Ett protokoll för att generera mänskliga primära endometrieorganoider som består av epitelial och stromaceller och behålla egenskaperna hos den infödda endometrievävnad presenteras. Detta protokoll beskriver metoder från livmoder vävnad förvärv till histologisk behandling av endometrieorganoider.
Den mänskliga endometriet är en av de mest hormonellt lyhörd vävnader i kroppen och är avgörande för upprättandet av graviditeten. Denna vävnad kan också bli sjuka och orsaka sjuklighet och till och med döden. Modellsystem för att studera Human endometriebiologi har begränsats till in vitro-kultursystem av enstaka celltyper. Dessutom, de epitelceller, en av de stora celltyper av endometrium, inte propagera väl eller behålla sina fysiologiska egenskaper i kulturen, och därmed vår förståelse av endometriebiologi förblir begränsad. Vi har för första gången genererat endometrieorganoider som består av både epiteliala och stromaceller i det mänskliga endometrium. Dessa organoider inte kräver några exogena byggnadsmaterial och särskilt organisera så att epitelceller omfattar sfäroid-liknande struktur och bli polariserad med stromaceller i centrum som producerar och utsöndrar kollagen. Östrogen, progesteron och androgenreceptorer uttrycks i epitelial och stromacellstumörer celler och behandling med fysiologiska nivåer av östrogen och testosteron främja organisationen av organoider. Detta nya modellsystem kan användas för att studera normal endometriebiologi och sjukdom på ett sätt som inte var möjligt tidigare.
Den mänskliga endometriet linjer livmoderhålan och fungerar som den första kontakten för embryot under implantation. Endometriet består av luminala och körtel epitelceller, stödjande stromacellstumörer fibroblaster, endotelceller och immunceller. Tillsammans, dessa celltyper utgör endometrievävnaden som är en av de mest responsiva vävnaderna till könshormonhormoner1. De förändringar som sker under varje menstruationscykeln är slående. Lämplig tillväxt och ombyggnad av endometriet krävs för att möjliggöra embryoimplantation förekomma. Aberrant svar på östrogen och progesteron kan resultera i en refraktär endometriet som inte tillåter för framgångsrik etablering av graviditet och kan även resultera i sjukdomar inklusive endometrieneoplasi.
För att studera hormon svaren och väsentliga förändringar som förekommer i endometrium, celler från endometrievävnader exciderade från patienter under kirurgi eller endometriebiopsi har propagerats i cellkulturen. Endometrial stromaceller celler företrädesvis föröka och propagera lätt, och processen för differentiering induceras av progesteron kan återfått in vitro-. Som ett resultat, mycket har lärt sig under denna differentiering process, kallas decidualization2,3. Den andra stora celltyp i endometrium, den luminala och körtel epitelceller, dock, inte växa bra som traditionella monolayers, förlora polaritet, blir senescent, och har begränsad proliferativ potential. Som ett resultat, mindre är känt av sin biologi och deras roll i det mänskliga endometrium. Så många neoplasi härstammar från epitelceller, mekanismer i samband med hyperplasi eller omvandling till cancerceller återstår att vara fullt definierade. Vidare, studier har fastställt att hormon svar innebär intima parakrin åtgärder mellan epitelial och stromaceller i endometriet4,5.
Nyligen, en tredimensionell (3D) Organoid kultur av endometrieepitelceller inrättades genom två oberoende grupper6,7, som är de första rapporterna av organoider bildas från endometrievävnad. Dessa organoider bestod av endometrieepitelceller inbäddade i en protein matris (tabell över material) och innehöll inte en viktig hormonellt lyhörd fack av endometrieendometriet, den stromacellstumörer fibroblaster. Eftersom Matrix-proteinerna kan variera från Lot till Lot och kan utlösa signalvägar som inte nödvändigtvis förekommer i vävnaden, skulle det vara idealiskt att ersätta Matrix-proteinerna med komponenter i endometrium. I den aktuella studien, ett protokoll för att generera scaffold-fria mänskliga endometrieorganoider av epiteliala och stromaceller i det mänskliga endometriet presenteras. Närvaron av stromaceller inte bara ger stöd för epitelceller utan också ger de nödvändiga parakrin åtgärder som har fastställts för att vara viktiga för endometriehormon svar4,8,9 .
Den nya multicellulära endometrieorganoid erbjuder ett modellsystem av endometriet som är enkel att generera och som innehåller både epitelial och stromaceller. Dessa organoider kan användas för att studera långsiktiga hormonella förändringar och tidiga händelser av sjukdom såsom tumorigenes på grund av hormonell obalans eller EXOGEN förolämpningar. Komplexiteten i dessa organoider kan så småningom utvidgas till att omfatta andra celltyper, inklusive endoteliala och immunceller med möjligen kan celler att verkligen efterlikna människans vävnadfysiologi.
Vi har genererat mänskliga endometrieorganoider bestående av epiteliala och stromaceller i endometriet utan användning av exogena byggnadsmaterial. Även om det redan har visats att primära endometrieepitelceller kan bilda organoider6,7, var dessa celler inbäddade i en gelatinös matris av proteiner som utsöndras av mus sarkom celler (se tabell över material) för att hjälpa form sfäroid-liknande strukturer. Dessutom, endometriestromacel…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) och Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi skulle vilja erkänna den nordvästra patologi Core facility för bearbetning av fasta organoider för paraffin inbäddning. Vi skulle vilja erkänna hela UG3 Team inklusive Woodruff, Burdette och Urbanek Labs för insiktsfulla diskussioner och samarbeten.
Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
Dispase | Corning | 354235 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
Organoid media – Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
protein matrix – Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
Wax film – Parafilm | VWR | 52858-000 |