включая лаборатории Woodruff, Burdette и Urbanek, за глубокие дискуссии и сотрудничество.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

View Video