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Biology

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Published: November 06, 2019
doi:
10.3791/60398
, , , ,
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging,Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale,Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research,European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다.

Abstract

수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 클러스터링 이벤트를 검출하고 군집의 정도를 측정하는 몇 가지 방법이 적용 가능하다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포의 막에 있는 mEGFP 꼬리표 수용체 동종 복합체의 평균 올리고메릭 상태를 결정하기 위하여 화상 진찰 접근을 기술합니다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다. N&B는 형광 상관분광법(FCS) 및 광자 계수 히스토그램(PCH)과 유사한 방법으로, 형광의 형광 강도의 변동에 대한 통계적 분석을 기반으로 조명 안팎으로 확산되는 형광 의 강도에 대한 통계적 분석을 기반으로 합니다. 관찰 시간 동안 볼륨을 볼 수 있습니다. 특히, N&B는 올리고머 혼합물에서 평균 단백질 수에 대한 정보를 얻기 위해 PCH를 단순화한다. 강도 변동 진폭은 불소의 분자 밝기와 조명 부피 내의 평균 형광부 수에 의해 설명됩니다. 따라서 N&B는 진폭 분포의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도와 분산만 고려합니다. 이것은, 동시에, 방법의 강도와 약점이다. 두 순간만 고려되기 때문에 N&B는 혼합물에서 알 수 없는 올리고머의 어금니 분율을 확인할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태만 추정합니다. 그럼에도 불구하고, 단순히 형광 강도의 시간 변동을 모니터링함으로써, 픽셀 단위로 라이브 셀의 이미지의 상대적으로 작은 시간계 (다른 모멘트 방법에 비해)에 적용 될 수있다. 픽셀당 유효 시간을 몇 마이크로초로 줄여 초 단위로 수집할 수 있으므로 빠른 올리고머화 역학에 필요합니다. 마지막으로, 넓은 세포 지역 뿐만 아니라 하위 세포 구획을 탐구할 수 있습니다.

Introduction

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 수용체 분자의 평균 올리고메상태를 결정하기 위한 총 내부 반사 형광 수 및 밝기(TIRF-N&B) 이미징 접근법을 설명하며, 수용체 어셈블리를 연결하는 것을 목표로 합니다. 단백질의 생물학적 기능에 역학(그림 1).

세포외 리간드 결합시, 수용체는 그들의 형태, 올리고머화, 잠재적인 공동 수용체 및 막 조성에 따라 세포내 신호 변환을 개시한다. 수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 세포 신호의 주요 사건으로 인식1,2,3,4,5,6, 7,몇 가지 방법은 클러스터링 이벤트를 감지하고 실험적으로 클러스터링의 정도를 측정 할 수 있습니다8,9. 공초점 부피(x,y, y , 300 nm, z □900 nm)는 이미지 복원알고리즘(10)에의해 최적화된 후에도 분자 상호작용 및 점양내측정을 입증하기 위해 충분히 해결된다. 단백질 올리고머의 하위 단위 조성은 손바닥11,STORM12및 STED13과같은 20-70 nm의 초고해상도 방법에서도 순수한 공간적 기준으로 해결할 수 없다. 또한 시간해상도(이미지당 분 순)는 초 범위에서 역학을 따를 수 없습니다. 단 하나 분자 단계 표백은 단백질 올리고머의 stoichiometry를 움직이지 않는 경우에만 해결합니다 14.

단일 이미지 내에서 형광 태그가 지정된 단백질의 밀도와 올리고머화를 측정하는 가장 다양한 방법 중 하나는 공간 샘플링에 의존하는 공간 강도 분포 분석(SpIDA)입니다. 화학적으로 고정된 세포와 살아있는 세포 모두에 적용가능하며, 표준 형광 현미경검사법 15를사용하여 세포의 관심 있는 여러 영역의 분석을 동시에 허용한다. 또는 형광 상관 분광법(FCS)16,광자 계수 히스토그램(PCH)17및 수 및 밝기(N&B)18,19,양적 올리고머에 적합한 모멘트 방법 측정. 이러한 방법은 형광이 조명 부피안팎으로 확산될 때 관찰할 수 있는 형광 강도 변동을 분석합니다. 강도 변동의 진폭은 조명부피 17(도 2)내에서 형광포(θ)의 분자 밝기 및 평균 형광포(n)에 의해 고유하게 설명될 수 있다. 전형적으로, 불소의 확산 계수 및 조명 부피 내의 평균 분자 수(G(0) 값과 반비례)는 FCS20에의해 수득될 수 있다. 그러나, 확산 시간은 질량의 입방 루트로만 스케일링되기 때문에, FCS는 분자질량(21)의변화를 검출하기에 충분히 민감하지 않다. 실제로, 단색 FCS는 막 수용체의 이각을 검출할 수 없습니다. PCH는 다른 올리고머의 혼합물을 정확하게 해결합니다. 진폭 분포의 두 개 이상의 순간을 사용하여 동일한 조명 볼륨을 차지하는 서로 다른 밝기의 분자를 감지합니다. 스캐닝 FCS22 및 분자 밝기(pCOMB) 접근법(23)의 흥미로운 쌍 상관관계접근법(23)과같은 개발, 생물학적 시스템에서 형광 상관 방법의 적용 범위를 확장하기 위해도입된 24 , 셀의 넓은 영역에서 빠른 측정 기능이 부족한 단일 지점 방법을 유지하므로 각 픽셀에서 많은 연속 관찰이 필요하고 몇 초 안에 데이터 수집이 필요합니다.

N&B는 형광 분포의 진폭의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도, , 및 분산,σ2 (그림 2)18,19를 고려하는 PCH의 단순화된 버전입니다. 그리고, 그 때문에, 혼합물에서 알 수없는 올리고머의 어금니 분율을 결정할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태를 추정할 뿐입니다. 그럼에도 불구하고 N&B는 형광 강도의 시간 변동을 모니터링하기만 하면 PCH보다 상대적으로 작은 라이브 셀 이미지로 작업할 수 있는 장점이 있습니다. N&B는 픽셀당 시간을 몇 마이크로초로 줄여주므로 넓은 세포 영역에 걸쳐 빠른 올리고머화 역학을 따를 수 있으므로 래스터 스캐닝 현미경 검사법(예: 공초점, 2광자) 및 밀리초에서 시간 배율로 이미지를 수집할 수 있습니다. 카메라 기반 현미경 검사법(예: TIRFM)에서

몇몇 보고는 확장한 세포 지구를 화상 진찰에 의하여 단백질 클러스터에 있는 소단위의 수를 정량화하는 N&B의 기능을 설명했습니다. Paxillin-EGFP 클러스터는 CHO-K1세포(25)의접착 부위에서 검출되었고, 병원성 Httex1p 펩티드의 세포내 응집은 COS-7 세포26에서기재되었다. N&B는 ErbB수용체(27)의리간드 구동 올리고머화, 및헬라세포(28)에서KLB(KLB) 및 FGFR1c상에서의 리간드 FGF21의 효과를 따르기 위해 적용되었다. TIRF 이미징과 N&B 분석의 조합은 다이너민-2가 전체세포막(29)에걸쳐 주로 테트라메어임을 보여주기 위해 사용되었다. 우리는 uPAR 및 FGFR1 세포막 수용체30,31의리간드 구동 이각을 증명하기 위해 래스터 스캐닝 및 TIRF 이미지 모두에 N&B를 적용했습니다.

N&B, FCS 및 PCH와 같은 형광 상관 방법은 개방 부피에서 파티클의 점령 수가 푸아송 분포를 따른다는 개념을 기반으로 합니다. 형광단이 방출하는 광자만 검출할 수 있기 때문에, 측정된 형광 강도에 대한 평균 값은 이미지의 픽셀에서 시간 대, 조명 부피, n 및 이들의 평균 형광피의 수의 산물이다. 분자 밝기, θ17:

여기서 θ는 분자가 조명 부피의 중심에 있을 때 분자당 시간 단위(종래로 초당 초당)로 방출되는 광자의 수로 표현된다.

밝기는 주어진 획득 설정에서 각 형광포의 속성이며 강도는 모든 형광단의 모든 기여도의 합계입니다. 생물학적 경연 대회에서, 밝기는 함께 변동하는 형광단의 수의 증가와 함께 증가하여 형광 태그가 지정된 단백질의 올리고머화 상태에 대한 정보를 제공합니다. 주어진 픽셀에서의 변동 진폭은 형광 신호의 분산으로부터 측정되며,σ2:

여기서 강도의 제곱 및 강도 평균의 제곱은 각 프레임의 각 픽셀의 개별 강도 값에서 계산됩니다.

여기서 K는 타임계의 총 프레임 수입니다. 실험적으로, 전체 이미지 계열에 대해 평균 강도 값을 중심으로 단일 이미지의 각 픽셀에서 개별 강도 값의 분산을 설명하는 분산을 계산할 필요가 있다. 분산에는 서로 다른 기원의 모든 변동이 포함됩니다. 제1 근사치에서, 배루 볼륨에서 확산 입자로 인한 분산,σ20,검출기 샷 노이즈,σ2d에의한 분산으로부터 분리될 수 있다. 두 분산은 독립적입니다. 따라서 총 분산은 합계로 지정됩니다.

검출 량안팎의 분자 변동으로 인한 차이는 분자 밝기 및 강도에 선형적으로 의존합니다.

eq. 1에 따라 eq. 6 재배치:

형광 상관 분광법의 일반적인 개념에 따르면, 방정식 7은 변동수에 의한 차이가 입자 밝기의 제곱에 따라 달라지도록 합니다.

그런 다음 검출기 변동에 의한 분산은 검출된 강도의 선형 함수이며, 검출기가 포화 한계19이하로 작동한다는 가정 하에 :

광자 계수 검출기의 경우 =1및 c=0이므로 검출기 분산은 평균 강도와 같습니다.

라이브 셀의 실제 측정에 이러한 개념을 적용하기 위해 Gratton 및동료(18)는 각 픽셀에 대해 평균 강도에 대한 분산의 비율로 명백한 밝기 B를 정의합니다.

B는 실험적으로 측정되는 파라미터입니다. 이 작품에서, HeLa 세포의 혈장 막에 있는 FGFR1 수용체의 시계열 심상 심자는 TIRF 현미경 검사법에 의해 포착되고 평균 명백한 밝기, B는, N&B 분석에 의해 결정됩니다. 이어서, FGF2를 첨가한 후, 연속적인 타임시리즈는 정준 리간드로 수용체의 자극 후 막 표면에서 수용체 분자의 자가 조립의 변화를 따르도록 포획된다.

그러나 TIRF 현미경의 검출기는 EMCCD 카메라이므로 명백한 밝기에 대한 발현은19로수정해야합니다.

여기서 오프셋은 검출기 설정의 특성인 검출 전자의 강도 오프셋입니다. 아날로그 검출기의 분산 및 평균 강도는 각각 다음을 통해 제공됩니다.

여기서 G는 디지털 레벨(DL/광자)의 아날로그 이득인 경우, S는광자19당디지털 레벨이 일정한 강도(시간적 변동 없음)를 가진 광원에 대한 강도 대 분산 플롯의 경사에 의해 주어집니다. γ 계수는 픽셀 검출 볼륨의 형상과 관련이 있다. Hassleret al. 32에따르면, γ 계수는 검출카메라(19)의최대 이득에서 작동하는 TIRF 이미징에 대해 0.3과 동일하다. 오프셋, S 및 G 매개 변수는 카메라와 현미경의 특성입니다. 명백한 밝기 B는 eq. 12 및 13에 따라 eq. 11을 재배열하여 얻어집니다.

실험적으로, θ는 레이저 강도와 시스템의 검출 효율의 복잡한 기능이다. 그럼에도 불구하고 B/S는 θ에 선형적으로 종속되므로 지정된 감지 모드에 대한 θ의 상대값을 결정하는 것만 중요합니다.

여기서 θ’는 θ에 비례합니다. 그러나 내부 참조를 사용하여 보정이 수행됩니다.

Protocol

1. 견본 준비 1일차. 유리 바닥 접시에 100,000-200,000 세포 / mL의 농도에서 완전한 배지에 종자 HeLa 세포. 씨앗 6-8 접시를 복제합니다.참고: 이 예에서, 배지는 10% 열 불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS), 1 mM 나트륨 피루브, 100 U/ 100 μg 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충됩니다. 여러 가지 복제 요리가 준비됩니다. 2-3일차. 세포가 하위 합류에있을 때, 단백질 플라스미드와 요…

Representative Results

동일한 배양 접시에 시드된 두 개의 대표적인 HeLa-mEGFP-FGFR1 세포에 대한 결과는 도 5 및 보충표 1에나타내었다. 두 세포를 FGF2 리간드를 첨가한 후 0분(도5A,위) 및 7분(도5A,하단)에 포획하였다. 도 5는 ?…

Discussion

N&B는 셀 모델 및 라벨링 전략의 선택에 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 이미지 캡처 시간 동안 안정적으로 부착된 상태로 유지되는 라이브 셀에만 적용할 수 있습니다. 전체 셀 강성 변위로 인한 추가 변동은 적절한 이미지 복원 접근법38로처리될 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 세포가 움직일 때, 세포막은 또한 변형되고, 구조 변형, 큰 추가 편광을 일으키, 막 단백질의 분석…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CNIC는 시엔시아, 이노베이션 y 유니버시다데스 및 프로 CNIC 재단의 지원을 받으며, 세베로 오초아 우수 센터(SEV-2015-0505)입니다. 우리는 또한 유럽 지역 개발 기금 (FEDER) “우나 마네라 드 헤이서 유로파”에 의해 지원됩니다. UC는 아소시아지오네 이탈리아나 리카르카 술 칸크로, 국제 암 연구 협회(현재 전 세계 암 연구로 알려짐), 이탈리아 보건부의 지원을 인정합니다. A.T.는 2011-2012년 “프로게토 프로게토 프로페셔널이바노 베치”와 함께 자신의 작품을 부분적으로 지원한 것에 대해 “폰다지오네 방카 델 몬테 디 롬바르디아”를 인정합니다.

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections
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OligomerizationCell Surface ReceptorsTIRF MicroscopyNumber And Brightness AnalysisReceptor ClusteringFGFR1Fluorescence FluctuationLive Cell ImagingProtein OligomerizationCell Signaling

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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).
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