Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

Canlı hücrelerin plazma zarında ligand bağlanması ile indüklenen mEGFP etiketli-reseptör oligomerlerinin ortalama oligomerik durumunun belirlenmesi için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır.

Abstract

Reseptör oligomerizasyonunun önemi ne kadar önemli ve her yerde yer alsa da, kümeleme olaylarının saptandırılması ve kümelenme derecesinin ölçülmesi için çok az yöntem uygulanmaktadır. Burada, canlı hücrelerin zarındaki mEGFP etiketli-reseptör homokomplekslerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için bir görüntüleme yaklaşımını tanımladık. Protokol, Sayı ve Parlaklık (N&B) analizi ile birlikte Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobuna dayanmaktadır. N&B, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS) ve foton sayma histogramına (PCH) benzer bir yöntemdir ve floresan ların floresan şiddetindeki dalgalanmaların bir aydınlatmaya girip çıkmasındaki dalgalanmaların istatistiksel analizine dayanır. bir gözlem süresi boyunca hacim. Özellikle, N & B oligomerik karışımların proteinlerin ortalama sayısı hakkında bilgi edinmek için PCH bir basitleştirme olduğunu. Yoğunluk dalgalanma genlikleri floroformoleküler parlaklık ve aydınlatma hacmi içinde floroforların ortalama sayısı ile tanımlanır. Böylece, N & B genlik dağılımı, yani, ortalama yoğunluğu ve varyans sadece ilk ve ikinci anları dikkate alır. Bu, aynı zamanda, güç ve yöntemin zayıflığıdır. Sadece iki dakika düşünüldüğünden, N&B bir karışımdaki bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, sadece floresan yoğunluğunun zaman dalgalanmalarını izleyerek, canlı hücrelerin görüntülerinin piksel piksel bazında nispeten küçük zaman serilerine (diğer an yöntemleriyle karşılaştırıldığında) uygulanabilir. Piksel başına etkili süreyi birkaç mikrosaniyeye düşürerek saniyeler ile milisaniye arasında zaman aralığında edinme sağlar ve bu da hızlı oligomerizasyon kinetikleri için gereklidir. Son olarak, büyük hücre alanları ve alt hücre altbölümleri incelenebilir.

Introduction

Canlı hücrelerin plazma zarındaki reseptör moleküllerinin ortalama oligomerik durumunu belirlemek için toplam Internal Yansıma Floresan-Sayı ve Parlaklık (TIRF-Sayı ve Parlaklık) görüntüleme yaklaşımını, reseptör diziliyi bağlamayı amaçlayan bir toplam iç yansıma floresan-sayı ve parlaklık (TIRF-N&B) görüntüleme yaklaşımını tanımladık. proteinlerin biyolojik işlevine dinamikler (Şekil 1).

Hücre dışı ligand bağlanması üzerine reseptörler konformasyonlarına, oliomerizasyonlarına, potansiyel ko-reseptörlerine ve membran kompozisyonlarına bağlı olarak hücre içi sinyal iletimini başlatırlar. Reseptör oligomerizasyonunun önemi ve her yerde, hücreselsinyalizasyon daönemli bir olay olarak kabul rağmen 1,2,3,4,5,6, 7, birkaç yöntem kümeleme olayları algılayabilir ve deneyselkümelemederecesini ölçmek 8,9. Konfokal hacim (x,y 』 300 nm, z 』 900 nm) moleküler etkileşimi ve stokiyometriyi kanıtlamak için yeterli olarak çözülmüş, görüntü restorasyon algoritmaları tarafından optimizasyon dan sonra bile10. Protein oligomerlerinin alt birim bileşimi, PALM11, STORM12ve STED13gibi 20-70 nm x,y çözünürlükte süper çözünürlük yöntemleriyle bile tamamen mekansal olarak çözülemez. Ayrıca, onların zamansal çözünürlük (görüntü başına dakika sırasına göre) saniye aralığında kinetik takip edemez. Tek moleküllü adım ağartma protein oligomerlerinin stoiyometrisini ancak hareketsiz olduklarında çözer14.

Floresan etiketli proteinlerin tek bir görüntü içinde yoğunluk ve oliomerizasyonunu ölçmek için en çok yönlü yöntemlerden biri, mekansal örneklemeye dayanan mekansal yoğunluk dağılım analizidir (SpIDA). Hem kimyasal olarak sabit hem de canlı hücreler için geçerlidir ve aynı anda standart floresan mikroskobu15kullanarak hücrenin ilgi çeşitli bölgelerin analizisağlar. Alternatif olarak, floresan-korelasyon spektroskopisi (FCS)16,foton sayma histogramı (PCH)17ve Sayı ve Parlaklık (N&B)18,19gibi moment yöntemleri kantitatif oligomer için uygundur Ölçüm. Bu yöntemler, floresan ların aydınlatma hacmine girip çıktığı zaman gözlemlenebilen floresan yoğunluk dalgalanmalarını analiz eder. Yoğunluk dalgalanmalarının genlikleri, floroforun moleküler parlaklığı (ε) ve aydınlatma hacmindeki ortalama florofor (n) sayısı(şekil 2)ile benzersiz bir şekilde tanımlanabilir. Tipik olarak, floroforların difüzyon katsayısı ve aydınlatma hacmi içindeki ortalama molekül sayısı (G(0) değeriile ters orantılı) FCS20ile elde edilebilir. Ancak, difüzyon süresi sadece kütlenin kübik kökü ile ölçeklenir beri, FCS moleküler kütle değişiklikleri tespit etmek için yeterince duyarlı değildir21. Uygulamada, tek renkli FCS membran reseptörlerinin dimerizasyon unu algılayamaz. PCH, farklı oligomerlerin karışımlarını doğru bir şekilde çözer. Genlik dağılımının iki dakikadan fazlaını kullanarak, aynı aydınlatma hacmini kaplayan farklı parlaklıktaki molekülleri algılar. Tarama FCS22 ve gelişmeler, moleküler parlaklık ilginç çift korelasyon gibi (pCOMB) yaklaşım23, biyolojik sistemlerde floresan korelasyon yöntemlerinin uygulanabilirlik aralığını genişletmek için tanıtıldı24 , bir hücrenin geniş bir alanında hızlı ölçüm yeteneği nden yoksun tek noktalı yöntemler kalır, saniye sırasına göre her piksel ve veri toplama birçok ardışık gözlemler gerektiren.

N&B, PCH'nin floresan dağılımının genliğin inkişanın sadece birinci ve ikinci anlarını, yani ortalama yoğunluğunu, , ve varyans, σ2 (Şekil 2) 18,19'udikkate alan basitleştirilmiş bir sürümüdür. ve bu nedenle, bir karışımda bilinmeyen oligomerlerin molar fraksiyonunu belirleyemez, ancak sadece karışımın ortalama oliomerizasyon durumunu tahmin eder. Bununla birlikte, N & B sadece floresan yoğunluğu zamanında dalgalanmaları izleyerek, bir piksel-piksel bazında PCH daha canlı hücrelerin görüntüleri nispeten daha küçük zaman serisi ile çalışma avantajı vardır. N&B piksel başına zamanı birkaç mikrosaniyeye düşürebildiği için, büyük hücre alanları üzerinde hızlı oligomerizasyon kinetiği izleyebilir ve raster tarama mikroskopisinde (örn. konfokal, 2-foton) ve milisaniyelerde saniyeler ölçeğinde görüntü elde edilmesine izin verir. kamera tabanlı mikroskopide (örn. TIRFM).

Çeşitli raporlar, Genişletilmiş hücre bölgelerini görüntüleyerek protein kümelerinde alt birim sayısını ölçebilme yeteneğini göstermiştir. PAXIllin-EGFP kümeleri CHO-K1 hücrelerinde adezyon bölgelerinde tespit edildi25, ve patojenik Httex1p peptid in hücre içi agregasyonu COS-7 hücrelerinde tanımlanmıştır26. N & B ErbB reseptörünün ligand tahrikli oligomerizasyonu aşağıdaki için uygulandı27, ve HeLa hücrelerinde Klothob üzerinde ligand FGF21 etkisi (KLB) ve FGFR1c HeLa hücrelerinde28. TIRF görüntüleme ve N & B analizi kombinasyonu dinamin-2 öncelikle tüm hücre zarı29boyunca tetramerik olduğunu göstermek için kullanılmıştır. UPAR ve FGFR1 hücre zarı reseptörlerinin ligand tahrikli dimerizasyonunu kanıtlamak için hem raster tarama sınahem de TIRF görüntülerine N&B uyguladık30,31.

N&B, FCS ve PCH gibi floresan korelasyon yöntemleri, açık bir hacimde parçacıkların işgal sayısının Bir Poisson dağılımını izlediği fikrine dayanır. Sadece floroforların emit tespit edilebildiği fotonlar, görüntünün bir pikselinde ölçülen floresan yoğunluğuile zaman arasındaki ortalama değer, aydınlatma hacmindeki ortalama floresan sayısının, n ve bunların moleküler parlaklık, ε17:

molekül aydınlatma hacminin merkezindeyken molekül başına zaman birimi başına yayılan foton sayısı (geleneksel olarak saniyede) olarak ifade edilir.

Parlaklık belirli bir edinim kurmak her florofor bir özelliğidir, yoğunluk tüm floroforlardan tüm katkıların toplamı ise. Biyolojik yarışmalarda, birlikte dalgalanan florofor sayısının artmasıyla parlaklık artarak floresan etiketli proteinin oliomerizasyon durumu hakkında bilgi verecektir. Belirli bir pikseldeki dalgalanma genlikleri floresan sinyalinin varyansından ölçülür, σ2:

Yoğunluk karesinin ortalaması ve yoğunluk ortalamasının karesi, her karenin her pikselindeki tek tek yoğunluk değerlerinden hesaplanır:

k zaman serisindeki toplam kare sayısıdır. Deneysel olarak, tüm görüntü serisi için ortalama yoğunluk değeri etrafında tek bir görüntünün her pikselinde tek tek yoğunluk değerlerinin dağılım açıklayan varyans hesaplamak için gereklidir. Varyans, farklı kökenlerdeki tüm dalgalanmaları içerir. İlk yaklaşık olarak, aydınlatma hacmindeki difüzyon parçacıklar nedeniyle varyans, σ20, dedektör atış gürültüsü nedeniyle varyans ayrılabilir, σ2d. İki varyans bağımsızdır; böylece, toplam varyans onların toplamı ile verilir:

Algılama hacmindeki ve dışında meydana gelen moleküler dalgalanmalar nedeniyle varyans, moleküler parlaklığa ve yoğunluğa doğrusal olarak bağlıdır:

Eq 1'e göre eq 6'nın yeniden düzenlenmesi:

Floresan korelasyon spektroskopisinde tipik kavrama göre, 7.

Daha sonra, dedektör dalgalanmaları nedeniyle varyans dedektör doygunluk sınırı nın altında çalıştırılır varsayımı altında, tespit yoğunluğunun doğrusal bir fonksiyonudur19:

Foton sayma dedektörleri durumunda a=1 ve c=0, böylece dedektör varyans ortalama yoğunluğuna eşittir:

Bu kavramları canlı hücrelerdeki gerçek ölçümlere uygulamak için Gratton ve meslektaşları18, her piksel için görünür parlaklığı, B'yi ortalama yoğunluk üzerinde varyans oranı olarak tanımlar:

B, deneysel olarak ölçülen parametredir. Bu çalışmada, HeLa hücrelerinin plazma zarındaki FGFR1 reseptörlerinin zaman serisi görüntüleri TIRF mikroskobu ile yakalanır ve ortalama parlaklık olan B, N&B analizi ile belirlenir. Daha sonra, FGF2 eklenmesinden sonra, ardışık zaman serileri kanonik ligand ile reseptör uyarılmasından sonra membran yüzeyinde reseptör moleküllerinin kendi kendine montaj değişiklikleri takip yakalanır.

Ancak, TIRF mikroskobu dedektörü bir EMCCD kamera olduğundan, görünür parlaklık için ifade19olarak değiştirilmesi gerekir:

ofset dedektör ayarlarının bir özelliğidir algılama elektroniği yoğunluğu ofset nerede. Bir analog dedektör için varyans ve ortalama yoğunluğu sırasıyla tarafından verilir:

nerede G dijital düzeylerde analog kazanç (DL / foton), S, foton başına dijital düzeyleri19, sabit yoğunluğu (hiçbir zamansal dalgalanmalar) ile bir ışık kaynağı için bir yoğunluk karşı varyans arsa eğimi tarafından verilir. Γ faktörü piksel algılama hacminin şekli ile ilgilidir. Hassler ve ark.32'yegöre γ faktörü, algılama kamerası19'unmaksimum kazancıyla çalışan TIRF görüntülemeiçin 0,3'e eşittir. Ofset, S ve G parametreleri kamera ve mikroskop özellikleridir. Görünür parlaklık, B, eq 11 eq 12 ve 13 göre yeniden düzenlenmesi ile elde edilir:

Deneysel olarak, ε lazer yoğunluğu ve sistemin algılama verimliliği karmaşık bir fonksiyonudur. Bununla birlikte, B/S doğrusal olarak ε'ya bağlı olduğundan, yalnızca belirli bir algılama modu için ε'nin göreli değerini belirlemek önemlidir:

ε' ile orantılı dır. Yine de, bir kalibrasyon dahili bir başvuru kullanılarak gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Örnek Hazırlama

  1. Birinci gün. Cam dipli yemeklerde 100.000-200.000 hücre/mL konsantrasyonda tam ortamda Tohum HeLa hücreleri. Tohum 6-8 çoğaltmak yemekleri.
    NOT: Bu örnekte ortam %10 ısı inaktive Fetal Sığır Serumu (FBS), 1 mM sodyum pirüuvat, 100 U/100 μg penisilin/streptomisin ile desteklenmektedir. Birkaç çoğaltma yemekleri hazırlanır.
  2. 2-3. gün. Hücreler alt-fluency olduğunda, protein plazmid ile yemeklerin yarısını transfect ve referans plazmidler ile ikinci yarısında (monomer ve dimer), serumsuz ortamda.
    NOT: Transfeksiyon, Fenol Kırmızısı olmadan antibiyotik, %0.1 Sığır Serum Albumin ve 25 mM HEPES tamponu ile takviye edilen serumsuz ortamda yapılır.
  3. 3-4. gün. Transfected hücrelerin bulaşıkların altına yapışıp yapışmadığını ve hücre zarının floresan olup olmadığını kontrol edin. Aşırı büyümüş hücreler le veya çok düşük floresan ile bulaşıkları atın.
    NOT: Hücrelerin büyümesine izin vermeyin. Hücreler iyi dağıtılmalı ve yemeğin cam alanına yapıştırılmalıdır(Şekil 1A). Precoated cam alt tabaklar hücre yapışması lehine kullanılabilir. Hücre kültürü herhangi bir deneyden önce mikoplazma kontaminasyonu için test edilir. Bu örnekte hücreler (A207K)mEGFP-FGFR1 plazmidi ile transfekte edilir ve referans hücreler standart protokoller kullanılarak GPI-(A207K)mEGFP ve GPI-(A207K)mEGFP plazmidleri ile transfekslenir. Canlı hücre mikroskobu için göstergesiz bir ortam önerilir; Görüntüleme sırasında pH değişikliklerini önlemek için 25 mM HEPES tamponu eklenir.

2. TIRF Görüntüleme — Lazer Hattının Hizalanması ve TIRF Aydınlatmasının Optimizasyonu

  1. Deneyden dört saat önce, mikroskobun sıcaklık inkübatörünü 37 °C'de aktif hale getirin.
  2. Mikroskobu, bilgisayarları ve kameraları açın ve kameraların uygun çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan kameranın çalışma sıcaklığı -75 °C'dir.
  3. Hedefe biraz damla yağ yerleştirin. Yerine örnek bir tabak koyun. Kuvöz kapılarını kapatın ve yemeğin sıcaklığının (~10 dk) dengelemasına izin verin.
  4. Epifloresan lambasını ve 488 nm lazeri açın.
  5. Örneği keşfetmek için epifloresan kontrast modunu seçin ve okülerden odaklanmak için bir hücreyi arayarak.
    NOT: Oküler yalak hücreleri aramak için bir floresan lamba kullanımı zorunlu değildir. Bunun yerine uygun bir lazer hattı kullanılabilir.
  6. Mikroskop kamerası (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50 veya benzeri aracılığıyla yeşil emisyon toplamak için uygun filtreyi seçin.
  7. Epifloresan modunda gözden kamera portuna (Şekil 1'dekamera #1) geçin, odağı hassaslaştırın ve TIRF moduna geçin. Epifloresans ve TIRF modları mikroskobun markasına bağlı olarak farklı bir adlandırma ile adlandırılabilir.
    NOT: Coverslip arabiriminde floresan belirteçler yoksa lazeri odaklayan veya hizalayan sorunlar olabilir. Lazeri düzgün bir şekilde hizalamak için (iyi TIRF için gerekli), kapak kaymasına odaklanın. Genellikle kapak kayması odak olup olmadığını belirlemek çok zordur. Bir öneri olarak, hücrelerin kenarlarına odaklanın.
  8. TIRF mikroskobunun yönergelerini izleyerek otomatik hizalamayı etkinleştirin.
    NOT: Kısaca, 2.4'ten 2.8'e kadar olan adımlar için, önce hücreleri göz lerden geçirip üzerlerine odaklanın, sonra emisyonunu TIRF mikroskobunun kamera portuna gönderin, hücreleri mikroskop bilgisayar ekranındaki yeniden odaklayın ve lazer hizalama prosedürünü etkinleştirin. Hizalama, aydınlatmanın evanescent hale gelir kritik açı bulma oluşur (Şekil 3). Ticari mikroskoplar biraz farklı hizalama protokolleri olabilir ve aynı zamanda tam otomatik olabilir; diğerleri kritik açı koşullarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için küçük bir kamera olabilir.
  9. Uygun bir aydınlatma derinliği seçin ve evanescent alanın yönünü optimize (Şekil 3).
    NOT: Penetrasyon derinliği tüm kontroller ve numuneler için sabit tutulur.

3. TIRF Görüntüleme: Zaman Serisi yakalama

  1. En az 256 x 256 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
    NOT: Bu kurulumda, yakalama doğrudan sadece kamera (Şekil 1 göstergebakınız) kontrol yazılım altında kamera #2 ile yapılır.
  2. 1 ms'e ve EM kazancına 1.000'e maruz kalma ayarlayın (bu 12 ve 13'teki G faktörüdür). Böyle bir hızda, lazer gücünü ayarlamak veya artırmak gerekebilir. Burada lazer gücü 0.5 mW'tır.
    NOT: Kameranın türüne ve proteinin difüzyon katsayısı, floresan şiddeti ve arka planının uyguladığı sınırlara bağlı olarak, lazer gücünü ayarlamak için genel kriterler dedektörü doygunluğa uymayacak, fotobeyaztlamayı en aza indirmek ve makul bir S/N'de mümkün olduğunca hızlı. EM kazancı her zaman kameranın maksimumuna ayarlanır (Bkz. Giriş).
  3. İlk koşullar altında ilk deneme sırasını çalıştırın ve S/N değerini kabaca tahmin edin. Koşullar, ilk kez serilerinin ilk karesinde ölçüldüğü gibi, S/N = 2-3 veya daha yüksek koşullarda kabul edilebilir.
  4. Görüntünün bir tarafını maskelemek için #2 mikroskoba bağlayan emisyon bölme sisteminin kaydırıcısını kullanın (Şekil 1B, Şekil 4A-B)
    NOT: Bu kurulumda aynı anda iki mekansal özdeş görüntü elde etmek için kamera #2 bir çok kanallı görüntüleme konektörü yüklenir. Sistem, farklı emisyon filtrelerinin montajı için kaydıraklarla donatılmıştır. Kaydırıcılardan biri, görüntünün bir tarafını örtmek için siyah bir maske bağlar. Maskeli alan, kamera parametrelerini belirlemek için her zaman serisinin iç kalibrasyonu için kullanılır (eq. 12 ve eq. 13). Bu şekilde bağımsız bir kalibrasyon adımına gerek yoktur ve daha da önemlisi, kalibrasyon her zaman serisinin yakalanmasına paralel olarak gerçekleştirilir. Bu sistemin yokluğunda, kamera yayınlanan protokolleri uygulayarak kalibre edilebilir33.
  5. Kamera dosyası otomatik kaydetme seçeneğini seçin.
  6. Görüntü serisinin edinimini başlatın. En az 2 S/N oranında en az 700 kare edinin.
    NOT: Analiz için gerekli olan çerçeve sayısı, fotobeyazrlama ve verilerin dağılım örnek kararlılığına bağlıdır. Bu nedenle, her zaman serisinin kalitesi N & B analizi sırasında değerlendirilir.
  7. Mikroskop dışında çanak almadan, ligand ekleyin.
  8. Parlak floresan membranı olan bir hücre seçin ve kinetik çalıştırmanın ilk serisini hızlı bir şekilde başlatın.
    NOT: Ligand ilavesi hızlı bir şekilde yapılırsa, bu ilk yakalama ligand kinetik noktası = 0 zaman ayarlar. Yazılım yakalama tam saatini kaydeder.
  9. İkinci bir hücreyi arayın ve kinetik ikinci kez noktası elde.
    NOT: Nokta ziyaret rutinleri x,y,z motorize aşamaları ile donatılmış bazı mikroskoplarda mevcuttur. Bunlar hücre çanağı üzerinde birden fazla pozisyonun ezberlemesine izin verir ve farklı hücrelerdeki görüntü serileri arasında daha sabit bir zaman aralığı nın tutulmasına yardımcı olabilir.
  10. Kinetik çalıştırmanın her zaman noktası için yeni bir hücre yakalayın.
    NOT: Yakalama dan sonra, bir hücre kısmen fotobeyazrlanır ve yeniden görüntülenemez. Bu nedenle, kinetik birçok hücre, her biri farklı bir zaman noktasında yakalanan zaman serisi birleştirerek elde edilir.
  11. Her yeni yemek için, 2.3'ten 3.9'a kadar protokolü tekrarlayın.
    NOT: Referans yemekler için, aracın bir hacmi ekleyin (PBS% 0.01 sığır serum albumin ile birlikte) ligand için kullanılan eşdeğer.

4. Sayı & Parlaklık (N&B): Zaman Serisinin Kalite Kontrolü

  1. Dönüştürün ve kaydedin. TIFF kamera yazılımı (.sif dosyaları bu örnekte) ile elde edilen dosyaları.
  2. Ithalat. N & B grafik kullanıcı arayüzü (GUI) MATLAB etkinleştirerek analiz yazılımı rutin TIFF dosyaları.
    NOT: Özelleştirilmiş bir Matlab çalıştırılabilir N & B rutin burada kullanılır (Https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia N & B analizi). Bir içe aktarılan. TIFF dosyası, rutin ortalama yoğunluk görüntü oluşturur, ortalama yoğunluk profili ve seri kare kare incelenmesine olanak sağlar (Ek Şekil 1). Diğer yazılımlar N&B analizi için kullanılabilir (örneğin, SimFCS yazılımı).
  3. Ortalama yoğunluk profilinin %10'dan fazla fotobeyaztlama gösterdiği seriyi atın ve edinim sırasında belirgin bir hücre zarı bozulması veya çevirisi olan serileri atın.
  4. Belirgin bir şekilde odak dışı olan çerçeveleri kırpma.
    NOT: Kırpma aracı, görüntü serisi içinde tek veya birden çok kare atmak için yordamda uygulanır. Bu işlem, kare kare zaman kritik değil, piksel çalışma süresi (pozlama süresi) ise (Bkz. Tartışma) olduğundan izin verilir.
  5. Analiz için en az 500 zaman dilimi olan sadece serileri saklayın.

5. Sayı ve Parlaklık (N&B): Kamera Parametrelerinin Belirlenmesi (Ofset, σ ve S)

  1. Rutin Kalibrasyon Kamerasınıetkinleştirin.
  2. Dedektör gürültü bölgesinde en az 20 x 50 piksellik bir alan seçin (Şekil 4).
    NOT: Yordam değerlerin bir histogram ı (ayrıca Dijital Düzey, DL olarak tanımlanır) kaynaklanır ve Sıklık ve Dijital Düzeyler bir logaritma arsa döndürür.
  3. Günlük Frekansı ve Dijital düzey çiziminde, Gaussian'ı ve eğrinin doğrusal kısmını sınırlamak için doğrusal kırmızı imleci hareket ettirin.
    NOT: Kırmızı imleç eğrinin iki bölümünü böler ve kamera tepkisinin Gauss fonksiyonunun merkezi olan ofset dönen rutini etkinleştirir, Gaussian uyumunun σ'si ve kamera nın doğrusal kısmının eğimi olan S faktörü e (Şekil 4C-D).

6. Sayı ve Parlaklık (N&B): Seçili Alandaki B değerlerinin hesaplanması (YG)

  1. B tuşunu etkinleştirin.
    NOT: Bu eylem, ortalama yoğunluk görüntüsünü(Şekil 5, ilk sütun) ve her bir B değerinin görüntüdeki ilgili pikselle ilişkili olduğu B görüntüsünü oluşturur (Ek Şekil 1).
  2. Verilerin dağılımını azaltmak ve B-I histogramı(Şekil 5, ikinci sütun) oluşturmak için en az bir binning (2 2) uygulayın.
    NOT: B-I histogramı, görüntünün tüm piksellerinin B-değerlerinin piksel yoğunluğuna göre dağılımını temsil eder. Y = B/S; X = ( - ofset)/S (Ek Şekil 1 ve eq. 11 ve 15).
  3. Etkileşimli kare imleci kullanarak B-I histogramını inceleyin.
  4. Çözümleme için bir kare yg(Şekil 5, üçüncü sütun) seçin.
    NOT: İmleç, kare imleç alanı içinde seçilen pikselleri vurgulayarak ortalama yoğunluk görüntüsünde bir mobil maskeyi senkronize eder(Ek Şekil 1). Bu inceleme ile, çok düşük yoğunluklu arka plan ve alanları analiz dışında dışlamak mümkündür.
  5. Seçili YG'nin(Şekil 5, dördüncü sütun) B-haritasını oluşturun.
  6. Seçimle ilişkili B değerlerinin ASCII dosyasını kaydedin.
  7. Verilerin frekans dağılımını hesaplamak ve ortalama B değeri ± S.E(Şekil 5, beşinci sütun) elde etmek için ASCII dosyasını bir grafik yazılımına aktarın.
    NOT: Veriler homojen sayılsa, B-değerlerinin frekans dağılımı bir Gauss dağılımına yaklaşık olarak gelir.
  8. Kinetik çalıştırmanın her zaman noktasında her hücre için ortalama parlaklığı = - 1 [(sayım/molekül) ] her hücre için türetmek için 15 uygulayın. Verileri aşağıdakilere göre normalleştirin:

    ligand ilavesinden sonra "t" zamanında ölçülen ortalama B değeri ve t=0 (ligand ilavesinden sonra 10-20 s) zamanda ölçülen ortalama B değeridir.
    NOT: Sonuçların normalleştirilmesi, farklı günlerde yapılan deneylerin doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlar. Lazer gücü ve teknik dalgalanmalar nedeniyle ölçülen parlaklıktaki farklılıkları telafi eder.
  9. Kinetik çalıştırmayı oluşturmak için Normalleştirilmiş Ortalama Parlaklık ve edinme süresini çizin (Şekil 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aynı kültür çanamında tohumlanmış iki temsilci HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinin sonuçları Şekil 5 ve Ek Tablo 1'degösterilmiştir. İki hücre, FGF2 ligand'ın eklenmesinden sonra 0 dk(Şekil 5A, üst) ve 7 dk(Şekil 5A, alt) zamanda ele geçirildi.

Şekil 5 ayrıca saf monomer, GPI-mEGFP(Şekil 5B, üst) veya kovalent bağlı dimerik florofor, GPI-mEGFP-mEGFP(Şekil 5B, alt ), hücre zarında maruz kalır ve aynı deneysel koşullar altında yakalanır.

HeLa-mEGFP-FGFR1 hücrelerinde ortalama görünür parlaklık 1.070 ± 0.001 S.E.'den 1.141 ± 0.001 S.E.'ye yükselirken, referans monomerik(Şekil 5B, üst) ve dimeric(Şekil 5B, alt) örnekleri B'yi döndürer sırasıyla 1.070 ± 0.001 S.E. ve 1.141 ± 0.001 S.E değerleri. Bu nedenle, karşılaştırma, FGFR1 reseptörü başlangıçta hücre zarı yüzeyinde monomerik formda ağırlıklı olarak mevcut, ancak kanonik ligand FGF2 ile stimülasyon üzerine baskın dimerik duruma doğru ilerler. Ortalama olarak, iki temsili hücrelerde FGFR1 moleküllerinin yaygın durumu açıkça farklıdır.

Aynı çanaktaki birden fazla hücreye analiz uygulanarak, her biri farklı bir zaman noktasında yakalanan, zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama parlaklık elde edilir(Şekil 6A). Şekil 6A'daki kinetik çalışma, hücre yüzeyinde birkaç dakika süren yavaş bir karartma işlemini açıklar. FGF2 kaynaklı FGFR1 dimerizasyonu ve reseptörün sonraki içselizasyonu iyi bilinen bir mekanizmadır34; bu nedenle, sonuçlar FGFR1 sinyal transdüksiyonu mevcut kavramı ile tam uyum içinde ve ince belirlenmesine kadar hücre zarı proteinlerinin oliomerizasyon çalışması için TIRF-N & B yaklaşımının potansiyelini onaylamak monomer-dimer dinamikleri.

Sonuçların normalleştirilmiş ortalama parlaklık analizi, farklı ligandların aynı reseptör üzerindeki etkisini karşılaştırmak için uygun bir araçtır. Bir örnek Şekil 6B'deverilmiştir. Protokol aynı standartlar kullanılarak tekrarlandı ve hücreleri kanonik olmayan FGFR1 ligand, NCAM-Fc (50 μg/mL) ile uyardı. Bu durumda, kinetik profil oligomerik karışımlarda reseptörün hızlı ve döngüsel geçişleri ortaya koymaktadır, aynı zamanda dimer üzerinde parlaklık değerlerine ulaşır. Normalleştirilmiş ortalama değeri 3 tekrar tekrar gözlenir. Ancak, N & B analizi sınırlama (yoğunluk dalgalanma karşı zaman sadece iki dakika dikkate alınır) şüphesiz bir trimerik formoluşumugöstermek için izin vermez. Aynı normalleştirilmiş ortalama parlaklık, reseptörün daha büyük oligomerve monomerlerinin çeşitli kombinasyonlarının sonucu olabilir. Ancak, sonuçlar açıkça aynı reseptör üzerinde iki ligand etkisinin spatiotemporal farklılıkları göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Deneysel protokole genel bakış. (A) Hücreler cam alt tabaklara kaplanır ve floresan etiketli reseptör ile transfected. (B) Zaman serisi görüntüleri, TIRF 100x 1.46 yağ hedefi ve kuluçka odası ile donatılmış ticari bir TIRF mikroskobunda yakalanır. Bu ticari kurulumda, yazılım dahili EMCCD kamera #1 N & B zaman serisi elde etmek için gerekli çok kısa pozlama süreleri çalışmasına izin vermez. Pozlama süresi yakalanabilir moleküler difüzyon aralığısınırlar beri bu önemli bir noktadır. Pozlama süresi ne kadar kısa olursa, analiz edilebilen moleküler difüzyon da o kadar hızlı olur. 0,5 ila 1 ms arasında değişen pozlama membran protein difüzyonu için yeterince hızlıdır. Bu nedenle, ikinci bir EMCCD kamera (#2) mikroskop yazılımı atlayarak, doğrudan kamera yazılımı altında çalışmak için mikroskop ek bir bağlantı noktasına eklenir. Bu uyarlanmış yapılandırmada, mikroskop yazılımı ve kamera #1 sadece TIRF hizalaması için kullanılır. TIRF zaman serisi daha sonra 1 ms ve maksimum EM kazanç gibi çok kısa pozlama süreleri çalışan kamera #2 kullanılarak elde edilir. Kamera #2 da görüntülerin aşırı örnekleme ve binning sağlayan 124 nm piksel boyutuna sahiptir (protokol bölümü 6.2 bakınız). Görüntüleme hızı kazanmak için diğer yapılandırmalar mümkündür, farklı TIRF mikroskopların özelliklerine bağlı olarak, sCMOS kameraların kullanımı tavsiye edilmez ise, gürültü görüntüde rasgele değildir çünkü35. (C) Ele geçirdikten sonra zaman serileri kalite kontrolü olarak denetlenir. Ortalama kare yoğunluğu ve kare numarası çizilerek belirlenebildiği için fotobeyaztma %10'dan yüksekse seriler atılır. Hücre zarında belirgin bir bozulma veya edinim sırasında hücrenin çevirisi belirgin bir bozulma varsa serisi de atılır. (D) Her pikseldeki ortalama yoğunluk kaydedilir. (E) Görüntünün her pikselinde görünen parlaklığı temsil eden Bir B-I histogramı, B oluşturulur. (F) B-I histogramı arka planın üzerinde bir Yatırım Getirisi seçmek için kullanılır. (G) B-değerlerinin frekans dağılımı ortalama B değerini belirlemek için analiz edilir ± S.E. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: N&B ilkesi. N&B, "K" görüntülerinin bir zaman yığını serisinin elde edilmesi sırasında aydınlatma hacmine girip çıktıklarında oluşan floresan dalgalanmalarını ölçerek floroforların ortalama oliomerizasyon durumunu ölçer. Dalgalanmaların genliği, dalgalanan sinyalin varyansı, σ2ve ortalama yoğunluk değeri arasındaki oranın hesaplanmasıyla istatistiksel olarak karakterize edilir. En basit senaryoda(A),aydınlatma hacmi boşolduğunda (yani floroforyok) oran enstrüman gürültüsünü açıklar. Eğer floresan sinyali mobil florofororlar(B,C)nedeniyle dalgalanırsa, "ekstra" varyans, difüzyon moleküllerinin moleküler parlaklığı, ε (molekül başına ve saniyede tespit edilen foton sayıları) ile doğru orantılıdır. In (B), 8 monomerik difüzyon floroforlar ve vardır (C), aynı floroforlar 2 tetramerik oligomerler olarak diffüz. Bu iki durumda, ortalama yoğunluk aynıdır, ancak standart sapma ve parlaklık farklıdır (1ε, 4ε), çünkü dalgalanmaların genlikleri farklıdır. ε = 0 floroforlar hareketsiz veya yok olduğunda. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: TIRF mikroskopisi. N&B multifoton, sürekli dalga veya darbeli tek foton lazerler ve analog veya foton sayma dedektörleri ile donatılmış raster tarama mikroskopları ile eşit derecede iyi çalışıyor olsa da, TIRF mikroskopmoleküler dinamiğin hızlı zamansal görüntülemesi için idealdir. diğer görüntüleme teknikleri ile elde edilmesi mümkün olmayan hızlar, çözünürlük ve sinyal/gürültü oranı (S/N) ile hücre yüzeyinde veya yakınında meydana gelen olaylar. (A) TIRF mikroskopi, açılı bir uyarma lazer ışığının sadece kapak lı cam-su arabiriminin hemen altında bulunan florofororları heyecanlandırdığı toplam iç yansıma prensibini kullanır. Lazer, numuneyi kırılmanın kritik açısından daha büyük veya eşit bir açıyla ışınlarken, uyarma lazer ışığı tamamen yansıtılır. Yansıma, evanescent dalgası adı verilen örnekte çok ince bir elektromanyetik alan oluşturur. Numunenin küçük ışıklı bölümü tarafından yayılan floresan ışık, slaytın altına dik olarak yerleştirilen bir mikroskop hedefi ile toplanır. (B) Panel, yüzeyden artan mesafe ile katlanarak azalan ve yüksek eksenel çözünürlükfloresans sağlayan, bir alanın göreceli yoğunluğunun ve derinliğinin belirli bir dalga boyunda temsili bir örnek gösterir. Görüntü. Yanal çözünürlük, sayısal diyafram açıklığı ve hedefin büyütülmesi ve algılama kamerasının piksel boyutu ile ayarlanır. Hücre iç aydınlatılmış değildir ve hücre içi otofloresan ile sinyale katkıda bulunmaz. Çok açılı TIRF mikroskoplar çeşitli penetrasyon derinliklerinin seçilmesini sağlar. Onlar uyarma dalga boyuna bağlı bir ölçek sağlamak ve genellikle tek renkli TIRF görüntü için 70 nm kadar 250 nm derinliğe gider. Bu protokol için seçilen evanescent aydınlatma derinliği 110 nm' dir ve düşük lazer gücü kullanma zorunluluğu ile penetrasyon derinliğinin azalması ile keskin bir şekilde azalan floresan sinyalinin yoğunluğu arasındaki uzlaşmanın sonucudur. Birçok hücre içi vezikülleri ve hücre içi florofor popülasyonunu aydınlatabilen aşırı büyük evanescent alanlardan kaçınmak önemlidir. Bu nedenle, numunenin türüne bağlı olarak, en iyi kombinasyonu aramak için çeşitli penetrasyon derinlikleri araştırılmalıdır: yüksek sinyal-gürültü oranı, düşük uyarma gücü, kısa pozlama süresi, kısa penetrasyon derinliği. Bu optimizasyon yapıldıktan sonra, penetrasyon derinliği tüm kontroller ve numuneler için sabit tutulur. (C) Bir HeLa-GPI-mEGFP hücresinin temsili epifloresan ve TIRF görüntüleri, evanescent alanının derinliği ve yönünün yazılım güdümlü optimizasyonu ndan sonra. Çok açılı TIRF mikroskoplar da evanescent alanın yönünü optimize etmek için izin verir. Bu adım, saçılmayı en aza indirmek için önerilir (yani, yoğunluğun keskin artışı ve daha az net görüntü) ve kullanılan özel mikroskobun talimatlarına göre gerçekleştirilebilir. Bu protokolde mikroskop yazılımı, evanescent alanının yönünün otomatik olarak optimizasyonunu içerir. Manuel optimizasyon için, yayınlanan protokollere bakın36,37. (D) MEGFP-FGFR1 yapısını epifloresan ve TIRF aydınlatmasının optimizasyonundan sonra ifade eden temsil hücre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Zaman serilerinin yakalanması ve kamera tepkisinin tek fotonlara kalibresi. (A) Kırpılmış Sensör Modundaki HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinde yakalanan 700 karelik zaman serisinin ilk karesinin örneği. Kamera çipi, TIRF mikroskobuna monte edilen çift görüş konektörü kullanılarak kısmen maskelenir (kırmızı dikdörtgenler)(Şekil 1B). İç kalibrasyon bölgeleri ortalama yoğunluk görüntüsünde(B)tanınır ve günlük frekansı ile Dijital Düzeyler(D)çizilerek kamera parametrelerini tahmin etmek için(C)işlenir. EMCCD kamera gibi bir analog algılama sistemi, foton sayıları yerine fotocurrent darbelerini algılar ve foton darbe yüksekliği dağılımı yarı-üsteldir. Dağıtımın ilk bölümü amplifikatör ve analogdan dijitale dönüştürücüden kaynaklanmaktadır ve Gaussian okuma gürültüsüne (sinyal kaydının getirdiği varyans) katkıda bulunur. Dağılımın en kalabalık kanalı (yani en sık değer) ofsettir (eq. 13). Bir günlük çiziminde dikey imleç kullanılarak, dağılımın ilk bölümü, tek bir fotona ortalama kamera yanıtını temsil eden 250 DL'nin üzerindeki üstel ikinci bölümden ayrılır (eğim eq. 12'deki S faktörüdür). Bu parametrelerin ölçülmesi, kazanım sırasında kaydedilen fotonların yoğunluğunun tahmin edilmesine olanak sağlar. Sayımlar (DL) sözde renk skalasındadır. Piksel boyutu = 124 nm; Görüntü formatı = 256x256 piksel, evanescent alan ~ 110 nm penetrasyon derinliği; Kalibrasyon Yatırım Getirisi #1 = 19x256 piksel; Kalibrasyon Yatırım Getirisi #2 = 5x256 piksel. DL = dijital düzeyler. Pozlama = 1 ms ve EMGain (12, 13 ve 14'teki G faktörü) = 1000. Arka planlı foton sayma modunda çalışan kameraların S = 1 (eq. 12) ve σ2d ve ofset (eq. 13) ile analog dedektörlere eşdeğer olduğunu unutmayın18analog sistem için aynı şekilde ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: FGFR1 oligomerizasyonunun N&B analizi. (A) Temsili sonuçlar aynı çanak mEGFP-FGFR1 ifade ve zaman 0 dk (üst) ve 7 dk (alt) 20 ng / mL FGF2 eklenmesinden sonra yakalanan ve (B) referans ifade iki HeLa hücreleri GPI-mEGFP (üst) oluşturur ve GPI-mEGFP-mEGFP (altta). Tüm analiz sıraları gösterir (soldan sağa): Zaman serisinin ortalama yoğunluğu; Renk kodunun görüntüde aynı B değerine sahip piksel sayısını temsil ettiği ve dikdörtgen imleçlerin ilgi bölgesini (YG), arka plan (BG) ve çok düşük bölgeleri sınırlandırdığı floresan yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak tüm B değerlerinin çizimi yoğunluğu (LI). Hareketsiz florofororların B-değeri = 1 vereceğini unutmayın çünkü dalgalanmalar ε = 0 yokluğunda; Seçilen Yatırım Getirisi ve ilişkili B-dağılım histogramının B-haritası. B değeri dağılımı, ortalama görünür parlaklığı, B (tam kırmızı çizgi) ve dağıtım istatistiklerini(Ek Tablo 1) B değeri = B' = B/S (eq. 15); Yoğunluk = ( - ofset)/S; M = monomer; D = dimer; ölçek çubukları = 10 mikron. Ek FilmHam veri zaman serisi 1 , Ek Film 2, Ek Film 3, ve Ek Film 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Ligand aktivasyonu ile indüklenen FGFR1 oligomerizasyonunun kinetikleri. HeLa-mEGFP-FGFR1 hücrelerinin Normalleştirilmiş Ortalama Parlaklığı (eq. 16) tarafından 20 ng/mL FGF2(A)veya 50 μg/mL NCAM-Fc (B) ile uyarıldıktan sonra tanımlanan temsili kinetik çalışır. Aynı çanaktaki hücreler artan zaman noktalarında ele geçirildi ve görünen ortalama parlaklık B ± S.E., B-dağılım histogramlarından hesaplandı. Bu rakam Zamai ve ark. Journal of Cell Science (2019)31'inizniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Hızlı Kinetik ve veri yorumu. HeLa-mEGFP-FGFR1 hücrelerinin NCAM-Fc (50 g/mL) veya FGF2 (20 ng/mL) ile uyarıldığı kinetik çalıştırmalardan elde edilen tüm Normalleştirilmiş Ortalama Parlaklık değerlerinin dağılım çizimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplemental Figure 1
Ek Şekil 1: MatLab'daki analiz rutininin ekran görüntüsü. N&B grafik kullanıcı arabiriminin (GUI) MATLAB yordamının ilk analiz adımlarını gösteren ekran görüntüsü: yükleme zaman serisi; ortalama yoğunluklu görüntü, işlem yoğunluğu profili, b-haritası ve B-I histogramını hesaplat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parametre GPI-mEGFP GPI-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (zaman = 0') mEGFP-FGFR1 (zaman = 10')
Gaussian ortalama B değeri 1.070 1.141 1.070 1.141
Ortalama B-değeri üzerinde S.E. 0.001 0.001 0.001 0.001
B-vaue dağılımının S.D. 0.059 0.067 0.077 0.075
Ortalama B değerinin %95 Güven aralığı 1.069 ile 1.071 arasında 1.139 ile 1.143 arası 1.069 ile 1.072 arasında 1.139 ile 1.143 arası
B değerinin %95 güven aralığının S.D. 0,058 ile 0,060 arasında 0,065 ile 0,069 arasında 0,075 ile 0,079 arasında 0,073 ile 0,078 arası
Montaj kısıtlaması S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0 S.D. > 0
S.E. standart hatası; S.D. standart sapması

Ek Tablo 1: Görünür Parlaklık Analizi. Şekil 5'teki B dağılımlarının istatistik ve Gaussian montaj parametreleri gerçekleştirilmiştir. En az kare Gaussian fits standart sapma > 0 x aralığı otomatik olarak seçilen ve maksimum yineleme = 1000 ile kısıtlama altında elde edildi. R karesi: mEGFP-FGFR1 monomer = 0.9957, mEGFP-FGFR1 dimer 0.9940; GPI-mEGFP = 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0.9970.

Supplemental Movie 1
Ek Film 1: Bir HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinin zaman serisi = FGF2 stimülasyonundan 0 dakika sonra (PBS'de 20 ng/mL %0.01 BSA ile tamamlanır) Şekil 5'tegösterilmiştir. 800 karelik seri 7 fps'de sıkıştırılmamadan çoğaltılır. Görüntü formatı = 256 x 256 piksel; piksel boyutu = 124 nm; Dahili kalibrasyon alanı koyu lateral bantlar olarak tanımlanır. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Supplemental Movie 2
Ek Film 2: Bir HeLa-mEGFP-FGFR1 hücresinin Şekil 5'inde gösterilen zaman serileri zaman = FGF2 stimülasyonundan 7 dakika sonra (PBS'de %0.01 BSA ile desteklenen 20 ng/mL) 800 karelik seri ler 7 fps'de sıkıştırılmamış olarak çoğaltılır. Görüntü formatı = 256 x 256 piksel; piksel boyutu = 124 nm; Dahili kalibrasyon alanı koyu lateral bantlar olarak tanımlanır. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Supplemental Movie 3
Ek Film 3: Aracı ekledikten sonra HeLa-GPI-mEGFP hücresinin Şekil 5'inde gösterilen zaman serisi (PBS %0.01 BSA ile desteklenmiştir). 1.000 karelik seri 7 fps'de sıkıştırılmamadan çoğaltılır. Görüntü formatı = 256 x 256 piksel; piksel boyutu = 124 nm; Dahili kalibrasyon alanı koyu lateral bantlar olarak tanımlanır. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Supplemental Movie 4
Ek Film 4: Aracı ekledikten sonra HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP hücresinin Şekil 5'inde gösterilen zaman serileri (PBS %0.01 BSA ile desteklenmiştir). 1.000 karelik seri 7 fps'de sıkıştırılmamadan çoğaltılır. Görüntü formatı = 256 x 256 piksel; piksel boyutu = 124 nm; Dahili kalibrasyon alanı koyu lateral bantlar olarak tanımlanır. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N & B hücre modeli ve etiketleme stratejisi seçiminde çeşitli önlemler gerektirir. Yalnızca görüntü yakalama süresi boyunca uygun şekilde yapışmış kalan canlı hücrelere uygulanabilir. Tüm hücre katı deplasman nedeniyle ekstra dalgalanmalar uygun görüntü restorasyon yaklaşımları ile ele alınabilir38. Ancak, genellikle bir hücre hareket ettiğinde, hücre zarı da deforme olur, ve yapı deformasyonu, büyük ekstra varyans üreten, membran proteinlerinin analizi için ciddi sınırlama lar ortaya çıkar. Bu çalışmada, floresan yapı HeLa hücre hattında ifade edilir, çünkü kurucu FGFR1 ihmal edilebilir. Kurucu proteinin varlığı önlemek için bir durumdur, aksi takdirde floresan ve floresan olmayan reseptör oligomerlerin karışık popülasyonları büyük olasılıkla oluşacak. Sonuç olarak, sadece floresan etiketli protein popülasyonunun parlaklığına dayanan N&B analizi, ortalama oligomerik durum hakkında güvenilmez bir tahminde bulunduracaktı. Bu yönü özellikle FGF2 ligand varlığında FGFR1 dimerization gibi parlaklık sadece 2 faktörü ile artar reseptör dimerizasyon olayları tespit etmek için N & B uygularken önemlidir. Böyle bir durumda, karışık dimers varlığı tamamen N & B tarafından tespit dimerization olayları gizleyebilirsiniz. Floresan oligomerlerin floresan olmayan kurucu formlarla kirlenmesi, etiketlenmiş protein büyük ölçüde aşırı ifade edilmedikçe, floresan tespitine dayalı herhangi bir yaklaşımın potansiyel tuzaklarından biridir. Ancak, protein aşırı ekspresyonu koşullarında oliomerizasyon çalışmaları fonksiyonel önemi hakkında endişeler yükseltmek. Geçici olarak transfected hücreler büyük olasılıkla değişken floresan düzeylerine (yani protein konsantrasyonu) sahip olacak ve n & B geniş bir yelpazede uygulanabilir, çünkü protein konsantrasyonu ortalama parlaklık bağımsızlığını test etmek için yararlıdır konsantrasyonları, dedektörün doğrusal tepkisi koşulu altında (bkz. parlaklık tanımı, eq. 1).

Başka bir kısıtlama canlı hücrelerde istikrarlı bir florofor kullanarak reseptörstokiyometrik etiketleme olduğunu. Halo etiketleri, floresan proteinler (FP) veya diğer kovalent floresan etiketleri hücredeki protein molekülü başına bağlı floroforların tam sayısını elde etmek için uygun etiketlerdir. N&B analizinin karmaşıklığını azaltmak için floresan proteinler veya 1'e 1 florofor-protein etiketlemesi sağlayan halo etiketleri kullanıyoruz. Seçilen FP olgun formda monomerik olmalıdır, ihmal edilebilir bir öz-dernek eğilimi olan, aksi takdirde, FP etiketli reseptörlerin yapay oligomerizasyon neden olabilir. Bu protokolde, (A207K)mEGFP kullanıyoruz çünkü bu tek nokta mutasyonu daha önce31,39,40olarak gösterildiği gibi mEGFP kendini toplama eğilimini ortadan kaldırır. Etiketleme stratejisine bakılmaksızın, floresan etiketli protein, seçilen hücre modelinde biyolojik aktivitenin tutulup tutulmalıdır, çünkü etiketlenmiş moleküllerin işlevselliği oligomerizasyon olaylarını bağlamak için gereklidir. reseptör sinyali. Modelimizde, reseptör ligand FGF231ile transfected hücreleri uyardıktan sonra floresan (A207K)mEGFP-FGFR1 otofosforilasyon kanıtladı.

N&B, aydınlatma hacmindeki moleküllerin difüzyonuna dayanır. Dijital kamera algılamasında, pozlama süresi (yani analog algılamadaki piksel çalışma süresi, tdolma)odak hacmindeki parçacıkların bir ve yalnızca bir konfigürasyonunun yakalanacak kadar kısa olması gerekir. Bu pozlama süresi sırasında ışıklı hacim giren veya çıkan bir florofor olasılığı çok küçük olduğunu söylemektir. Pozlama süresi florofor ikamet süresi(τD)bir florofor ışıklı hacimde harcadığı ortalama süre daha kısa olmalıdır. Bu nedenle, bir N & B deneybaşlamadan önce, ilk yaklaşık olarak, hücre altı lokalizasyon ve moleküler kütlebağlıdır hedef protein, ikamet süresi (veya difüzyon katsayısı) hakkında bazı fikir olması gereklidir. Kare hızı, kameranın bir görüntü elde etmesi ve ardından bu görüntüyü tamamen okuması için gereken sürenin tersidir ve genellikle, toplam piksel sayısından ve okuma hızından, pozlama süresiyle birlikte yaklaşık olarak hesaplanır. Kare hızı nın hızlı olması gerekmese de, kare hızının toplamı ve bir sonraki çerçevenin yakalanmasını hazırlama süresi olan çevrim süresi(tdöngüsü)çözümlemesi etkileyebilir. Bu kısıtlamalar genelolarak genellenebilir: tdöngüsü >> τD >> tdwell. Döngü süresi çok hızlıysa, moleküller bu süre içinde bir kareden diğerine kayda değer bir şekilde hareket etmez ve hareketsiz olarak görünür (B = 1). Ancak, analiz için yüzlerce kare gerektiğinden, büyük ekstra varyans ekleyecek hücre yer değiştirmelerini ve hücre zarının bozulmasını önlemek için bisiklete binme mümkün olduğunca hızlı ayarlanır (görüntü biçimini piksel sayısında artırma veya azaltma) serisi nin satın alınması sırasında. Bu protokol örneğinde, en yavaş çevrim süresi 22 ms'dir, böylece 11 s'de 500 kare elde edilebilir.

Moleküler parlaklık mutlak bir miktar değildir; Floroforun moleküler özelliklerine (kesit ve kuantum verimi), deneysel kuruluma (dedektör ve optik) ve lazer gücü gibi uyarma koşullarına bağlıdır. Böylece, TIRF-N & B yaklaşımı belirgin bir parlaklık verir ve bu nedenle tek bir oligomerik devlet ile bir referans yapı ifade eden bir "referans hücre modeli" kurmak için temel dir. Referans yapı çalışma altında protein aynı florofor etiketi taşır [burada, (A207K)mEGFP] ve aynı hücre altı bölmesi lokalize (burada, plazma membran). Bu çalışmada, aynı florofor30 ile etiketlenmiş hücre yüzey reseptörleri için güvenilir bir monomerik parlaklık standardı olarak defalarca gösterdiğimiz bir glikozilfosfatiflinositol (GPI) demirli-(A207K)mEGFP yapısı kullanıyoruz. 31. yıl.

Bir büyük dezavantajı çok büyük olasılıkla aynı hücre tekrar tekrar bir kinetik çalışma sırasında ışığa maruz kaldığında olur florofor fotobleaching oluşumudur, ve oligomerizasyon durumu bir küçümseme yol açar. Bunu önlemek için, parlaklık kinetiği her biri farklı bir zaman noktasında yakalanan farklı hücrelerin ortalama parlaklığı birleştirilerek elde edilir(Şekil 6). Bu bir Petri kabında her hücre kinetik farklı bir zaman noktası ve bir petri kabı bütün bir kinetik çalıştırmak temsil olduğunu söylemektir.

Oligomerizasyon dinamiği hızlı ve karmaşık olduğunda, kanonik olmayan bir ligand tarafından indüklenen FGFR1 oligomerizasyon, NCAM31, normalleştirilmiş ortalama parlaklık profili ve zaman değişken ve kararsız olabilir (Şekil 6B ). Böyle bir durumda, her seferinde yeni bir hücreye hareket etme ve odaklanma zorunluluğu nedeniyle, hücrelerin kopyalanamazlarını kesin zaman noktalarında okuyarak, bir yatırım getirisi seçin, zaman serisini yakalayın ve inceleyin/atın. Böylece, tekrarlanabilirlik kinetik profil benzerliği ve parlaklık değişiklikleri genliği açısından değerlendirilebilir.

Sonuçlaragenel bir bakış Şekil 7'de sunulmuştur. Dağılım çizimi, yalnızca aynı yemeğin hücrelerinde ölçülen ortalama parlaklığı gösterir ve her yakalamanın zamanını ihmal eder. Bu çizimde, tüm kinetik bilgiler ortadan kaldırılsa da, reseptörün oliomerizasyon durumu üzerinde iki ligandtarafından indüklenen büyük fark belirgin kalır. Ancak, her iki deney seti için de (FGF2- karşı NCAM kaynaklı oligomerizasyon), Şekil 7'deki her bir koşunun ortalama ± S.D.'sini belirleme geleneksel yaklaşımı, FGF2 tarafından uyarılan FGFR1 molekülleri açıkça anlaşıldığından yanıltıcı sonuçlara yol açacaktır. iki iyi tanımlanmış durumlara geçiş, NCAM iyi bir ortalama ± S.D. değeri ile temsil olmaz kararsız ve döngüsel oligomerik FGFR1 karışımları neden olur.

Özetle, deneysel bir bakış açısıyla, N&B sadece hızlı bir satın alma modülü ve özel bir yazılımla donatılmış bir mikroskoba erişim gerektirir. İlgi proteini çeşitli monomerik floresan proteinler veya organik florofororlarla etiketlenebilir, ancak nicel ölçümler yerine getirilmesi için çeşitli koşullar gerektirir: stokiyometrik etiketleme, referans parlaklık standardı, dedektör kalibrasyon ve hiçbir fotobeyazrlama. Bu bağlamda, N & B yaklaşımı canlı hücrelerde proteinlerin spatiotemporal oligomerizasyon deşifre etmek için güçlü bir araçtır. Ayrıca, istatistiksel ağırlık41'i çözmek için ham verilerin yeniden örneklemesi ve floresan çapraz korelasyon spektroskopisinin çapraz korelasyon N&B42 ile birleştirilmesindeki son gelişmeler, N'nin uygulanabilirliğini rafine etmekte ve geliştirilmektedir. &B protein oligomerizasyonu ve etkileşim çalışmalarına yaklaşım.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

CNIC, Ciencia Bakanlığı, Innovacion y Universidades ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenir ve Severo Ochoa Mükemmellik Merkezi 'dir (SEV-2015-0505). Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) "Una manera de hacer Europa" tarafından da destekliyoruz. UC Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Uluslararası Kanser Araştırma Derneği (şimdi Dünya Çapında Kanser Araştırma olarak da bilinir) ve İtalya Sağlık Bakanlığı desteğini kabul eder. A.T., 2011-2012'de PV Bursu "Progetto Professionalità Ivano Becchi" ile yaptığı çalışmaları kısmen desteklediği için "Fondazione Banca del Monte di Lombardia"yı kabul etti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
  2. Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
  3. Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
  4. Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
  5. Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
  6. Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
  7. Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
  8. Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
  9. Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
  10. Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
  11. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  12. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  13. Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
  14. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  15. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  16. Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
  17. Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
  18. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  19. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  20. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  21. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  22. Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
  23. Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
  24. Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
  25. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  26. Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
  27. Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
  28. Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
  29. Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
  30. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  31. Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
  32. Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
  33. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
  34. Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
  35. Joubert, J., Sharma, D. Light microscopy digital imaging. Current Protocols in Cytometry. , (2011).
  36. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
  37. Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
  38. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  39. Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
  40. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
  41. Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
  42. Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).

Tags

Biyoloji Sayı 153 Reseptör kümeleri N&B Sayı ve Parlaklık moment analizi protein oligomerleri hücre zarı TIRF mikroskobu
Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter