Summary

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.

Abstract

El endometrio humano es uno de los tejidos más hormonalmente sensibles en el cuerpo y es esencial para el establecimiento del embarazo. Este tejido también puede enfermarse y causar morbilidad e incluso la muerte. Los sistemas modelo para estudiar la biología endometrial humana se han limitado a los sistemas de cultivo in vitro de tipos de células únicas. Además, las células epiteliales, uno de los principales tipos celulares del endometrio, no propagan bien ni conservan sus rasgos fisiológicos en el cultivo, y por lo tanto nuestra comprensión de la biología endometrial sigue siendo limitada. Hemos generado, por primera vez, organoides endometriales que consisten en células epiteliales y estromales del endometrio humano. Estos organoides no requieren ningún material de andamio exógeno y se organizan específicamente para que las células epiteliales abarquen la estructura similar a los esferoides y se polarericen con células estromales en el centro que producen y secretan colágeno. Los receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos se expresan en las células epiteliales y estromales y el tratamiento con niveles fisiológicos de estrógeno y testosterona promueven la organización de los organoides. Este nuevo sistema modelo se puede utilizar para estudiar la biología endometrial normal y la enfermedad de maneras que antes no eran posibles.

Introduction

El endometrio humano recubre la cavidad uterina y sirve como primer contacto para el embrión durante la implantación. El endometrio se compone de células epiteliales luminales y glandulares, fibroblastos estromales de apoyo, células endoteliales y células inmunitarias. Juntos, estos tipos de células conforman el tejido endometrial que es uno de los tejidos más sensibles a las hormonas esteroides sexuales1. Los cambios que ocurren durante cada ciclo menstrual son sorprendentes. Se requiere un crecimiento y remodelación adecuados del endometrio para permitir la implantación de embriones. Respuesta aberrante al estrógeno y la progesterona puede resultar en un endometrio refractario que no permite el establecimiento exitoso del embarazo e incluso puede resultar en enfermedades como la neoplasia endometrial.

Con el fin de estudiar las respuestas hormonales y los cambios esenciales que se producen en el endometrio, las células de los tejidos endometriales exhalados de los pacientes durante la cirugía o la biopsia endometrial se han propagado en el cultivo celular. Las células estromales endometriales proliferan y propagan fácilmente, y el proceso de diferenciación inducido por la progesterona puede recapitularse in vitro. Como resultado, mucho se ha aprendido durante este proceso de diferenciación, llamado decidualización2,3. El otro tipo de célula importante en el endometrio, las células epiteliales luminales y glandulares, sin embargo, no crecen bien como las monocapas tradicionales, perdiendo polaridad, convirtiéndose en senescente, y teniendo un potencial proliferativo limitado. Como resultado, se sabe menos de su biología y su papel en el endometrio humano. Como muchas neoplasias se originan a partir de las células epiteliales, los mecanismos asociados con la hiperplasia o la transformación a las células cancerosas siguen estando completamente definidos. Además, los estudios han establecido que la respuesta hormonal implica las acciones paracrinos íntimas entre las células epiteliales y estromales del endometrio4,5.

Recientemente, dos grupos independientes6,7,que son los primeros informes de organoides formados a partir de tejido endometrial, estableció un cultivo organoide tridimensional (3D) de células epiteliales endometriales. Estos organoides estaban compuestos de células epiteliales endometriales incrustadas dentro de una matriz proteica(Tabla de Materiales)y no incluían un compartimiento sensible hormonalmente importante del endometrio endometrial, los fibroblastos estromales. Como las proteínas de la matriz pueden variar de un lote a un lote y pueden desencadenar vías de señalización que no necesariamente se producen en el tejido, sería ideal reemplazar las proteínas de matriz con componentes del endometrio. En el estudio actual, se presenta un protocolo para generar organoides endometriales humanos libres de andamios de células epiteliales y estromales del endometrio humano. La presencia de células estromales no sólo proporciona el apoyo a las células epiteliales, sino que también proporciona las acciones paracrinos necesarias que se han establecido para ser importantes para la respuesta de la hormona endometrial4,8,9 .

El nuevo organoide endometrial multicelular ofrece un sistema modelo del endometrio que es fácil de generar y que incorpora células epiteliales y estromales. Estos organoides se pueden utilizar para estudiar cambios hormonales a largo plazo y eventos tempranos de enfermedad como la tumorigenesis debido a desequilibrio hormonal o insultos exógenos. La complejidad de estos organoides podría eventualmente ampliarse para incluir otros tipos celulares, incluyendo células endoteliales e inmunes con células posiblemente miometriales para imitar realmente la fisiología del tejido humano.

Protocol

Se recogieron muestras de endometriales de mujeres premenopáusicas sometidas a histerectomía de rutina para afecciones uterinas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad Northwestern Prentice, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todas las mujeres incluidas en el estudio. 1. Preparación de moldes de agarosa Antes del inicio del aislamiento celular, moldee y equilibra 1.5% micromoldes de …

Representative Results

En la Figura 1se muestra un esquema del protocolo. El tejido uterino se obtuvo de la cirugía después de que fue examinado por los patólogos. El revestimiento endometrial se separó del miometrio raspando y el tejido endometrial se digería enzimáticamente a las células como se describe en el protocolo. Las células epiteliales y estromales se añadieron a los micropozos en los moldes de agarosa. Después de 7 días en cultivo, los organoides fueron tratados con E y T durante 7 a 14 día…

Discussion

Hemos generado organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Si bien ya se ha demostrado que las células epiteliales endometriales primarias pueden formar organoides6,7, estas células se incrustaron en una matriz gelatinosa de proteínas secretadas por las células del sarcoma del ratón (ver Tabla de Materiales)para ayudar a forman estructuras es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue financiado por la subvención NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) y el fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nos gustaría reconocer el Centro Básico de Patología del Noroeste para procesar los organoides fijos para la incrustación de parafina. Nos gustaría reconocer a todo el equipo de UG3, incluidos los laboratorios Woodruff, Burdette y Urbanek, por las discusiones y colaboraciones perspicaces.

Materials

Agarose HS, molecular biology grade Denville Scientific CA3510-6
Agarose molds Sigma-Aldrich Z764043 (https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl) Amresco 0621
β-Estradiol Sigma-Aldrich E2257
Collagenase, Type II, powder Thermo Fisher Scientific 17101015
Dispase Corning 354235
DNase I Sigma-Aldrich D4513
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Eosin Stain VWR 95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium Sigma-Aldrich F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution Thermo Fisher Scientific 3530-32 Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution STEMCELL Technologies 07980 added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution STEMCELL Technologies 07925 added to MammoCult media
Organoid media – Mammocult STEMCELL Technologies 05620 supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4 Sigma-Aldrich P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant Agilent Technologies M356801-2
protein matrix – Matrigel BD Biosciences 356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody BD Biociences 610181 Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] Abcam ab92547
RNA lysis and isolation kit Zymo Research R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Testosterone Sigma-Aldrich 86500
Trichrome Stain Abcam ab150686
Wax film – Parafilm VWR 52858-000

References

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Cite This Article
Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60384, doi:10.3791/60384 (2019).

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