Summary
We beschrijven een beeldvormings aanpak voor de bepaling van de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor oligomeren geïnduceerd door ligand binding in het plasma membraan van levende cellen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse.
Abstract
Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomisatie, zijn enkele methoden van toepassing voor het detecteren van clustering gebeurtenissen en het meten van de mate van clustering. Hier beschrijven we een beeldvormings benadering om de gemiddelde oligomere toestand van mEGFP-Tagged-receptor-homo complexen in het membraan van levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie gecombineerd met getal en helderheid (N & B) analyse. N & B is een methode die vergelijkbaar is met fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS) en foton Counting histogram (PCH), die gebaseerd zijn op de statistische analyse van de schommelingen van de fluorescentie intensiteit van fluoroforen die in en uit een verlichtings volume tijdens een observatietijd. In het bijzonder is N & B een vereenvoudiging van PCH om informatie te verkrijgen over het gemiddelde aantal eiwitten in oligomere mengsels. De intensiteit fluctuatie amplitudes worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de en het gemiddelde aantal fluor Foren binnen het verlichtings volume. Zo beschouwt N & B alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude verdeling, namelijk de gemiddelde intensiteit en de variantie. Dit is tegelijkertijd de sterkte en de zwakte van de methode. Omdat slechts twee momenten worden overwogen, kan N & B de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar het schat alleen de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin kan het worden toegepast op relatief kleine tijdreeksen (vergeleken met andere moment methoden) van beelden van levende cellen op pixel-voor-pixel basis, simpelweg door de tijds schommelingen van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Het vermindert de effectieve tijd per pixel tot een paar microseconden, waardoor acquisitie in het tijdsbereik van seconden tot milliseconden, die nodig is voor snelle oligomerisatie kinetiek. Ten slotte kunnen grote celgebieden en sub-cellulaire compartimenten worden verkend.
Introduction
We beschrijven een totale interne reflectie fluorescentie-nummer en helderheid (TIRF-N & B) Imaging benadering voor het bepalen van de gemiddelde oligomere toestand van receptor moleculen op het plasma membraan van levende cellen, gericht op het koppelen van de receptor assemblage dynamiek aan de biologische functie van de eiwitten (Figuur 1).
Bij extracellulaire ligand binding initiëren receptoren de intracellulaire signaaltransductie afhankelijk van hun conformatie, oligomerisatie, potentiële co-receptoren en membraan samenstelling. Ondanks het belang en de alomtegenwoordigheid van de receptor oligomerisatie, herkend als een belangrijke gebeurtenis in cellulaire signalering1,2,3,4,5,6, 7, enkele methoden kunnen clustering gebeurtenissen detecteren en meten van de mate van clustering experimentaal8,9. Het confocale volume (x, y ≈ 300 nm, z ≈ 900 nm) is onvoldoende verdwenen voor het aantonen van moleculaire interactie en stoichiometrie, zelfs na optimalisatie door beeld restauratie algoritmen10. De samenstelling van de subeenheid van eiwit oligomeren kan niet op zuiver ruimtelijke basis worden opgelost, zelfs niet door super-resolutie methoden bij x, y-resolutie van 20-70 nm zoals PALM11, Storm12en STED13. Bovendien kan de tijdelijke resolutie (in de volgorde van minuten per afbeelding) kinetiek niet in het bereik van seconden volgen. Enkelvoudige molecuul stap-bleaching lost de stoichiometrie van eiwit oligomeren alleen op als ze immobiel zijn14.
Een van de meest veelzijdige methoden om dichtheid en oligomisatie van fluorescently gelabelde eiwitten binnen enkele afbeeldingen te meten, is de analyse van ruimtelijke intensiteits verdeling (SpIDA), die afhankelijk is van ruimtelijke bemonstering. Het is toepasbaar op zowel chemisch vaste als levende cellen, en maakt het mogelijk de analyse van verschillende gebieden van belang van de cel tegelijkertijd met behulp van standaard fluorescentiemicroscopie15. Als alternatief zijn moment methoden, zoals fluorescentie-correlatie spectroscopie (FCS)16, foton Counting histogram (PCH)17, en aantal en helderheid (N & B)18,19, geschikt voor kwantitatief oligomeren Metingen. Deze methoden analyseren de intensiteit van de fluorescentie schommelingen die in de tijd kunnen worden waargenomen wanneer de fluor Foren zich in en uit een verlichtings volume verspreiden. De amplitudes van de intensiteits schommelingen kunnen op unieke wijze worden beschreven door de moleculaire helderheid van de de (ε) en het gemiddelde aantal fluor Foren (n) binnen het verlichtings volume17 (Figuur 2). Normaalgesproken kan de diffusiecoëfficiënt van de fluor Foren en het gemiddelde aantal moleculen (omgekeerd gerelateerd aan de G (0)-waarde) binnen het verlichtings volume worden verkregen door FCS20. Aangezien de diffusie tijd echter alleen wordt geschaald met de kubieke wortel van de massa, is FCS niet voldoende gevoelig voor het detecteren van veranderingen in molecuulmassa21. In de praktijk, single Color FCS kan niet detecteren door dimerisatie van membraan receptoren. PCH lost mengsels van verschillende oligomeren nauwkeurig op. Met behulp van meer dan twee momenten van de amplitude-verdeling, detecteert het moleculen van verschillende helderheid die hetzelfde verlichtings volume innemen. Scanning FCS22 en ontwikkelingen, zoals de interessante pair-correlatie van moleculaire helderheid (pcomb) approach23, geïntroduceerd om het bereik van toepasbaarheid van fluorescentie correlatie methoden in biologische systemen uit te breiden24 , blijven methoden met één punt ontbreken van snelle metingen in een groot gebied van een cel, waarbij veel opeenvolgende waarnemingen bij elke pixel en het verzamelen van gegevens in de volgorde van seconden worden vereist.
N & B is een vereenvoudigde versie van PCH die alleen de eerste en tweede momenten van de amplitude van de fluorescentie verdeling beschouwt, namelijk de gemiddelde intensiteit, < I >, en de variantie, σ2 (Figuur 2)18,19 en daarom kan het de molaire fractie van onbekende oligomeren in een mengsel niet bepalen, maar slechts schattingen van de gemiddelde oligomerisatie toestand van het mengsel. Niettemin heeft N & B het voordeel van het werken met relatief kleinere tijdreeksen beelden van levende cellen dan PCH per pixel, simpelweg door de schommelingen op de tijd van de intensiteit van de fluorescentie te bewaken. Omdat N & B de tijd per pixel tot een paar microseconden verlaagt, kan het snelle oligomerisatie kinetiek volgen op grote celgebieden, waardoor beeld verwerving op een tijdschaal van seconden in raster scanning microscopie (bijv. confocale, 2-photon) en milliseconden op camera gebaseerde microscopie (bijv. TIRFM).
Verschillende rapporten hebben aangetoond dat N & B het aantal subeenheden in eiwit clusters kwantificeren door uitgebreide celregio's. Paxillin-EGFP-clusters werden aangetroffen op de adhesieve plekken in de CHO-K1-cellen25, en de intracellulaire aggregatie van het pathogene Httex1p peptide werd beschreven in cos-7-cellen26. N & B werd toegepast voor het volgen van de ligand-gestuurde oligomisatie van de ErbB-receptor27, en het effect van de LIGAND FGF21 op Klothob (klb) en FGFR1c in HeLa-cellen28. De combinatie van tirf-beeldvorming en N & B-analyse werd gebruikt om aan te tonen dat dynamin-2 voornamelijk tetramere is in het gehele celmembraan29. We hebben N & B toegepast op zowel raster scanning als tirf-beelden om ligand-gestuurde door dimerisatie van upar en FGFR1 celmembraan receptoren30,31te bewijzen.
Fluorescentie-correlatie methoden, zoals N & B, FCS en PCH, zijn gebaseerd op de gedachte dat in een open volume het bezettings getal van deeltjes een Poisson-verdeling volgt. Omdat alleen de fotonen die de fluoroforen uitzenden kunnen worden gedetecteerd, de gemiddelde waarde voor een gemeten fluorescentie intensiteit versus tijd in een pixel van het beeld, 
, is het product van het gemiddelde aantal fluor Foren in het verlichtings volume, n, en hun moleculaire helderheid, ε17:
waarbij ε wordt uitgedrukt als het aantal fotonen dat per tijdseenheid (conventioneel per seconde) per molecuul wordt uitgezonden wanneer het molecuul zich in het midden van het verlichtings volume bevindt.
Helderheid is een eigenschap van elke de in een bepaalde overname instellen, terwijl intensiteit de som is van alle bijdragen van alle fluor Foren. Bij biologische wedstrijden zal de helderheid toenemen met de toename van het aantal fluoroforen dat samen fluctueert, wat informatie geeft over de oligomerisatie toestand van het fluorescently-gelabelde eiwit. De fluctuatie amplituden op een bepaalde pixel wordt gemeten aan de variantie van het fluorescentie signaal, σ2:
Wanneer het gemiddelde van het kwadraat van de intensiteit 
, en het kwadraat van het gemiddelde van de intensiteit 
, worden berekend op basis van de individuele intensiteitswaarden in elke pixel van elk frame:
waarbij K het totale aantal frames in de tijdreeks is. Experimenteel is het noodzakelijk om voor de hele Afbeeldingsreeks de variantie te berekenen die de spreiding van de individuele intensiteitswaarden op elke pixel van één afbeelding rond de gemiddelde intensiteitswaarde beschrijft. De variantie omvat alle schommelingen van verschillende oorsprongen. Bij een eerste benadering kan de variantie als gevolg van de diffusisolerende deeltjes in het verlichtings volume σ20worden gescheiden van de variantie als gevolg van de detector schot ruis, σ2d. De twee varianties zijn onafhankelijk; Zo wordt de totale variantie gegeven door hun som:
De variantie, als gevolg van moleculaire schommelingen in en uit het detectie volume, is lineair afhankelijk van de moleculaire helderheid en intensiteit:
EQ. 6 opnieuw rangschikken volgens EQ. 1:
Volgens het typische concept in fluorescentie correlatie spectroscopie, stelt vergelijking 7 dat de variantie als gevolg van het aantal schommelingen afhangt van het kwadraat van de deeltjes helderheid.
Vervolgens is de variantie als gevolg van schommelingen in de detector een lineaire functie van de gedetecteerde intensiteit, onder de aanname dat de detector onder de verzadigings limiet19wordt bediend:
In het geval van foon tellings detectoren a= 1 en c= 0 is de variantie van de detector gelijk aan de gemiddelde intensiteit:
Om deze concepten op echte metingen in levende cellen toe te passen, definiëren Gratton en collega's18 de schijnbare helderheid, B, voor elke pixel als de verhouding van de variantie over de gemiddelde intensiteit:
B is de parameter die experimenteel wordt gemeten. In dit werk, time series beelden van FGFR1 receptoren op het plasma membraan van HeLa cellen worden gevangen door TIRF microscopie en de gemiddelde schijnbare helderheid, B, wordt bepaald door de N & B analyse. Vervolgens, na toevoeging van FGF2, opeenvolgende tijdreeksen worden gevangen om de veranderingen in de zelf-assemblage van de receptor moleculen in het membraanoppervlak na stimulatie van de receptor met de canonieke ligand te volgen.
Aangezien de detector van de TIRF-Microscoop echter een EMCCD-camera is, moet de uitdrukking voor de schijnbare helderheid worden gewijzigd als19:
waarbij Offset de intensiteit offset is van de detectie-elektronica die kenmerkend is voor de detector instellingen. De variantie en gemiddelde intensiteit voor een analoge detector worden respectievelijk gegeven door:
waarbij G de analoge winst in digitale niveaus (DL/fotonen), S, de digitale niveaus per foton19, wordt gegeven door de helling van een intensiteit versus variantie plot voor een lichtbron met constante intensiteit (geen tijdelijke schommelingen). De γ-factor is gerelateerd aan de vorm van het pixel detectie volume. Volgens Hassler et al.32is de γ-factor gelijk aan 0,3 voor tirf-beeldvorming die werkt op de maximale Gain van de detectie camera19. De parameters offset, S en G zijn kenmerken van de camera en de Microscoop. De schijnbare helderheid, B, wordt verkregen door het herschikken van EQ. 11 volgens EQ. 12 en 13:
Experimenteel is ε een complexe functie van laserintensiteit en de detectie-efficiëntie van het systeem. Niettemin, aangezien B/S lineair afhankelijk is van ε, is het alleen belangrijk om de relatieve waarde van ε te bepalen voor een bepaalde detectiemodus:
waar ε ' evenredig is aan ε. Toch wordt een kalibratie uitgevoerd met een interne referentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. monstervoorbereiding
- Dag 1. Zaad HeLa cellen in volledig medium bij een concentratie van 100000-200000 cel/mL in glazen bodem gerechten. Seed 6-8 repliceert gerechten.
Opmerking: In dit voorbeeld wordt het medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 100 U/100 μg penicillaire/streptomycine. Er worden verschillende replicaatgerechten bereid. - Dag 2-3. Wanneer cellen in subconfluency zijn, transfect de helft van de gerechten met het eiwit plasmide en de tweede helft met referentie plasmiden (monomeer en dimeer), in serumvrij medium.
Opmerking: Transfectie wordt gemaakt in serumvrij medium aangevuld met antibiotica, 0,1% runderserum albumine en 25 mM HEPES-buffer, zonder fenolrood. - Dag 3-4. Controleer of de gefixeerde cellen zich aan de onderkant van de gerechten hechten en het celmembraan fluorescerend is. Gooi gerechten met overwoekerde cellen weg of met een zeer lage fluorescentie.
Opmerking: Laat cellen niet overgroeien. De cellen moeten goed verdeeld zijn en worden vastgehouden in het glasoppervlak van de schaal (Figuur 1A). Voorgecoate glazen bodem gerechten kunnen worden gebruikt voor het voorkeur aan celadhesie. De celcultuur wordt vóór een experiment getest op Mycoplasma besmetting. In dit voorbeeld worden cellen met een (A207K) megfp-FGFR1 plasmide getransfeerd en worden de referentiecellen met een GPI-(A207K) megfp en een GPI-(A207K) megfp-(A207K) megfp plasmiden gebruikt met behulp van standaardprotocollen. Voor levende cellen microscopie wordt een indicator vrij medium aanbevolen; 25 mM HEPES-buffer wordt toegevoegd om pH-veranderingen tijdens beeldvorming te voorkomen.
2. TIRF Imaging — uitlijning van de laser lijn en optimalisatie van TIRF-verlichting
- Vier uur voor het experiment, activeer de temperatuur Incubator van de Microscoop bij 37 °C.
- Schakel de Microscoop, computers en camera's in en wacht tot de camera's de juiste werktemperatuur hebben bereikt.
Opmerking: De werktemperatuur van de camera die in deze studie wordt gebruikt, is-75 °C. - Plaats een kleine druppel olie op het doel. Zet een monster schotel op zijn plaats. Sluit de deuren van de incubator en laat de temperatuur van de schotel equilibreren (~ 10 min).
- Zet de epifluorescentie lamp en de 488 nm laser aan.
- Selecteer de epifluorescentie contrast modus om het monster te verkennen en zoek een cel om zich te concentreren vanaf het oculair.
Opmerking: Het gebruik van een fluorescerende lamp voor het doorzoeken van cellen via het oculair is niet verplicht. In plaats daarvan kan een geschikte laser lijn worden gebruikt. - Selecteer het juiste filter voor het verzamelen van de groene emissie via de Microscoop camera (band pass ex 490/20 (500) band doorgeven em 525/50, of iets dergelijks.
- Schakel van het oculair naar de camera poort (camera #1 in Figuur 1) in de epifluorescentie modus, Verfijn de scherpstelling en verander naar de tirf-modus. Epifluorescentie en TIRF-modi kunnen worden genoemd met een andere nomenclatuur, afhankelijk van het merk van de Microscoop.
Opmerking: Er kunnen problemen zijn met het scherpstellen of uitlijnen van de laser als er geen fluorescerende markeringen in de afdek interface zijn. Om de laser op de juiste manier uit te lijnen (essentieel voor goede TIRF), moet u zich concentreren op de coverslip. Het is vaak heel moeilijk om te bepalen of de dekslip scherp is. Als suggestie, focus op de randen van de cellen. - Activeer de automatische uitlijning volgens de instructies van de TIRF-Microscoop.
Opmerking: Kort, voor stappen van 2,4 tot 2,8, Zoek eerst de cellen door het oculair en concentreer op hen, stuur dan de emissie naar de camera poort van de TIRF-Microscoop, richt de cellen opnieuw op het scherm van de Microscoop en activeer de procedure voor laser uitlijning. De uitlijning bestaat uit het vinden van de kritische hoek waarbij de belichting wordt weer licht (Figuur 3). Commerciële microscopen kunnen enigszins verschillende uitlijnings protocollen hebben en ook volledig geautomatiseerd zijn; anderen kunnen een kleine camera hebben om de visualisatie van de kritieke hoek condities te vergemakkelijken. - Kies een geschikte verlichtings diepte en Optimaliseer de richting van het veld met de klachten (Figuur 3).
Opmerking: De penetratie diepte wordt constant gehouden voor alle bedieningselementen en samples.
3. TIRF Imaging: opname van de tijdreeks
- Definieer een regio van belang (ROI) van ten minste 256 x 256 pixels.
Opmerking: In deze set-up wordt de opname gedaan met camera #2 onder software die rechtstreeks alleen de camera bestuurt (Zie Figuur 1 legende). - Stel de belichting in op 1 MS en de EM-versterking tot 1.000 (dit is de G-factor in EQ. 12 en 13). Bij een dergelijke snelheid kan het nodig zijn om het Laser vermogen aan te passen of te verhogen. Hier is laser vermogen 0,5 mW.
Opmerking: Afhankelijk van het type camera en de limieten die worden opgelegd door de diffusiecoëfficiënt van het eiwit, de intensiteit van de fluorescentie en de achtergrond, zijn de algemene criteria voor het instellen van het Laser vermogen niet om de detector te verzaderen, foto bleken te minimaliseren en vast te leggen als snel mogelijk bij een redelijke S/N. De EM-versterking wordt altijd ingesteld op het maximum van de camera (Zie Inleiding). - Voer een eerste proef reeks uit onder initiële omstandigheden en schat ruwweg de S/N-waarde. De voorwaarden zijn aanvaardbaar op S/N = 2-3 of hoger, zoals gemeten in het eerste frame van de eerste tijdreeks.
- Gebruik de schuifregelaar van het emissiesplitsings systeem dat de camera #2 verbindt met de Microscoop voor het maskeren van een zijde van de afbeelding (Figuur 1b, Figuur 4a-b)
Opmerking: In deze set-up is een multi channel Imaging connector geïnstalleerd op camera #2 om de overname van twee ruimtelijk identieke beelden tegelijk mogelijk te maken. Het systeem is uitgerust met glijbanen voor het monteren van verschillende emissie filters. Een van de schuifregelaars koppelt een zwart masker om een zijde van de afbeelding te bedekken. Het gemaskerde gebied wordt gebruikt voor de interne kalibratie van elke tijdreeks, om de camera parameters te bepalen (EQ. 12 en EQ. 13). Op deze manier is er geen behoefte aan een onafhankelijke kalibratie stap en, belangrijk, de kalibratie wordt parallel aan de opname van elke tijdreeks uitgevoerd. Bij afwezigheid van dit systeem kan de camera worden gekalibreerd door gepubliceerde protocollen33toe te passen. - Selecteer de optie voor het automatisch opslaan van het camera bestand.
- Start de overname van de Afbeeldingsreeks. Verkrijg minimaal 700 frames met een minimale S/N-ratio van 2.
Opmerking: Het aantal frames dat nodig is voor de analyse is afhankelijk van de monster stabiliteit voor fotobleaching en de spreiding van de gegevens. Daarom wordt de kwaliteit van elke tijdreeks geëvalueerd tijdens N & B-analyse. - Voeg de ligand toe zonder het gerecht uit de Microscoop te halen.
- Selecteer een cel met een helder fluorescentie membraan en start snel de eerste tijdreeks van de kinetische run.
Opmerking: Als de toevoeging van de ligand snel wordt gedaan, stelt deze eerste opname het punt = 0 tijd van de ligand kinetiek in. De software registreert het exacte tijdstip van de opname. - Zoek een tweede cel en verkrijg het tweede tijdpunt van de kinetiek.
Opmerking: Punt-bezoek routines zijn beschikbaar in sommige microscopen die zijn uitgerust met gemotoriseerde x-, y-en z-fasen. Deze laten het onthouden van meerdere posities op de celschaal toe en kunnen helpen bij het bijhouden van een meer constant tijdsinterval tussen de beeld reeks op verschillende cellen. - Leg een nieuwe cel vast voor elk tijdpunt van de kinetische run.
Opmerking: Na het vastleggen is een cel deels fotogebleekt en kan deze niet opnieuw worden afgebeeld. Hierdoor wordt de kinetiek verkregen door het combineren van tijdreeksen van veel cellen, elk gevangen op een ander tijdstip. - Herhaal voor elk nieuw gerecht het Protocol van stap 2,3 tot en met 3,9.
Opmerking: Voor referentie gerechten, voeg een volume van het voertuig (PBS aangevuld met 0,01% boviene serumalbumine) equivalent aan die gebruikt voor de ligand.
4. nummer & helderheid (N & B): kwaliteitscontrole van de tijdreeks
- Converteren en opslaan als. TIFF de bestanden die zijn verkregen met de camera software (sif-bestanden in dit voorbeeld).
- Importeren. TIFF-bestanden in de analyse software routine door het activeren van de N & B grafische gebruikersinterface (GUI) MATLAB.
Opmerking: Een aangepaste MATLAB uitvoerbare N & B routine wordt hier gebruikt (N & B analyse op https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Door een geïmporteerde te openen. TIFF-bestand, genereert de routine de gemiddelde intensiteits afbeelding, het gemiddelde intensiteits profiel en u de serie frame-voor-frame (aanvullende figuur 1) inspecteren. Andere software zijn beschikbaar voor N & B-analyse (bijvoorbeeld SimFCS-software). - Serie verwijderen waarvoor het gemiddelde intensiteits profiel meer dan 10% foto bleken vertoont, en reeksen waarin een duidelijke celmembraan vervorming of-vertaling is opgetreden tijdens de overname.
- Uitsnijd kaders die duidelijk buiten de focus liggen.
Opmerking: Een bijsnijd hulpmiddel wordt in de routine geïmplementeerd om enkele of meerdere frames binnen de reeks afbeeldingen te kunnen weggooien. Deze bewerking is toegestaan omdat frame-naar-frame tijd niet essentieel is, terwijl de pixel dwelltijd (belichtingstijd) is (zie discussie). - Houd voor de analyse alleen reeksen met ten minste 500 tijdframes.
5. aantal & helderheid (N & B): bepaling van de camera parameters (offset, σ en S)
- Activeer de routine Kalibreer camera.
- Selecteer een oppervlak van ten minste 20 x 50 pixels in de geluids regio van de melder (Figuur 4).
Opmerking: De routine is afkomstig van een histogram van de waarden (ook gedefinieerd digitaal niveau, DL) en retourneert een logaritme plot van de frequentie versus digitale niveaus. - In de log frequentie versus digitale niveau plot, verplaats de lineaire rode cursor om de Gaussiaan en het lineaire deel van de curve te scheiden.
Opmerking: De rode cursor verdeelt de twee delen van de curve en activeert de routine die de verschuiving retourneert, wat het middelpunt is van de Gaussiaanse functie van de camera respons, de σ van de Gaussiaanse pasvorm en de S-factor, die de helling is van het lineaire deel van de camera Response e (Figuur 4C-D).
6. nummer & helderheid (N & B): berekening van de B-waarden in geselecteerd regio-van-belang (ROI)
- Activeer de B -toets.
Opmerking: Deze actie genereert de afbeelding met de gemiddelde intensiteit (Figuur 5, eerste kolom) en de b-afbeelding waarin elke afzonderlijke b-waarde is gekoppeld aan de gerelateerde pixel in de afbeelding (aanvullend figuur 1). - Breng een minimum binning (2 2) aan om de spreiding van de gegevens te verminderen en het B-I histogram te genereren (Figuur 5, tweede kolom).
Opmerking: Het B-I-histogram vertegenwoordigt de verdeling van de B-waarden van alle pixels van de afbeelding versus de pixel intensiteit. Y = B/S; X = (
-offset)/S (aanvullende figuur 1 en EQ. 11 en 15). - Inspecteer het B-I-histogram met behulp van de interactieve vierkante cursor.
- Selecteer een vierkante ROI voor de analyse (afbeelding 5, derde kolom).
Opmerking: De cursor synchroniseert een mobiel masker op de afbeelding met gemiddelde intensiteit, waarbij de pixels worden gemarkeerd die zijn geselecteerd binnen het vierkante cursor gebied (aanvullend figuur 1). Door deze inspectie is het mogelijk om de achtergrond en gebieden met een zeer lage intensiteit van de analyse uit te sluiten. - Genereer de B-map van de geselecteerde ROI (afbeelding 5, vierde kolom).
- Sla het ASCII-bestand op van de B-waarden die aan de selectie zijn gekoppeld.
- Importeer het ASCII-bestand in een grafische software om de frequentieverdeling van de gegevens te berekenen en de gemiddelde B-waarde ± S. E te verkrijgen (Figuur 5, vijfde kolom).
Opmerking: Als de gegevens homogeen zijn, benadert de frequentieverdeling van de B-waarden een Gaussiaanse verdeling. - Pas EQ. 15 toe om de gemiddelde helderheid
= 
-1 [(tellingen/molecuul) per dwelltijd] voor elke cel op elk tijdstip van de kinetische uitvoering af te leiden. Normaliseer de gegevens volgens:
waar
is de gemiddelde b-waarde gemeten op tijd "t" na ligand optellen, en 
is de gemiddelde b-waarde gemeten op het moment t = 0 (10-20 s na ligand optellen).
Opmerking: De normalisering van de resultaten maakt de directe vergelijking van experimenten die worden uitgevoerd in verschillende dagen. Het compenseert de verschillen in de gemeten helderheid als gevolg van laser vermogen en technische schommelingen. - Plot de genormaliseerde gemiddelde helderheid versus acquisitie tijd om de kinetische run te bouwen (Figuur 6).
= 
-1 [(tellingen/molecuul) per dwelltijd] voor elke cel op elk tijdstip van de kinetische uitvoering af te leiden. Normaliseer de gegevens volgens:
is de gemiddelde b-waarde gemeten op tijd "t" na ligand optellen, en 
is de gemiddelde b-waarde gemeten op het moment t = 0 (10-20 s na ligand optellen).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten voor twee representatieve HeLa-mEGFP-FGFR1 cellen die in hetzelfde cultuur gerecht zijn geseelde, worden weergegeven in Figuur 5 en aanvullende tabel 1. De twee cellen werden gevangen op tijd 0 min (Figuur 5a, boven) en 7 min (Figuur 5a, onder) na toevoeging van de FGF2 ligand.
Figuur 5 toont ook de resultaten van twee representatieve HeLa-cellen die ofwel de zuivere monomeer, GPI-megfp (Figuur 5b, boven), of de covalent gekoppelde dimeer fluorophore, GPI-megfp-megfp (Figuur 5b, onder ), blootgesteld aan het celmembraan en gevangen onder dezelfde experimentele omstandigheden.
De gemiddelde schijnbare helderheid, B, in de Hela-megfp-FGFR1 cellen stijgt van 1,070 ± 0,001 EOM naar 1,141 ± 0,001, terwijl de referentie monomeer (Figuur 5b, boven) en dimeer (Figuur 5b, bodem) monsters terugkeren B waarden van respectievelijk 1,070 ± 0,001 E en 1,141 ± 0,001 sec. Dus, ter vergelijking, de FGFR1 receptor is aanwezig voornamelijk in de monomere vorm op het celmembraan oppervlak bij het begin, maar het vordert naar een overheersende dimere toestand op stimulatie met zijn canonieke ligand FGF2. Gemiddeld is de heersende toestand van de FGFR1 moleculen in de twee representatieve cellen duidelijk verschillend.
Door de analyse toe te passen op verschillende cellen in hetzelfde gerecht, die op een ander tijdstip worden gevangen, wordt de gemiddelde helderheid als functie van de tijd verkregen (Figuur 6a). De kinetische run in Figuur 6a beschrijft een traag proces van door dimerisatie dat gedurende enkele minuten op het celoppervlak aanhoudt. De FGF2-geïnduceerde FGFR1 door dimerisatie en daaropvolgende internalisering van de receptor is een bekende mechanisme34; Daarom zijn de resultaten volledig in overeenstemming met het huidige begrip op de FGFR1 signaaltransductie en bevestigen we de potentialiteit van de TIRF-N & B-benadering voor het bestuderen van de oligomerisatie van celmembraan eiwitten tot de bepaling van subtiele monomeer-dimer dynamiek.
De genormaliseerde gemiddelde helderheids analyse van de resultaten is een geschikt hulpmiddel voor het vergelijken van het effect van verschillende liganden op dezelfde receptor. Een voorbeeld is gegeven in Figuur 6B. Het protocol werd herhaald met behulp van dezelfde normen en het stimuleren van de cellen met een niet-canonieke FGFR1 ligand, NCAM-FC (50 μg/mL). In dit geval onthult het kinetische profiel snelle en cyclische overgangen van de receptor in oligomere mengsels, die ook de helderheidswaarden boven die van de dimer bereikt. Een genormaliseerde gemiddelde waarde van 3 wordt herhaaldelijk waargenomen. De beperking van de N & B-analyse (slechts twee momenten van de intensiteit schommeling versus tijd worden overwogen) laat echter niet toe om zonder twijfel de vorming van een trimere vorm aan te tonen. Dezelfde genormaliseerde gemiddelde helderheid kan het resultaat zijn van verschillende combinaties van grotere oligomeren en monomeren van de receptor. Toch tonen de resultaten duidelijk de spatiotemporele verschillen van het effect van de twee liganden op dezelfde receptor.
Figuur 1: overzicht van het experimentele protocol. A) de cellen worden op glazen bodem schotels geplateerd en met de fluorescently gelabelde receptor verteerd. B) beelden van de tijdreeksen worden vastgelegd op een commerciële tirf-Microscoop die is uitgerust met een tirf 100x 1,46-olie doelstelling en incubator kamer. In deze commerciële opstelling, de software staat niet toe dat de ingebouwde EMCCD camera #1 om te werken op zeer korte belichtingstijden die nodig zijn voor het verwerven van N & B tijd serie. Dit is een belangrijk punt omdat de blootstellingstijd het bereik van moleculaire diffusies die kunnen worden opgevangen beperkt. Hoe korter de blootstellingstijd, hoe sneller de Moleculaire diffusie die kan worden geanalyseerd. Blootstellingen variërend van 0,5 tot 1 MS zijn voldoende snel voor membraan eiwit diffusie. Daarom wordt een tweede EMCCD-camera (#2) toegevoegd aan een extra poort van de Microscoop om direct onder de camera software te werken, waarbij de Microscoop-software wordt overgeslagen. In deze aangepaste configuratie worden de Microscoop-software en camera #1 alleen gebruikt voor TIRF-uitlijning. TIRF-tijdreeksen worden vervolgens verkregen met behulp van camera #2 die op zeer korte belichtingstijden zoals 1 MS en bij de maximale EM-versterking wordt uitgevoerd. Camera #2 heeft ook een pixelgrootte van 124 nm die oversampling en binning van de beelden mogelijk maakt (zie protocol sectie 6,2). Andere configuraties om Imaging snelheid te verkrijgen zijn mogelijk, afhankelijk van de kenmerken van verschillende TIRF microscopen, terwijl het gebruik van sCMOS-camera's niet aan te raden is, omdat ruis niet willekeurig is in de afbeelding35. (C) na het vastleggen worden tijdreeksen geïnspecteerd als kwaliteitscontrole. Serie worden weggegooid als fotobleaching hoger is dan 10%, omdat deze kan worden bepaald door de gemiddelde frame-intensiteit versus het framenummer te plotten. Serie worden ook weggegooid als er een duidelijke vervorming van het celmembraan of de vertaling van de cel tijdens de overname is geweest. (D) de gemiddelde intensiteit in elke pixel wordt opgeslagen. E) een b-I-histogram dat de schijnbare helderheid weergeeft, b, in elke pixel van de afbeelding wordt gegenereerd. (F) het B-I-histogram wordt gebruikt voor het selecteren van een ROI dat zich boven de achtergrond bevindt. G) de frequentieverdeling van de b-waarden wordt geanalyseerd om de gemiddelde b-waarde ± a Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: N &Amp; B-principe. N & B kwantificeert de gemiddelde oligomerisatie toestand van fluor Foren door het meten van de fluorescentie schommelingen die optreden wanneer ze het verlichtings volume in-en uitschuiven tijdens de overname van een tijdstack reeks van "K" beelden. De amplitude van de schommelingen wordt statistisch gekenmerkt door het berekenen van de verhouding tussen variantie van het fluctuerende signaal, σ2en gemiddelde intensiteitswaarde . In het eenvoudigste scenario (a), wanneer het verlichtings volume leeg is (d.w.z. geen fluoroforen), beschrijft de verhouding instrument ruis. Als het fluorescentie signaal fluctueert als gevolg van mobiele fluor Foren (B, C), is de "extra"-variantie direct evenredig aan de moleculaire helderheid, ε (gedetecteerde fotottellingen per molecuul en per seconde), van de diffoculaire moleculen. In (B), er zijn 8 monomeer verspreiden fluoroforen en in (C), dezelfde fluoroforen diffuus als 2 tetramere oligomeren. In deze twee gevallen is de gemiddelde intensiteit hetzelfde, maar de standaarddeviatie en helderheid zijn verschillend (1ε, 4ε), omdat de amplitudes van de schommelingen verschillend zijn. ε = 0 wanneer fluoroforen onmobiel zijn of afwezig zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: TIRF microscopie. Hoewel N & B net zo goed werkt met raster Scanning microscopen die zijn uitgerust met multiphoton, continuous wave of gepulseerde enkelvoudige foton lasers en analoge of foton tellings detectoren, is tirf microscopie ideaal voor snelle tijdelijke beeldvorming van moleculaire dynamische gebeurtenissen die plaatsvinden op of nabij het celoppervlak met snelheden, resolutie en signaal/ruis verhouding (S/N) die niet mogelijk zijn door andere beeldvormingstechnieken. A) tirf-microscopie maakt gebruik van het principe van totale inwendige reflectie waarbij een haaks excitatie laserlicht alleen fluoroforen, die zich net onder een glas-water-interface van de afdekplaat bevinden, prikkelt. De laser irriteert het preparaat met een invalshoek die groter is dan of gelijk is aan de kritische hoek van de refractie, terwijl het excitatie laserlicht volledig wordt gereflecteerd. De reflectie genereert een zeer dun elektromagnetisch veld in het preparaat dat de evanescerende Golf wordt genoemd. Het resulterende fluorescerende licht dat door het kleine verlichte deel van het preparaat wordt uitgezonden, wordt verzameld door middel van een microscopisch doelstelling die loodlijnen onder de glijbaan wordt geplaatst. B) het panel toont een representatief voorbeeld op een gegeven golflengte van de relatieve intensiteit van een veld in vergelijking met diepte, dat exponentieel afneemt met toenemende afstand van het oppervlak, waardoor een hoge axiale resolutie fluorescentie Afbeeldingen. De laterale resolutie wordt bepaald door het numerieke diafragma en de vergroting van het objectief en door de pixelgrootte van de detectie camera. Het celinterieur is niet verlicht en draagt niet bij aan het signaal met intracellulaire autofluorescentie. Multi-Angle TIRF microscopen maken het selecteren van verschillende penetratie diepten mogelijk. Ze bieden een weegschaal die afhangt van de excitatie golflengte en gaat meestal van 70 nm tot 250 nm diepte voor een TIRF-beeld met één kleur. De voor dit protocol gekozen evanescerende verlichtings diepte is 110 nm en is het resultaat van een compromis tussen de noodzaak van het gebruik van een laag Laser vermogen en de intensiteit van het fluorescentie signaal dat sterk afneemt met de afname van de penetratie diepte. Het is belangrijk om te voorkomen dat overdreven grote evanescerende velden die veel intracellulaire blaasjes en intracellulaire populatie van fluor Foren kunnen verlichten. Daarom, afhankelijk van het type monster, verschillende penetratie diepten moeten worden verkend, op zoek naar de beste combinatie: hoge signaal-ruis verhouding, lage excitatie vermogen, korte belichtingstijd, korte penetratie diepte. Zodra deze optimalisatie is voltooid, wordt de penetratie diepte constant gehouden voor alle besturingselementen en samples. C) representatieve epifluorescentie-en tirf-beelden van een HELA-GPI-megfp-cel na door de software geleide optimalisering van de diepte en de richting van het evanescentie veld. Multi Angle TIRF microscopen laten ook toe om de richting van het evanescerende veld te optimaliseren. Deze stap wordt aanbevolen voor het minimaliseren van verstrooiing (d.w.z. scherpe toename van de intensiteit en minder scherp beeld), en het kan worden uitgevoerd volgens de instructies van de specifieke Microscoop gebruikt. In dit protocol bevat de Microscoop software een automatische optimalisering van de richting van het veld van de evanescentie. Voorhand matige optimalisatie raadpleegt u de gepubliceerde protocollen36,37. D) representatieve cel die de megfp-FGFR1 constructie in epifluorescentie en na optimalisering van de tirf-verlichting uitdrukt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: opname van de tijdreeksen en kalibratie van de camera respons op enkele fotonen. (A) voorbeeld van het eerste frame uit 700-frame tijdreeksen die zijn vastgelegd op een Hela-MEGFP-FGFR1-cel in de bijgesneden sensor modus. De camerachip is gedeeltelijk gemaskeerd (rode rechthoeken) met behulp van de Dualview connector geïnstalleerd op de TIRF Microscoop (Figuur 1B). De interne kalibratie gebieden worden herkend in de afbeelding met de gemiddelde intensiteit (B) en verwerkt (C) voor het inschatten van de camera parameters door de log-frequentie versus digitale niveaus (D) te plotten. Een analoog detectiesysteem, zoals een emccd-camera, detecteert pulsen van foto stroom in plaats van fotonaantallen, en de distributie van foton-pulshoogte is quasi-exponentieel. Het eerste deel van de verdeling is te wijten aan de versterker en analoog-naar-digitaal converter en het draagt een Gaussiaanse uitlezen ruis (de variantie geïntroduceerd door de signaal opname). Het meest bevolkte kanaal (d.w.z. de meest voorkomende waarde) van de verdeling is de Offset (EQ. 13). Met behulp van een verticale cursor in een log plot, wordt het eerste deel van de verdeling gescheiden van het exponentiële tweede deel, boven 250 DL, dat de gemiddelde camera respons op een enkele foton vertegenwoordigt (de helling is de S-factor in EQ. 12). De meting van deze parameters maakt het inschatten van de dichtheid van fotonen die tijdens de overname worden geregistreerd. Aantal (DL) zijn in pseudo-kleurenschaal. Pixel grootte = 124 nm; Beeldformaat = 256x256 pixels, penetratie diepte van het evanescerende veld ~ 110 nm; Kalibratie ROI #1 = 19x256 pixels; Kalibratie ROI #2 = 5x256 pixels. DL = digitale niveaus. Blootstelling = 1 MS en EMGain (de G-factor in EQ. 12, 13 en 14) = 1000. Merk op dat camera's die in foton tellings modus met achtergrond werken gelijkwaardig zijn aan analoge detectoren met S = 1 (EQ. 12) en met σ2d en offset (EQ. 13), gemeten op dezelfde manier als voor een analoog systeem18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: N &Amp; B-analyse van FGFR1 oligomerisatie. A) representatieve resultaten van twee HeLa-cellen in hetzelfde gerecht die megfp-FGFR1 uitdrukken en op tijd 0 min (boven) en 7 min (onder) zijn gevangen na toevoeging van 20 ng/ml FGF2, en (B) twee HeLa-cellen die de referentie constructies uitdrukken GPI-megfp (top) en GPI-mEGFP-mEGFP (onder). De volledige analyse reeks toont (van links naar rechts): gemiddelde intensiteit van de tijdreeks; Plot van alle B-waarden als functie van de intensiteit van de fluorescentie waarbij de kleurcode het aantal pixels voorstelt dat dezelfde B-waarde in de afbeelding heeft en de rechthoekige cursors de regio van belang (ROI), de achtergrond (BG) en de gebieden van zeer lage intensiteit (LI). Merk op dat immobiele fluor Foren B-waarde = 1 geeft, aangezien bij afwezigheid van schommelingen ε = 0; B-kaart van de gekozen ROI en het bijbehorende B-distributie histogram. De B-waarde verdeling is uitgerust met een Gaussiaanse functie (onderbroken rode lijn) om de gemiddelde schijnbare helderheid te berekenen, B (volledige rode lijn) en de verdelingsstatistieken (aanvullende tabel 1) b-waarde = b ' = b/S (EQ. 15); Intensiteit = ( - Offset)/s; M = monomeer; D = dimer; schaal staven = 10 micron. Tijdreeksen voor onbewerkte gegevens in aanvullende film 1, aanvullende film 2, aanvullende film 3en aanvullende film 4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: kinetiek van FGFR1 oligomerisatie geïnduceerd door ligand activering. Representatieve kinetische runs beschreven door de genormaliseerde gemiddelde helderheid (EQ. 16) van HeLa-mEGFP-FGFR1 cellen na stimulatie met 20 ng/mL FGF2 (a) of 50 μg/ml NCAM-FC (B). Cellen in hetzelfde gerecht werden op toenemende tijdstippen gevangen en de schijnbare gemiddelde helderheid, B ± a, werd berekend uit de B-distributie histogrammen. Het cijfer wordt aangepast met toestemming van Zamai et al. Journal of Cell Science (2019)31. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: snelle kinetiek en gegevens interpretatie. Scatter plot van de alle genormaliseerde gemiddelde helderheidswaarden verkregen uit replicaatkinetische runs waarin HeLa-mEGFP-FGFR1 cellen werden gestimuleerd ofwel met NCAM-FC (50 μg/mL) of FGF2 (20 ng/mL). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: scherm momentopname van de analyse routine in MatLab. Scherm momentopname van de N & B grafische gebruikersinterface (GUI) MATLAB-routine met de initiële analysestappen: Upload time series; berekening gemiddelde intensiteit afbeelding, compute-intensiteit profiel, compute B-map en B-I histogram. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Parameter | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (tijd = 0 ') | mEGFP-FGFR1 (tijd = 10 ') |
| Gaussiaanse gemiddelde B-waarde | 1,070 | 1,141 | 1,070 | 1,141 |
| De gemiddelde B-waarde | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
| S.D. van de B-vaue distributie | 0,059 | 0,067 | 0,077 | 0,075 |
| 95% betrouwbaarheidsinterval van de gemiddelde B-waarde | 1,069 tot en met 1,071 | 1,139 tot en met 1,143 | 1,069 tot en met 1,072 | 1,139 tot en met 1,143 |
| S.D. van het 95% betrouwbaarheidsinterval van de B-waarde | 0,058 tot en met 0,060 | 0,065 tot en met 0,069 | 0,075 tot en met 0,079 | 0,073 tot en met 0,078 |
| Fitting beperken | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 | S.D. > 0 |
| Standaardfout van Standard; Standaarddeviatie van S.D. | ||||
Aanvullende tabel 1: schijnbare lichtsterkte analyse. Statistieken en Gaussiaanse fitting parameters van de B-verdelingen in Figuur 5 werden uitgevoerd. De minste vierkante Gaussiaanse fits werden verkregen onder de beperking van de standaarddeviatie > 0 met de X-Range automatisch gekozen en maximale iteraties = 1000. R vierkant: mEGFP-FGFR1 monomeer = 0,9957, mEGFP-FGFR1 dimeer 0,9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0,9970.
Aanvullende film 1: Tijdreeksen van een HeLa-mEGFP-FGFR1-cel op tijd = 0 minuten na FGF2 stimulatie (20 ng/mL in PBS aangevuld met 0,01% BSA), weergegeven in Figuur 5. De serie van 800 frames zijn ongecomprimeerd op 7 fps gereproduceerd. Beeldformaat = 256 x 256 pixels; pixelgrootte = 124 nm; Het interne kalibratiegebied wordt aangeduid als donkere laterale banden. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende film 2: Tijdreeksen weergegeven in afbeelding 5 van een cel Hela-MEGFP-FGFR1 op tijd = 7 minuten na FGF2 stimulatie (20 ng/ml in PBS aangevuld met 0,01% BSA) de reeks van 800 frames worden gereproduceerd ongecomprimeerd op 7 fps. Beeldformaat = 256 x 256 pixels; pixelgrootte = 124 nm; Het interne kalibratiegebied wordt aangeduid als donkere laterale banden. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende film 3: Tijdreeksen weergegeven in Figuur 5 van een HELA-GPI-megfp-cel na toevoeging van het voertuig (PBS aangevuld met 0,01% BSA). De serie van 1.000 frames zijn ongecomprimeerd op 7 fps gereproduceerd. Beeldformaat = 256 x 256 pixels; pixelgrootte = 124 nm; Het interne kalibratiegebied wordt aangeduid als donkere laterale banden. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende film 4: Tijdreeksen weergegeven in Figuur 5 van een HELA-GPI-mEGFP-megfp-cel na toevoeging van het voertuig (PBS aangevuld met 0,01% BSA). De serie van 1.000 frames zijn ongecomprimeerd op 7 fps gereproduceerd. Beeldformaat = 256 x 256 pixels; pixelgrootte = 124 nm; Het interne kalibratiegebied wordt aangeduid als donkere laterale banden. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B vereist verschillende voorzorgsmaatregelen bij de keuze van het celmodel en de etiketterings strategie. Het kan alleen worden toegepast op levende cellen die stabiel blijven gehecht tijdens de opnametijd van de foto. Extra schommelingen als gevolg van de gehele cel rigide verplaatsing kunnen worden behandeld met de juiste beeld restauratie benaderingen38. Echter, in het algemeen wanneer een cel beweegt, de celmembraan ook vervormt, en structuur vervorming, produceren van grote extra variantie, introduceert ernstige beperking aan de analyse van membraan eiwitten. In dit werk wordt de fluorescerende constructie uitgedrukt in de HeLa-cellijn, omdat de constitutieve FGFR1 verwaarloosbaar is. De aanwezigheid van het constitutieve eiwit is een aandoening om te voorkomen, anders zouden gemengde populaties van fluorescerende en niet-fluorescerende receptor oligomeren waarschijnlijk vormen. Bijgevolg zou de N & B-analyse, die alleen is gebaseerd op de helderheid van de fluorescently-gelabelde eiwit populatie, een onbetrouwbare schatting van de gemiddelde oligomere toestand teruggeven. Dit aspect is met name belangrijk bij het toepassen van N & B voor het opsporen van receptor door dimerisatie gebeurtenissen waarbij de helderheid alleen toeneemt met een factor 2, zoals de FGFR1 door dimerisatie in aanwezigheid van de FGF2 ligand. In een dergelijk geval kan de aanwezigheid van gemengde Dimeren de door dimerisatie-gebeurtenissen die detecteerbaar zijn door N & B volledig verbergen. De verontreiniging van fluorescerende oligomeren met niet-fluorescerende constitutieve vormen is een van de mogelijke valkuilen van elke benadering op basis van de detectie van fluorescentie, tenzij het gelabelde eiwit grotendeels wordt overexpressie. Echter, oligomerisatie studies in de voorwaarden van eiwit overexpressie verhogen bezorgdheid over hun functionele betekenis. Transitief getransfunde cellen zullen waarschijnlijk een variabel niveau van fluorescentie (d.w.z. eiwitconcentratie) hebben en zijn nuttig voor het testen van de onafhankelijkheid van de gemiddelde helderheid van de eiwitconcentratie, aangezien N & B kan worden toegepast op een breed scala van concentraties, onder de voorwaarde van lineaire respons van de detector (Zie de definitie van de helderheid, EQ. 1).
Een andere beperking is de stoichiometrische etikettering van de receptor met behulp van een stabiele de in levende cellen. Halo-Tags, fluorescerende eiwitten (FP) of andere covalente fluorescerende labels zijn geschikte etiketten om een exact aantal gebonden fluor Foren per molecuul eiwit in cel te verkrijgen. Om de complexiteit van de N & B-analyse te verminderen, gebruiken we fluorescerende eiwitten of Halo-Tags die een 1-op-1 fluorophore-to-Protein-etikettering opleveren. Het FP van keuze moet monomeer in de volwassen vorm, met een verwaarloosbare zelf associatie neiging die, anders, zou kunnen induceren kunstmatige oligomerisatie van de FP-gelabelde receptoren. In dit protocol, gebruiken we de (A207K) megfp omdat deze single point mutatie de megfp zelfaggregerende tendens afschaft zoals eerder weergegeven31,39,40. Ongeacht de etiketterings strategie moet het fluorescently gelabelde eiwit worden gecontroleerd op het behoud van de biologische activiteit in het gekozen celmodel, omdat de functionaliteit van de gelabelde moleculen essentieel is voor het koppelen van oligomerisatie-gebeurtenissen aan receptor signalering. In ons model bewees we de autofosforylatie van de fluorescerende (A207K) megfp-FGFR1 na het stimuleren van de getranssinfecteerde cellen met de receptor ligand FGF231.
N & B is gebaseerd op de diffusie van moleculen in het verlichtings volume. Bij Detectie van digitale camera's moet de belichtingstijd (d.w.z. de pixel dwelltijd in analoge detectie, t-Dwell) kort genoeg zijn dat één en slechts één configuratie van deeltjes in het brandpuntsvolume wordt vastgelegd. Dit wil zeggen dat de waarschijnlijkheid dat een de het verlichte volume tijdens de blootstellingsduur binnenkomt of verlaat, erg klein is. De blootstellingstijd moet korter zijn dan de tijd voor de-verblijf (τD), de gemiddelde tijd dat een de in het verlichte volume doorbrengt. Daarom, voordat u begint met een N & B-experiment, is het noodzakelijk om een idee te hebben over de verblijfstijd (of de diffusiecoëfficiënt) van het doeleiwit, dat in een eerste benadering afhankelijk is van subcellulaire lokalisatie en moleculaire massa. De frame snelheid is de inverse van de tijd die de camera nodig heeft om een afbeelding te verkrijgen en deze afbeelding vervolgens volledig te lezen, en wordt vaak berekend op basis van het totale aantal pixels en de uitleessnelheid, gecombineerd met de belichtingstijd. Hoewel de framesnelheid niet snel hoeft te zijn, is de cyclustijd (t-cyclus), de som van de framesnelheid en de tijd om de opname van het volgende frame voor te bereiden, mogelijk van invloed op de analyse. Deze beperkingen kunnen worden veralgemeend als: tcyclus > > τD > > tDwell. Als de cyclustijd te snel is, zullen de moleculen niet merkbaar van het ene frame naar het volgende in die tijd zijn verhuisd en zullen deze als immobiel worden weergegeven (B = 1). Omdat er echter honderden frames nodig zijn voor de analyse, wordt fietsen zo snel mogelijk ingesteld (het beeldformaat in aantal pixels vergroten of verkleinen) om celverplaatsingen en vervorming van het celmembraan te voorkomen dat grote extra variantie zou toevoegen tijdens de serie overname. In het voorbeeld van dit protocol is de langzaamste cyclustijd 22 MS, zodat 500 frames kunnen worden verkregen in 11 s.
Moleculaire helderheid is geen absolute hoeveelheid; Het hangt af van de moleculaire eigenschappen van de de (dwarsdoorsnede en kwantum opbrengst), op de experimentele opstelling (detector en optica), alsmede op de excitatie condities zoals de laser kracht. De TIRF-N & B-benadering levert dus een schijnbare helderheid op en daarom is het van fundamenteel belang om een "referentiercel model" op te zetten dat een referentie constructie met een univocale oligomere staat uitdrukt. De referentie constructie draagt dezelfde de tag van het eiwit onder studie [hier, de (A207K) megfp] en het lokaliseert in hetzelfde subcellulaire compartiment (hier, het plasma membraan). In dit werk gebruiken we een glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankerde-(A207K) megfp-constructie die we herhaaldelijk hebben aangetoond als een betrouwbare monomere-helderheids standaard voor celoppervlak receptoren met dezelfde de30, 31.
Een groot nadeel is het ontstaan van de fotobleaching die zeer waarschijnlijk gebeurt wanneer dezelfde cel herhaaldelijk wordt blootgesteld aan licht tijdens een kinetische run, en leidt tot een onderschatting van de oligomerisatie toestand. Om dat te voorkomen, wordt de lichtsterkte kinetiek verkregen door de gemiddelde helderheid van de verschillende cellen die op een ander tijdstip zijn vastgelegd te combineren (Figuur 6). Dit wil zeggen dat elke cel in een petrischaaltje een ander tijdpunt van de kinetiek is en een petrischaaltje een hele kinetische loop vertegenwoordigt.
Wanneer de oligomerisatie dynamiek snel en complex is, zoals de FGFR1 oligomerisatie geïnduceerd door een niet-canonieke ligand, NCAM31, kan het profiel van de genormaliseerde gemiddelde helderheid versus tijd variabel en instabiel zijn (Figuur 6B ). In een dergelijk geval kan de reproduceerbaarheid niet worden bepaald door het lezen van de cellen op precieze tijdstippen, vanwege de noodzaak om elke keer te bewegen en te focussen op een nieuwe cel, selecteer een ROI, Capture and Inspect/gooi time series. Zo kan de reproduceerbaarheid worden geëvalueerd in termen van kinetische profiel gelijkenis en amplitude van de helderheids veranderingen.
Een overzicht van de resultaten wordt weergegeven in Figuur 7. De Scatter plot illustreert alleen de gemiddelde helderheid gemeten in cellen van hetzelfde gerecht, verwaarlozen van de tijd van elke opname. In dit plot blijft het belangrijkste verschil dat wordt veroorzaakt door de twee liganden op de oligomerisatie toestand van de receptor duidelijk, hoewel alle kinetische informatie wordt verwijderd. Voor beide experimenten (FGF2-versus NCAM-geïnduceerde oligomerisatie) zou de conventionele benadering van het bepalen van de gemiddelde ± S.D. van elke run in Figuur 7 echter leiden tot misleidende conclusies, aangezien de FGFR1 moleculen die door FGF2 duidelijk worden gestimuleerd doorvoer in twee goed gedefinieerde toestanden, terwijl NCAM instabiele en cyclische oligomere FGFR1 mengsels induceert die niet goed vertegenwoordigd zouden zijn door een gemiddelde ± S.D. waarde.
Samenvattend, vanuit experimenteel oogpunt, vereist N & B alleen toegang tot een microscoop die is uitgerust met een snelle acquisitie module en een speciale software. Het eiwit van belang kan worden getagd met een verscheidenheid aan monomere fluorescerende eiwitten of organische fluor Foren, maar kwantitatieve metingen vereisen verschillende voorwaarden waaraan moet worden voldaan: stoichiometrische etikettering, referentie lichtsterkte standaard, detector kalibratie en geen fotobleaching. In deze context is de N & B-aanpak een krachtig hulpmiddel om de spatiotemporale oligomerisering van eiwitten in levende cellen te ontcijferen. Bovendien zijn de recente vooruitgang bij het resamplen van ruwe gegevens om de statistische weging41 op te lossen en fluorescentie-kruiscorrelatie spectroscopie te combineren met kruiscorrelatie N & B42 raffinage en verbetering van de toepasbaarheid van de N & B-benadering van eiwit oligomerisatie en interactiestudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De CNIC wordt ondersteund door het ministerie van Ciencia, innovacion y Universidades en de Pro CNIC Foundation, en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). We worden ook gesteund door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (FEDER) "una manera de hacer Europa". UC erkent de steun van de Associazione Italiana ricerca Sul cancro, de vereniging voor internationaal kankeronderzoek (nu bekend als wereldwijd kankeronderzoek) en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid. A.T. erkent de "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" voor het gedeeltelijk ondersteunen van zijn werk met de PV Fellowship "Progetto professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G.
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E.
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D.
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
