Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte
Bu makalede
Özet
Özet
Reseptör oligomerizasyonunun önemi ne kadar önemli ve her yerde yer alsa da, kümeleme olaylarının saptandırılması ve kümelenme derecesinin ölçülmesi için çok az yöntem uygulanmaktadır. Burada, canlı hücrelerin zarındaki mEGFP etiketli-reseptör homokomplekslerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır. N&B, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS) ve foton sayma histogramına (PCH) benzer bir yöntemdir ve floresan ların floresan şiddetindeki dalgalanmaların bir aydınlatmaya girip çıkmasındaki dalgalanmaların istatistiksel analizine dayanır. bir gözlem süresi boyunca hacim. Özellikle, N & B oligomerik karışımların proteinlerin ortalama sayısı hakkında bilgi edinmek için PCH bir basitleştirme olduğunu. Yoğunluk dalgalanma genlikleri floroformoleküler parlaklık ve aydınlatma hacmi içinde floroforların ortalama sayısı ile tanımlanır. Böylece, N & B genlik dağılımı, yani, ortalama yoğunluğu ve varyans sadece ilk ve ikinci anları dikkate alır. Bu, aynı zamanda, güç ve yöntemin zayıflığıdır. Sadece iki dakika düşünüldüğünden, N&B bir karışımdaki bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, sadece floresan yoğunluğunun zaman dalgalanmalarını izleyerek, canlı hücrelerin görüntülerinin piksel piksel bazında nispeten küçük zaman serilerine (diğer an yöntemleriyle karşılaştırıldığında) uygulanabilir. Piksel başına etkili süreyi birkaç mikrosaniyeye düşürerek saniyeler ile milisaniye arasında zaman aralığında edinme sağlar ve bu da hızlı oligomerizasyon kinetikleri için gereklidir. Son olarak, büyük hücre alanları ve alt hücre altbölümleri incelenebilir.
Giriş
Canlı hücrelerin plazma zarındaki reseptör moleküllerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için toplam Internal Yansıma Floresan-Sayı ve Parlaklık (TIRF-Sayı ve Parlaklık) görüntüleme yaklaşımını, reseptör diziliyi bağlamayı amaçlayan bir toplam iç yansıma floresan-sayı ve parlaklık (TIRF-N&B) görüntüleme yaklaşımını tanımladık. proteinlerin biyolojik işlevine dinamikler (Şekil 1).
Hücre dışı ligand bağlanması üzerine reseptörler konformasyonlarına, oliomerizasyonlarına, potansiyel ko-reseptörlerine ve membran kompozisyonlarına bağlı olarak hücre içi sinyal iletimini başlatırlar. Reseptör oligomerizasyonunun önemi ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Örnek Hazırlama
- Birinci gün. Cam dipli yemeklerde 100.000-200.000 hücre/mL konsantrasyonda tam ortamda Tohum HeLa hücreleri. Tohum 6-8 çoğaltmak yemekleri.
NOT: Bu örnekte ortam ısı inaktive Fetal Sığır Serumu (FBS), 1 mM sodyum pirüuvat, 100 U/100 μg penisilin/streptomisin ile desteklenmektedir. Birkaç çoğaltma yemekleri hazırlanır. - 2-3. gün. Hücreler alt-fluency olduğunda, protein plazmid ile yemeklerin yarısını transfect ve referans plazmidler ile ikinci yarısında (monomer ve dimer), serumsuz ortamda.
NOT: Transfeksiyon, Fenol Kırmızısı olmadan antibiyotik, %0.1 Sığır Serum Albumin ve 25 mM HEPES tampo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aynı kültür çanamında tohumlanmış iki temsilci HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinin sonuçları Şekil 5 ve Ek Tablo 1'degösterilmiştir. İki hücre, FGF2 ligand'ın eklenmesinden sonra 0 dk(Şekil 5A, üst) ve 7 dk(Şekil 5A, alt) zamanda ele geçirildi.
Şekil 5 ayrıca saf monom.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
N & B hücre modeli ve etiketleme stratejisi seçiminde çeşitli önlemler gerektirir. Yalnızca görüntü yakalama süresi boyunca uygun şekilde yapışmış kalan canlı hücrelere uygulanabilir. Tüm hücre katı deplasman nedeniyle ekstra dalgalanmalar uygun görüntü restorasyon yaklaşımları ile ele alınabilir38. Ancak, genellikle bir hücre hareket ettiğinde, hücre zarı da deforme olur, ve yapı deformasyonu, büyük ekstra varyans üreten, membran proteinlerinin analizi için ciddi sınırlama lar ortaya çıkar. Bu ça.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
CNIC, Ciencia Bakanlığı, Innovacion y Universidades ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenir ve Severo Ochoa Mükemmellik Merkezi 'dir (SEV-2015-0505). Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) "Una manera de hacer Europa" tarafından da destekliyoruz. UC Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği (şimdi Dünya Çapında Kanser Araştırma olarak da bilinir) ve İtalya Sağlık Bakanlığı desteğini kabul eder. A.T., 2011-2012'de PV Bursu "Progetto Professionalità Ivano Becchi" ile yaptığı çalışmaları kısmen desteklediği için "Fondazione Banca del Monte di Lombardia"yı kabul etti.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3 Renkli Hızlı TIRF Leica TIRF MC ters mikroskop, smi-otomatik TIRF hizalama ile. Mikroskop, bir diyot 488 nm lazer, 100x 1.46 yağ TIRF objektifi, 490/20 ve 525/50'de Ex/Em Bant Geçiren filtreler, sıcaklık/CO2 inkübatörü ve Andor DU 8285 VP EMCCD kamera ile donatılmıştır. Mikroskop, Leica LIF yazılımı tarafından çalıştırılır. | Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya | ||
| Sığır Serumu Albümini% 98 minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, ABD | A7906-100G | |
| Fenol Kırmızısı içermeyen DMEM, 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD | 21063029 | Mikroskopi için ücretsiz serum |
| DMEM yüksek glikozlu GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD | 10566-016 | Komple ortam için kullanılır |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, Fransa | X0515-500 | |
| Emisyon bölme sistemi Fotometri DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, ABD | ||
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, Brezilya | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD | 10270106 | Tam ortam için% 10 inaktive edilmiş takviye |
| Cam alt 35 mm steril 1.5 tabak | MatTek, Ashland, MA, ABD | P35G-0.170-14-C | kaplamasız, cam kalınlığı 0.17 mikron |
| GraphPad Prizma | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD | ||
| İnsan servikal karsinomu (HeLa), serumsuz hayvan bileşeni (AC) hücreleri | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Almanya | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (arkadan aydınlatmalı) ANDOR Solis yazılımı tarafından kontrol edilen ANDOR kamera | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Birleşik Krallık | Mikroskobun ek bir portuna takılan bu kamera, N& B zaman serisi | |
| Matlab Yürütülebilir N & B rutin | Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, Madrid, İspanya | https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penisilin:Doku kültürü için streptomisin 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, ABD | LONZA 17-602E | Penisilin / Streptomisin 100 U / 100 mikro; g'de ortam için takviye |
| pN1-mEGFP-FGFR1 ekspresyon vektörü | Jinekolojik Onkoloji Araştırma Birimi, Avrupa Onkoloji Enstitüsü IRCCS, Milano, İtalya | Zamai ve ark., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI ekspresyon vektörü | Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, Madrid, İspanya | Hellriegel ve diğerleri, 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI ekspresyon vektörü | Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, Madrid, İspanya | Hellriegel ve ark., 2011 | |
| Rekombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., Londra, İngiltere | Ligand çözeltisi: PBS'de 20 ng/mL FGF2 %0.01 BSA ile desteklenmiştir. | |
| Sodyum piruvat GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | için 1 mM takviyesi |
| MirusBio LLC, Madison, WI, ABD | MIR 2300 | ||
| Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD | 25200056 | |
| F Tipi Daldırma sıvısı 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | Transfeksiyonlar için kullanılan fenol kırmızısı içermeyen ortam için %0,1 takviye |
Kaynaklar
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
