Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Moreno Zamai; Antonio Trullo; Elvira Arza; Ugo Cavallaro; Valeria  R. Caiolfa

doi:10.3791/60398

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Biology

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लिविंग सेल में सेल सरफेस रिसेप्टर्स की ओलिगोमेराइजेशन गतिशीलता संख्या और चमक विश्लेषण के साथ संयुक्त

Published: November 06, 2019

doi:

10.3791/60398

Moreno Zamai, Antonio Trullo, Elvira Arza, Ugo Cavallaro, Valeria R. Caiolfa²

¹Unit of Microscopy and Dynamic Imaging,Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, ²Centro di Imaging Sperimentale,Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, ³Unit of Gynecological Oncology Research,European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में लिगाण्ड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित मेडेगएफपी-टैग-रिसेप्टर ओलिगोमर के औसत ओलिगोमेरिक राज्य के निर्धारण के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है।

Abstract

रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापकता के बावजूद, क्लस्टरिंग घटनाओं का पता लगाने और क्लस्टरिंग की डिग्री को मापने के लिए कुछ तरीके लागू होते हैं। यहां, हम जीवित कोशिकाओं की झिल्ली में mEGFP-टैग-रिसेप्टर होमोकॉम्प्लेक्स की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति निर्धारित करने के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है। एन एंड बी फ्लोरेसेंस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) और फोटॉन काउंटिंग हिस्टोग्राम (पीसीएच) के समान एक विधि है, जो एक रोशनी में और बाहर फ्लोरोफोरस डिस्टरिंग की फ्लोरेसेंस तीव्रता के उतार-चढ़ाव के सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित है अवलोकन समय के दौरान मात्रा। विशेष रूप से, एन एंड बी ओलिगोमेरिक मिश्रण में प्रोटीन की औसत संख्या के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए पीसीएच का सरलीकरण है। तीव्रता में उतार-चढ़ाव आयाम फ्लोरोफोर की आणविक चमक और रोशनी की मात्रा के भीतर फ्लोरोफोरस की औसत संख्या द्वारा वर्णित हैं। इस प्रकार, एन एंड बी आयाम वितरण के केवल पहले और दूसरे क्षणों को मानता है, अर्थात्, मतलब तीव्रता और विचरण। यह एक ही समय में, शक्ति और विधि की कमजोरी है । क्योंकि केवल दो क्षणों पर विचार किया जाता है, एन एंड बी एक मिश्रण में अज्ञात ओलिगोमर्स के मोलर अंश का निर्धारण नहीं कर सकता है, लेकिन यह केवल मिश्रण की औसत अल्पाधिकारी स्थिति का अनुमान लगाता है। फिर भी, इसे पिक्सेल-बाय-पिक्सेल आधार पर लाइव कोशिकाओं की छवियों की अपेक्षाकृत छोटी समय श्रृंखला (अन्य क्षण विधियों की तुलना में) पर लागू किया जा सकता है, बस फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय के उतार-चढ़ाव की निगरानी करके। यह प्रभावी समय-प्रति-पिक्सेल को कुछ माइक्रोसेकंड तक कम कर देता है, जिससे सेकंड से मिलीसेकंड की समय सीमा में अधिग्रहण की अनुमति मिलती है, जो तेजी से ओलिगोमराइजेशन काइनेटिक्स के लिए आवश्यक है। अंत में, बड़े सेल क्षेत्रों के साथ-साथ उप-सेलुलर डिब्बों का पता लगाया जा सकता है।

Introduction

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर अणुओं की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति का निर्धारण करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस-नंबर और ब्राइटनेस (टीआईआरएफ-एन एंड बी) इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जिसका लक्ष्य रिसेप्टर असेंबली को जोड़ने के उद्देश्य से प्रोटीन के जैविक कार्य के लिए गतिशीलता(चित्रा 1)।

बाह्य शिकंद बाध्यकारी पर, रिसेप्टर्स उनकी संरचना, अल्पाधिकारी, संभावित सह-रिसेप्टर्स और झिल्ली संरचना के आधार पर इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन शुरू करते हैं। रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापी होने के बावजूद, सेलुलर सिग्नलिंग^1,^2,^3,^4,^5,⁶में एक महत्वपूर्ण घटना के रूप में मान्यता प्राप्त^है, ⁷, कुछ तरीकों क्लस्टरिंग घटनाओं का पता लगाने और क्लस्टरिंग की डिग्री उपाय प्रायोगिक⁸^,⁹कर सकते हैं . इमेज रेस्टोरेशन एल्गोरिदम¹⁰द्वारा अनुकूलन के बाद भी, कंफोकल वॉल्यूम (x, y, 300 एनएम, z, Z, 900 एनएम) को आणविक बातचीत और स्टोइचियोमेट्री साबित करने के लिए अपर्याप्त रूप से हल किया जाता है। प्रोटीन ओलिगोमर्स की उप-इकाई संरचना को पूरी तरह से स्थानिक आधार पर भी 20-70 एनएम जैसे पाम^11,स्टॉर्म¹²और एसटीईडी¹³के एक्स-रिज़ॉल्यूशन तरीकों से हल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, उनका लौकिक संकल्प (प्रति छवि मिनट के क्रम में) सेकंड की सीमा में गतिज का पालन नहीं कर सकता। एकल अणु स्टेप-ब्लीचिंग प्रोटीन ओलिगोमर्स की स्टोइचियोमेट्री को तभी हल करता है जब वे¹⁴को स्थिर हों ।

एकल छवियों के भीतर फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन के घनत्व और अल्पाधिकीकरण को मापने के लिए सबसे बहुमुखी तरीकों में से एक स्थानिक तीव्रता वितरण विश्लेषण (एसपीआईडीए) है, जो स्थानिक नमूने पर निर्भर करता है। यह रासायनिक रूप से निश्चित और लाइव कोशिकाओं दोनों पर लागू होता है, और मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी¹⁵का उपयोग करके एक साथ सेल के हित के कई क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरेसेंस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस)^16,फोटॉन गिनती हिस्टोग्राम (पीसीएच)^17,और संख्या और चमक (एन एंड बी)^18,^19,मात्रात्मक अल्पाधिकार के लिए उपयुक्त हैं माप. ये विधियां फ्लोरेसेंस तीव्रता के उतार-चढ़ाव का विश्लेषण करती हैं जिन्हें समय पर देखा जा सकता है जब फ्लोरोफोरस रोशनी की मात्रा में और बाहर फैलाते हैं। तीव्रता के उतार-चढ़ाव के आयामों को फ्लोरोफोर (ε) की आणविक चमक और रोशनी की मात्रा¹⁷ (चित्रा 2)के भीतर फ्लोरोफोर्स (एन) की औसत संख्या द्वारा विशिष्ट रूप से वर्णित किया जा सकता है। आमतौर पर, फ्लोरोफोरस का प्रसार गुणांक और रोशनी की मात्रा के भीतर अणुओं की औसत संख्या (जी (0) मूल्य से संबंधित) एफसीएस²⁰द्वारा प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, चूंकि प्रसार समय द्रव्यमान की घन जड़ के साथ केवल तराजू, एफसीएस आणविक द्रव्यमान²¹में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील नहीं है। व्यवहार में, एकल रंग एफसी झिल्ली रिसेप्टर्स के डामरीकरण का पता नहीं लगा सकता है। पीसीएच विभिन्न अल्पाधिकारों के मिश्रण को सही ढंग से हल करता है। आयाम वितरण के दो से अधिक क्षणों का उपयोग करना, यह विभिन्न चमक के अणुओं का पता लगाता है जो एक ही रोशनी की मात्रा पर कब्जा करते हैं। स्कैनिंग FCS²² और विकास, जैसे कि आणविक चमक (pCOMB) दृष्टिकोण²³के दिलचस्प जोड़ी सहसंबंध, जैविक प्रणालियों में फ्लोरेसेंस सहसंबंध विधियों की प्रयोज्यता की सीमा का विस्तार करने के लिए पेश किया²⁴, एक सेल के एक बड़े क्षेत्र में तेजी से माप की क्षमता की कमी एकल बिंदु तरीकों रहते हैं, सेकंड के क्रम में प्रत्येक पिक्सेल और डेटा अधिग्रहण पर लगातार कई टिप्पणियों की आवश्यकता होती है ।

एनएंडबी पीच का एक सरलीकृत संस्करण है जो फ्लोरेसेंस वितरण के आयाम के केवल पहले और दूसरे क्षणों को मानता है, अर्थात् मतलब तीव्रता, & आईएंडजीटी, और विचरण,² (चित्रा 2)^18,¹⁹और, इस वजह से, यह मिश्रण में अज्ञात ओलिगोमर्स के मोलर अंश का निर्धारण नहीं कर सकता है, लेकिन केवल मिश्रण की औसत अल्पाधिकारी स्थिति का अनुमान लगाता है। फिर भी, एन एंड बी को पिक्सेल-बाय-पिक्सल आधार पर पीसीएच की तुलना में लाइव कोशिकाओं की छवियों की अपेक्षाकृत छोटी समय श्रृंखला के साथ काम करने का लाभ है, बस फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय उतार-चढ़ाव की निगरानी करके। क्योंकि एन एंड बी कुछ माइक्रोसेकंड के लिए समय प्रति पिक्सेल को कम कर देता है, यह बड़े सेल क्षेत्रों में तेजी से ओलिगोमराइजेशन काइनेटिक्स का पालन कर सकता है, जिससे रस्टर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (जैसे, कॉन्फोकल, 2-फोटॉन) और मिलीसेकंड में सेकंड के समय पैमाने पर छवि अधिग्रहण की अनुमति मिलती है कैमरा आधारित माइक्रोस्कोपी (जैसे, TIRFM) में ।

कई रिपोर्टों ने विस्तारित सेल क्षेत्रों की इमेजिंग करके प्रोटीन समूहों में उपइकाइयों की संख्या निर्धारित करने के लिए एन एंड बी की क्षमता का प्रदर्शन किया है। चो-के1 कोशिकाओं²⁵में आसंजन स्थलों पर पैक्सलिन-ईजीएफपी समूहों का पता चला और कॉस-7 कोशिकाओं²⁶में रोगजनक एचटीटेक्स1पी पेप्टाइड के इंट्रासेलर एकत्रीकरण का वर्णन किया गया । एन एंड बी को एर्बब रिसेप्टर²⁷के लिगांड-संचालित ओलिगोमराइजेशन का पालन करने और क्लोथोब (केएलबी) पर लिगांड एफजीएफ21 और वाला कोशिकाओं में एफजीएफआर1सी के प्रभाव के लिए आवेदन किया गया था^28। टीआईआरएफ इमेजिंग और एन एंड बी विश्लेषण के संयोजन का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि डायनामिन-2 मुख्य रूप से पूरे सेल झिल्ली²⁹में टेट्रामिक है। हमने यूपीएआर और एफजीएफआर1 सेल झिल्ली रिसेप्टर्स^30,³¹के लिगांड-ड्रिवेन डिमराइजेशन को साबित करने के लिए रस्टर स्कैनिंग और टीआईआरएफ दोनों छवियों के लिए एन एंड बी को लागू किया।

फ्लोरेसेंस सहसंबंध विधियां, जैसे एन एंड बी, एफसीएस और पीसीएच, इस धारणा पर आधारित हैं कि खुली मात्रा में कणों की व्यवसाय संख्या पॉइसन वितरण का अनुसरण करती है। क्योंकि केवल फोटॉन है कि फ्लोरोफोरस उत्सर्जन का पता लगाया जा सकता है, छवि के एक पिक्सेल में समय बनाम एक मापा फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए मतलब मूल्य, रोशनी की मात्रा, एन, और उनके में फ्लोरोफोर्स की औसत संख्या का उत्पाद है आणविक चमक, ε^17:

जहां ε को प्रति अणु प्रति इकाई (पारंपरिक रूप से प्रति सेकंड) उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है जब अणु रोशनी की मात्रा के केंद्र में होता है।

चमक एक दिए गए अधिग्रहण में प्रत्येक फ्लोरोफोर की एक संपत्ति है, जबकि तीव्रता सभी फ्लोरोफोरस से सभी योगदान का योग है। जैविक प्रतियोगिताओं में, फ्लोरोफोरस की संख्या में वृद्धि के साथ चमक बढ़ेगी जो एक साथ उतार-चढ़ाव करते हैं, फ्लोरोसेंटी-टैग प्रोटीन की अल्पाधिकार की स्थिति के बारे में जानकारी देते हैं। दिए गए पिक्सेल पर उतार-चढ़ाव आयाम को फ्लोरेसेंस सिग्नल के विचरण से मापा जाता है,^2:

जहां तीव्रता के वर्ग का मतलब, और तीव्रता के मतलब का वर्ग, प्रत्येक फ्रेम के प्रत्येक पिक्सेल में व्यक्तिगत तीव्रता मूल्यों से गणना की जाती है:

जहां कश्मीर समय श्रृंखला में कुल फ्रेम की संख्या है । प्रायोगिक रूप से, पूरी छवि श्रृंखला के लिए विचरण की गणना करना आवश्यक है जो औसत तीव्रता मूल्य के चारों ओर एक ही छवि के प्रत्येक पिक्सेल पर व्यक्तिगत तीव्रता मूल्यों के बिखराव का वर्णन करता है। विचरण में विभिन्न मूल के सभी उतार-चढ़ाव शामिल हैं। पहले सन्निकटन में, रोशनी की मात्रा में विसारित कणों के कारण विचरण,²_0,डिटेक्टर शॉट शोर के कारण विचरण से अलग किया जा सकता है,²_डी। दो विचरण स्वतंत्र हैं; इस प्रकार, कुल भिन्नता उनकी राशि से दी जाती है:

विचरण, में और पता लगाने की मात्रा के बाहर आणविक उतार चढ़ाव के कारण, आणविक चमक और तीव्रता पर निर्भर है:

ईक्यू के अनुसार ईक्यू 6 पुनर्व्यवस्थित करना 1:

फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी में विशिष्ट अवधारणा के अनुसार, समीकरण 7 में कहा गया है कि उतार-चढ़ाव की संख्या के कारण भिन्नता कण चमक के वर्ग पर निर्भर करती है।

फिर, डिटेक्टर उतार-चढ़ाव के कारण विचरण पता लगाया तीव्रता का एक रैखिक कार्य है, इस धारणा के तहत कि डिटेक्टर अपनी संतृप्ति सीमा¹⁹से नीचे संचालित है:

फोटॉन गिनती डिटेक्टरों के मामले में एक=1 और सी= 0, इस प्रकार डिटेक्टर विचरण औसत तीव्रता के बराबर है:

लाइव कोशिकाओं में वास्तविक माप के लिए इन अवधारणाओं को लागू करने के लिए, Gratton और सहयोगियों¹⁸ औसत तीव्रता पर विचरण के अनुपात के रूप में प्रत्येक पिक्सेल के लिए स्पष्ट चमक, बी को परिभाषित:

बी पैरामीटर है जिसे प्रायोगिक रूप से मापा जाता है। इस काम में, हेला कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली पर FGFR1 रिसेप्टर्स की समय श्रृंखला छवियों को टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा कैप्चर किया जाता है और औसत स्पष्ट चमक, बी, एन एंड बी विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है। फिर, FGF2 के अलावा के बाद, लगातार समय श्रृंखला विहित लिगांड के साथ रिसेप्टर की उत्तेजना के बाद झिल्ली सतह में रिसेप्टर अणुओं के आत्म-असेंबली में परिवर्तन का पालन करने के लिए कब्जा कर लिया जाता है।

हालांकि, चूंकि टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप का डिटेक्टर एक EMCCD कैमरा है, इसलिए स्पष्ट चमक के लिए अभिव्यक्ति को¹⁹के रूप में संशोधित करने की आवश्यकता है:

जहां ऑफसेट का पता लगाने इलेक्ट्रॉनिक्स की तीव्रता ऑफसेट है कि डिटेक्टर सेटिंग्स की एक विशेषता है । एनालॉग डिटेक्टर के लिए विचरण और औसत तीव्रता क्रमशः द्वारा दी जाती है:

जहां जी डिजिटल स्तर (डीएल/फोटॉन) में एनालॉग लाभ है, एस,प्रति फोटॉन¹⁹डिजिटल स्तर, लगातार तीव्रता (कोई लौकिक उतार चढ़ाव) के साथ एक प्रकाश स्रोत के लिए एक तीव्रता बनाम विचरण भूखंड की ढलान द्वारा दिया जाता है । यह फैक्टर पिक्सल डिटेक्शन वॉल्यूम के शेप से संबंधित है। हस्लर एट अल³²के अनुसार, यह कारक¹⁹का पता लगाने वाले कैमरे के अधिकतम लाभ पर काम करने वाले TIRF इमेजिंग के लिए 0.3 के बराबर है। ऑफसेट, एस और जी पैरामीटर कैमरे और माइक्रोस्कोप की विशेषताएं हैं। स्पष्ट चमक, बी, eq. 11 eq. 12 और 13 के अनुसार उलटफेर द्वारा प्राप्त किया जाता है:

प्रायोगिक रूप से, ε लेजर तीव्रता और प्रणाली की पहचान दक्षता का एक जटिल कार्य है। फिर भी, चूंकि बी/एस ε पर निर्भर है, इसलिए दिए गए डिटेक्शन मोड के लिए ε के सापेक्ष मूल्य का निर्धारण करना केवल महत्वपूर्ण है:

जहां ε ‘ ε के आनुपातिक है । फिर भी, आंतरिक संदर्भ का उपयोग करके एक अंशांकन किया जाता है।

Protocol

1. नमूना तैयारी 1 दिन। ग्लास-बॉटम व्यंजनों में 100,000-200,000 सेल/mL की एकाग्रता पर पूर्ण माध्यम में बीज वाला कोशिकाएं। बीज 6-8 व्यंजन दोहराने।नोट: इस उदाहरण में, माध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय स?…

Representative Results

एक ही संस्कृति पकवान में वरीयता प्राप्त दो प्रतिनिधि HeLa-mEGFP-FGFR1 कोशिकाओं के लिए परिणाम चित्रा 5 और पूरक तालिका 1में दिखाए गए हैं । एफजीएफ2 लिगामेंट के अलावा दोनों कोशिकाओं को स…

Discussion

एनएंडबी को सेल मॉडल और लेबलिंग रणनीति के चुनाव में कई सावधानियों की आवश्यकता होती है। इसे केवल जीवित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है जो छवि कैप्चर समय के दौरान स्थिर रूप से पालन करते रहते हैं। पूरे सेल…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

सीएनआईसी को सीआईएनसिया, इनोवेटियन वाई यूनीवर्सिडीज और प्रो सीएनआईसी फाउंडेशन मंत्रालय द्वारा समर्थित किया जाता है, और यह एक सेवेरो ओचोआ सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (सेव-2015-0505) है। हमें यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (फेडर) “ऊना मनारा डी हैसर यूरोपा” द्वारा भी समर्थन दिया जाता है। यूसी Associazione इटालियन Ricerca सुल Cancro, अंतरराष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान के लिए एसोसिएशन (अब दुनिया भर में कैंसर अनुसंधान के रूप में जाना जाता है), और इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय से समर्थन स्वीकार करते हैं । एटी ने पीवी फेलोशिप “प्रोगेटो प्रोफेशनलिटा इवानो बेची” 2011-2012 के साथ अपने काम का आंशिक रूप से समर्थन करने के लिए “फोंडाज़िओन बैंका डेल मोंटे डि लोम्बार्डिया” को स्वीकार किया।

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).