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Biology

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लिविंग सेल में सेल सरफेस रिसेप्टर्स की ओलिगोमेराइजेशन गतिशीलता संख्या और चमक विश्लेषण के साथ संयुक्त

Published: November 6, 2019 doi: 10.3791/60398
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1,2
1Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain, 2Centro di Imaging Sperimentale, Ospedale San Raffaele, Milan, Italy, 3Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy

Summary

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में लिगाण्ड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित मेडेगएफपी-टैग-रिसेप्टर ओलिगोमर के औसत ओलिगोमेरिक राज्य के निर्धारण के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है।

Abstract

रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापकता के बावजूद, क्लस्टरिंग घटनाओं का पता लगाने और क्लस्टरिंग की डिग्री को मापने के लिए कुछ तरीके लागू होते हैं। यहां, हम जीवित कोशिकाओं की झिल्ली में mEGFP-टैग-रिसेप्टर होमोकॉम्प्लेक्स की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति निर्धारित करने के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है। एन एंड बी फ्लोरेसेंस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) और फोटॉन काउंटिंग हिस्टोग्राम (पीसीएच) के समान एक विधि है, जो एक रोशनी में और बाहर फ्लोरोफोरस डिस्टरिंग की फ्लोरेसेंस तीव्रता के उतार-चढ़ाव के सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित है अवलोकन समय के दौरान मात्रा। विशेष रूप से, एन एंड बी ओलिगोमेरिक मिश्रण में प्रोटीन की औसत संख्या के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए पीसीएच का सरलीकरण है। तीव्रता में उतार-चढ़ाव आयाम फ्लोरोफोर की आणविक चमक और रोशनी की मात्रा के भीतर फ्लोरोफोरस की औसत संख्या द्वारा वर्णित हैं। इस प्रकार, एन एंड बी आयाम वितरण के केवल पहले और दूसरे क्षणों को मानता है, अर्थात्, मतलब तीव्रता और विचरण। यह एक ही समय में, शक्ति और विधि की कमजोरी है । क्योंकि केवल दो क्षणों पर विचार किया जाता है, एन एंड बी एक मिश्रण में अज्ञात ओलिगोमर्स के मोलर अंश का निर्धारण नहीं कर सकता है, लेकिन यह केवल मिश्रण की औसत अल्पाधिकारी स्थिति का अनुमान लगाता है। फिर भी, इसे पिक्सेल-बाय-पिक्सेल आधार पर लाइव कोशिकाओं की छवियों की अपेक्षाकृत छोटी समय श्रृंखला (अन्य क्षण विधियों की तुलना में) पर लागू किया जा सकता है, बस फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय के उतार-चढ़ाव की निगरानी करके। यह प्रभावी समय-प्रति-पिक्सेल को कुछ माइक्रोसेकंड तक कम कर देता है, जिससे सेकंड से मिलीसेकंड की समय सीमा में अधिग्रहण की अनुमति मिलती है, जो तेजी से ओलिगोमराइजेशन काइनेटिक्स के लिए आवश्यक है। अंत में, बड़े सेल क्षेत्रों के साथ-साथ उप-सेलुलर डिब्बों का पता लगाया जा सकता है।

Introduction

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर अणुओं की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति का निर्धारण करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस-नंबर और ब्राइटनेस (टीआईआरएफ-एन एंड बी) इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जिसका लक्ष्य रिसेप्टर असेंबली को जोड़ने के उद्देश्य से प्रोटीन के जैविक कार्य के लिए गतिशीलता(चित्रा 1)।

बाह्य शिकंद बाध्यकारी पर, रिसेप्टर्स उनकी संरचना, अल्पाधिकारी, संभावित सह-रिसेप्टर्स और झिल्ली संरचना के आधार पर इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन शुरू करते हैं। रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापी होने के बावजूद, सेलुलर सिग्नलिंग1,2,3,4,5,6में एक महत्वपूर्ण घटना के रूप में मान्यता प्राप्तहै, 7, कुछ तरीकों क्लस्टरिंग घटनाओं का पता लगाने और क्लस्टरिंग की डिग्री उपाय प्रायोगिक8,9कर सकते हैं . इमेज रेस्टोरेशन एल्गोरिदम10द्वारा अनुकूलन के बाद भी, कंफोकल वॉल्यूम (x, y, 300 एनएम, z, Z, 900 एनएम) को आणविक बातचीत और स्टोइचियोमेट्री साबित करने के लिए अपर्याप्त रूप से हल किया जाता है। प्रोटीन ओलिगोमर्स की उप-इकाई संरचना को पूरी तरह से स्थानिक आधार पर भी 20-70 एनएम जैसे पाम11,स्टॉर्म12और एसटीईडी13के एक्स-रिज़ॉल्यूशन तरीकों से हल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, उनका लौकिक संकल्प (प्रति छवि मिनट के क्रम में) सेकंड की सीमा में गतिज का पालन नहीं कर सकता। एकल अणु स्टेप-ब्लीचिंग प्रोटीन ओलिगोमर्स की स्टोइचियोमेट्री को तभी हल करता है जब वे14को स्थिर हों ।

एकल छवियों के भीतर फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन के घनत्व और अल्पाधिकीकरण को मापने के लिए सबसे बहुमुखी तरीकों में से एक स्थानिक तीव्रता वितरण विश्लेषण (एसपीआईडीए) है, जो स्थानिक नमूने पर निर्भर करता है। यह रासायनिक रूप से निश्चित और लाइव कोशिकाओं दोनों पर लागू होता है, और मानक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी15का उपयोग करके एक साथ सेल के हित के कई क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरेसेंस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस)16,फोटॉन गिनती हिस्टोग्राम (पीसीएच)17,और संख्या और चमक (एन एंड बी)18,19,मात्रात्मक अल्पाधिकार के लिए उपयुक्त हैं माप. ये विधियां फ्लोरेसेंस तीव्रता के उतार-चढ़ाव का विश्लेषण करती हैं जिन्हें समय पर देखा जा सकता है जब फ्लोरोफोरस रोशनी की मात्रा में और बाहर फैलाते हैं। तीव्रता के उतार-चढ़ाव के आयामों को फ्लोरोफोर (ε) की आणविक चमक और रोशनी की मात्रा17 (चित्रा 2)के भीतर फ्लोरोफोर्स (एन) की औसत संख्या द्वारा विशिष्ट रूप से वर्णित किया जा सकता है। आमतौर पर, फ्लोरोफोरस का प्रसार गुणांक और रोशनी की मात्रा के भीतर अणुओं की औसत संख्या (जी (0) मूल्य से संबंधित) एफसीएस20द्वारा प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, चूंकि प्रसार समय द्रव्यमान की घन जड़ के साथ केवल तराजू, एफसीएस आणविक द्रव्यमान21में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील नहीं है। व्यवहार में, एकल रंग एफसी झिल्ली रिसेप्टर्स के डामरीकरण का पता नहीं लगा सकता है। पीसीएच विभिन्न अल्पाधिकारों के मिश्रण को सही ढंग से हल करता है। आयाम वितरण के दो से अधिक क्षणों का उपयोग करना, यह विभिन्न चमक के अणुओं का पता लगाता है जो एक ही रोशनी की मात्रा पर कब्जा करते हैं। स्कैनिंग FCS22 और विकास, जैसे कि आणविक चमक (pCOMB) दृष्टिकोण23के दिलचस्प जोड़ी सहसंबंध, जैविक प्रणालियों में फ्लोरेसेंस सहसंबंध विधियों की प्रयोज्यता की सीमा का विस्तार करने के लिए पेश किया24 , एक सेल के एक बड़े क्षेत्र में तेजी से माप की क्षमता की कमी एकल बिंदु तरीकों रहते हैं, सेकंड के क्रम में प्रत्येक पिक्सेल और डेटा अधिग्रहण पर लगातार कई टिप्पणियों की आवश्यकता होती है ।

एनएंडबी पीच का एक सरलीकृत संस्करण है जो फ्लोरेसेंस वितरण के आयाम के केवल पहले और दूसरे क्षणों को मानता है, अर्थात् मतलब तीव्रता, & आईएंडजीटी, और विचरण,2 (चित्रा 2)18,19 और, इस वजह से, यह मिश्रण में अज्ञात ओलिगोमर्स के मोलर अंश का निर्धारण नहीं कर सकता है, लेकिन केवल मिश्रण की औसत अल्पाधिकारी स्थिति का अनुमान लगाता है। फिर भी, एन एंड बी को पिक्सेल-बाय-पिक्सल आधार पर पीसीएच की तुलना में लाइव कोशिकाओं की छवियों की अपेक्षाकृत छोटी समय श्रृंखला के साथ काम करने का लाभ है, बस फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय उतार-चढ़ाव की निगरानी करके। क्योंकि एन एंड बी कुछ माइक्रोसेकंड के लिए समय प्रति पिक्सेल को कम कर देता है, यह बड़े सेल क्षेत्रों में तेजी से ओलिगोमराइजेशन काइनेटिक्स का पालन कर सकता है, जिससे रस्टर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (जैसे, कॉन्फोकल, 2-फोटॉन) और मिलीसेकंड में सेकंड के समय पैमाने पर छवि अधिग्रहण की अनुमति मिलती है कैमरा आधारित माइक्रोस्कोपी (जैसे, TIRFM) में ।

कई रिपोर्टों ने विस्तारित सेल क्षेत्रों की इमेजिंग करके प्रोटीन समूहों में उपइकाइयों की संख्या निर्धारित करने के लिए एन एंड बी की क्षमता का प्रदर्शन किया है। चो-के1 कोशिकाओं25में आसंजन स्थलों पर पैक्सलिन-ईजीएफपी समूहों का पता चला और कॉस-7 कोशिकाओं26में रोगजनक एचटीटेक्स1पी पेप्टाइड के इंट्रासेलर एकत्रीकरण का वर्णन किया गया । एन एंड बी को एर्बब रिसेप्टर27के लिगांड-संचालित ओलिगोमराइजेशन का पालन करने और क्लोथोब (केएलबी) पर लिगांड एफजीएफ21 और वाला कोशिकाओं में एफजीएफआर1सी के प्रभाव के लिए आवेदन किया गया था28। टीआईआरएफ इमेजिंग और एन एंड बी विश्लेषण के संयोजन का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि डायनामिन-2 मुख्य रूप से पूरे सेल झिल्ली29में टेट्रामिक है। हमने यूपीएआर और एफजीएफआर1 सेल झिल्ली रिसेप्टर्स30,31के लिगांड-ड्रिवेन डिमराइजेशन को साबित करने के लिए रस्टर स्कैनिंग और टीआईआरएफ दोनों छवियों के लिए एन एंड बी को लागू किया।

फ्लोरेसेंस सहसंबंध विधियां, जैसे एन एंड बी, एफसीएस और पीसीएच, इस धारणा पर आधारित हैं कि खुली मात्रा में कणों की व्यवसाय संख्या पॉइसन वितरण का अनुसरण करती है। क्योंकि केवल फोटॉन है कि फ्लोरोफोरस उत्सर्जन का पता लगाया जा सकता है, छवि के एक पिक्सेल में समय बनाम एक मापा फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए मतलब मूल्य, रोशनी की मात्रा, एन, और उनके में फ्लोरोफोर्स की औसत संख्या का उत्पाद है आणविक चमक, ε17:

जहां ε को प्रति अणु प्रति इकाई (पारंपरिक रूप से प्रति सेकंड) उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है जब अणु रोशनी की मात्रा के केंद्र में होता है।

चमक एक दिए गए अधिग्रहण में प्रत्येक फ्लोरोफोर की एक संपत्ति है, जबकि तीव्रता सभी फ्लोरोफोरस से सभी योगदान का योग है। जैविक प्रतियोगिताओं में, फ्लोरोफोरस की संख्या में वृद्धि के साथ चमक बढ़ेगी जो एक साथ उतार-चढ़ाव करते हैं, फ्लोरोसेंटी-टैग प्रोटीन की अल्पाधिकार की स्थिति के बारे में जानकारी देते हैं। दिए गए पिक्सेल पर उतार-चढ़ाव आयाम को फ्लोरेसेंस सिग्नल के विचरण से मापा जाता है,2:

जहां तीव्रता के वर्ग का मतलब, और तीव्रता के मतलब का वर्ग, प्रत्येक फ्रेम के प्रत्येक पिक्सेल में व्यक्तिगत तीव्रता मूल्यों से गणना की जाती है:

जहां कश्मीर समय श्रृंखला में कुल फ्रेम की संख्या है । प्रायोगिक रूप से, पूरी छवि श्रृंखला के लिए विचरण की गणना करना आवश्यक है जो औसत तीव्रता मूल्य के चारों ओर एक ही छवि के प्रत्येक पिक्सेल पर व्यक्तिगत तीव्रता मूल्यों के बिखराव का वर्णन करता है। विचरण में विभिन्न मूल के सभी उतार-चढ़ाव शामिल हैं। पहले सन्निकटन में, रोशनी की मात्रा में विसारित कणों के कारण विचरण,20,डिटेक्टर शॉट शोर के कारण विचरण से अलग किया जा सकता है,2डी। दो विचरण स्वतंत्र हैं; इस प्रकार, कुल भिन्नता उनकी राशि से दी जाती है:

विचरण, में और पता लगाने की मात्रा के बाहर आणविक उतार चढ़ाव के कारण, आणविक चमक और तीव्रता पर निर्भर है:

ईक्यू के अनुसार ईक्यू 6 पुनर्व्यवस्थित करना 1:

फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी में विशिष्ट अवधारणा के अनुसार, समीकरण 7 में कहा गया है कि उतार-चढ़ाव की संख्या के कारण भिन्नता कण चमक के वर्ग पर निर्भर करती है।

फिर, डिटेक्टर उतार-चढ़ाव के कारण विचरण पता लगाया तीव्रता का एक रैखिक कार्य है, इस धारणा के तहत कि डिटेक्टर अपनी संतृप्ति सीमा19से नीचे संचालित है:

फोटॉन गिनती डिटेक्टरों के मामले में एक=1 और सी= 0, इस प्रकार डिटेक्टर विचरण औसत तीव्रता के बराबर है:

लाइव कोशिकाओं में वास्तविक माप के लिए इन अवधारणाओं को लागू करने के लिए, Gratton और सहयोगियों18 औसत तीव्रता पर विचरण के अनुपात के रूप में प्रत्येक पिक्सेल के लिए स्पष्ट चमक, बी को परिभाषित:

बी पैरामीटर है जिसे प्रायोगिक रूप से मापा जाता है। इस काम में, हेला कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली पर FGFR1 रिसेप्टर्स की समय श्रृंखला छवियों को टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा कैप्चर किया जाता है और औसत स्पष्ट चमक, बी, एन एंड बी विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है। फिर, FGF2 के अलावा के बाद, लगातार समय श्रृंखला विहित लिगांड के साथ रिसेप्टर की उत्तेजना के बाद झिल्ली सतह में रिसेप्टर अणुओं के आत्म-असेंबली में परिवर्तन का पालन करने के लिए कब्जा कर लिया जाता है।

हालांकि, चूंकि टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप का डिटेक्टर एक EMCCD कैमरा है, इसलिए स्पष्ट चमक के लिए अभिव्यक्ति को19के रूप में संशोधित करने की आवश्यकता है:

जहां ऑफसेट का पता लगाने इलेक्ट्रॉनिक्स की तीव्रता ऑफसेट है कि डिटेक्टर सेटिंग्स की एक विशेषता है । एनालॉग डिटेक्टर के लिए विचरण और औसत तीव्रता क्रमशः द्वारा दी जाती है:

जहां जी डिजिटल स्तर (डीएल/फोटॉन) में एनालॉग लाभ है, एस,प्रति फोटॉन19डिजिटल स्तर, लगातार तीव्रता (कोई लौकिक उतार चढ़ाव) के साथ एक प्रकाश स्रोत के लिए एक तीव्रता बनाम विचरण भूखंड की ढलान द्वारा दिया जाता है । यह फैक्टर पिक्सल डिटेक्शन वॉल्यूम के शेप से संबंधित है। हस्लर एट अल32के अनुसार, यह कारक19का पता लगाने वाले कैमरे के अधिकतम लाभ पर काम करने वाले TIRF इमेजिंग के लिए 0.3 के बराबर है। ऑफसेट, एस और जी पैरामीटर कैमरे और माइक्रोस्कोप की विशेषताएं हैं। स्पष्ट चमक, बी, eq. 11 eq. 12 और 13 के अनुसार उलटफेर द्वारा प्राप्त किया जाता है:

प्रायोगिक रूप से, ε लेजर तीव्रता और प्रणाली की पहचान दक्षता का एक जटिल कार्य है। फिर भी, चूंकि बी/एस ε पर निर्भर है, इसलिए दिए गए डिटेक्शन मोड के लिए ε के सापेक्ष मूल्य का निर्धारण करना केवल महत्वपूर्ण है:

जहां ε ' ε के आनुपातिक है । फिर भी, आंतरिक संदर्भ का उपयोग करके एक अंशांकन किया जाता है।

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Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. 1 दिन। ग्लास-बॉटम व्यंजनों में 100,000-200,000 सेल/mL की एकाग्रता पर पूर्ण माध्यम में बीज वाला कोशिकाएं। बीज 6-8 व्यंजन दोहराने।
    नोट: इस उदाहरण में, माध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1 mM सोडियम पायरुवेट, १०० U/100 μg पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है । कई दोहराने व्यंजन तैयार कर रहे हैं।
  2. दिन 2-3। जब कोशिकाएं उप-प्रवाह पर होती हैं, तो सीरम-मुक्त माध्यम में प्रोटीन प्लाज्मिड के साथ व्यंजनों का आधा और संदर्भ प्लाज्मिड (मोनोमर और डामर) के साथ दूसरी छमाही में ट्रांसफेट करें।
    नोट: ट्रांसफेक्शन सीरम मुक्त माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक, 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और 25 mM HEPES बफर, फेनोल लाल के बिना किया जाता है।
  3. दिन 3-4। जांच करें कि ट्रांससंक्रमित कोशिकाएं व्यंजनों के नीचे के अनुयायी हैं और कोशिका झिल्ली फ्लोरोसेंट है। ऊंचा हो गया कोशिकाओं के साथ या बहुत कम फ्लोरेसेंस के साथ व्यंजन त्यागें।
    नोट: कोशिकाओं को अधिक बढ़ने न दें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से वितरित किया जाना चाहिए और पकवान के ग्लास क्षेत्र का पालन किया जाना चाहिए(चित्रा 1ए)। सेल आसंजन के पक्ष में प्रीकोटेड ग्लास बॉटम व्यंजनों का उपयोग किया जा सकता है। सेल संस्कृति किसी भी प्रयोग से पहले mycoplasma संदूषण के लिए परीक्षण किया जाता है। इस उदाहरण में, कोशिकाओं को मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीपीआई-(A207K) mEGFP और एक जीपीआई-(A207K) mEGFP plasmids से ट्रांसकिया जाता है। लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए, एक संकेतक मुक्त माध्यम की सिफारिश की जाती है; इमेजिंग के दौरान पीएच परिवर्तन को रोकने के लिए 25 mM HEPES बफर जोड़ा जाता है।

2. TIRF इमेजिंग - लेजर लाइन का संरेखण और टीआईआरएफ रोशनी का अनुकूलन

  1. प्रयोग से चार घंटे पहले माइक्रोस्कोप के तापमान इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय करें।
  2. माइक्रोस्कोप, कंप्यूटर और कैमरों को चालू करें और कैमरों के उचित कामकाजी तापमान तक पहुंचने का इंतजार करें।
    नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए कैमरे का कामकाजी तापमान -75 डिग्री सेल्सियस है।
  3. उद्देश्य पर तेल की थोड़ी बूंद रखें। जगह में एक नमूना पकवान रखो। इनक्यूबेटर के दरवाजे बंद करें और डिश के तापमान को समान (~ 10 न्यूनतम) दें।
  4. एपिफ्लोरेसेंस लैंप और 488 एनएम लेजर चालू करें।
  5. नमूना का पता लगाने के लिए एपिफ्लोरेसेंस कंट्रास्ट मोड का चयन करें, नेत्र से ध्यान केंद्रित करने के लिए एक सेल खोज।
    नोट: कोशिकाओं को खोजने के लिए फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग नेत्र की गर्त अनिवार्य नहीं है। इसके बजाय एक उपयुक्त लेजर लाइन का उपयोग किया जा सकता है।
  6. माइक्रोस्कोप कैमरा (बैंड पास पूर्व 490/20 (५००) बैंड पास Em 525/50, या इसी तरह के माध्यम से हरे उत्सर्जन को इकट्ठा करने के लिए उचित फिल्टर का चयन करें ।
  7. ऑक्यूलर से कैमरा पोर्ट (कैमरा #1 इन फिगर 1)को एपिफ्लोरेसेंस मोड में स्विच करें, फोकस को परिष्कृत करें और टीआईआरएफ मोड में बदलें। एपिफ्लोरेसेंस और टीआईआरएफ मोड को माइक्रोस्कोप के ब्रांड के आधार पर एक अलग नामकरण के साथ नामित किया जा सकता है।
    नोट: यदि कवरस्लिप इंटरफेस पर फ्लोरोसेंट मार्कर नहीं हैं तो लेजर को ध्यान केंद्रित करने या संरेखित करने वाले मुद्दे हो सकते हैं। लेजर को ठीक से संरेखित करने के लिए (अच्छे टीआईआरएफ के लिए आवश्यक), कवरस्लिप पर ध्यान केंद्रित करें। यह निर्धारित करना अक्सर बहुत मुश्किल होता है कि कवरस्लिप फोकस में है या नहीं। एक सुझाव के रूप में, कोशिकाओं के किनारों पर ध्यान केंद्रित करें।
  8. टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के निर्देशों का पालन करते हुए ऑटो-अलाइनमेंट को सक्रिय करें।
    नोट: संक्षेप में, 2.4 से 2.8 तक के चरणों के लिए, पहले नेत्र के माध्यम से कोशिकाओं को ढूंढें और उन पर ध्यान केंद्रित करें, फिर टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के कैमरा पोर्ट पर उत्सर्जन भेजें, माइक्रोस्कोप कंप्यूटर स्क्रीन पर कोशिकाओं को फिर से केंद्रित करें और लेजर संरेखण के लिए प्रक्रिया को सक्रिय करें। संरेखण में महत्वपूर्ण कोण खोजने में होता है जिस पर रोशनी इवेनसेंट हो जाती है(चित्रा 3)। वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप में थोड़ा अलग संरेखण प्रोटोकॉल हो सकता है और पूरी तरह से स्वचालित भी हो सकता है; दूसरों को महत्वपूर्ण कोण शर्तों के दृश्य की सुविधा के लिए एक छोटा सा कैमरा हो सकता है ।
  9. एक उपयुक्त रोशनी गहराई चुनें और इवेनसेंट फील्ड(चित्रा 3)की दिशा को अनुकूलित करें।
    नोट: प्रवेश गहराई सभी नियंत्रण और नमूनों के लिए स्थिर रखा जाता है।

3. TIRF इमेजिंग: समय श्रृंखला का कब्जा

  1. कम से कम 256 x 256 पिक्सल के ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करें।
    नोट: इस सेट अप में, कैप्चर सॉफ्टवेयर के तहत कैमरा #2 के साथ किया जाता है जो सीधे कैमरे को नियंत्रित करता है (चित्रा 1 लीजेंड देखें)।
  2. 1 एमएस और ईएम लाभ के लिए जोखिम सेट 1,000 (यह eq. 12 और 13 में जी कारक है) । ऐसी गति से, लेजर पावर को समायोजित या बढ़ाना आवश्यक हो सकता है। यहां लेजर पावर 0.5 मीटर है।
    नोट: कैमरे के प्रकार और प्रोटीन, फ्लोरेसेंस तीव्रता और पृष्ठभूमि के प्रसार गुणांक द्वारा लगाई गई सीमाओं के आधार पर, लेजर पावर स्थापित करने के लिए सामान्य मानदंड डिटेक्टर को संतृप्त करने, फोटोब्लीचिंग को कम करने और कैप्चर करने के लिए नहीं हैं एक उचित एस/एन में जितनी संभव हो सके तेजी से । EM लाभ हमेशा कैमरे की अधिकतम पर सेट किया जाता है (परिचय देखें) ।
  3. प्रारंभिक परिस्थितियों में एक पहला परीक्षण अनुक्रम चलाएं और मोटे तौर पर एस/एन मूल्य का अनुमान लगाएं । शर्तों S/N = 2-3 या अधिक पर स्वीकार्य हैं, के रूप में पहली बार श्रृंखला के पहले फ्रेम में मापा ।
  4. छवि के एक पक्ष मास्किंग के लिए माइक्रोस्कोप के लिए कैमरा #2 को जोड़ने के उत्सर्जन विभाजन प्रणाली के स्लाइडर का उपयोग करें(चित्रा 1बी, चित्र4ए-बी)
    नोट: इस सेट अप में कैमरा #2 पर एक मल्टीचैनल इमेजिंग कनेक्टर स्थापित किया गया है ताकि एक साथ दो स्थानिक समान छवियों के अधिग्रहण को सक्षम किया जा सके। सिस्टम विभिन्न उत्सर्जन फिल्टर बढ़ते के लिए स्लाइड से लैस है। स्लाइडर्स में से एक छवि के एक तरफ कवर करने के लिए एक काला मुखौटा माउंट करता है। नकाबपोश क्षेत्र का उपयोग कैमरे के मापदंडों (ईक्यू. 12 और ईक्यू 13) निर्धारित करने के लिए हर बार श्रृंखला के आंतरिक अंशांकन के लिए किया जाता है। इस तरह एक स्वतंत्र अंशांकन कदम की कोई आवश्यकता नहीं है और, महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्येक बार श्रृंखला पर कब्जा करने के समानांतर अंशांकन किया जाता है। इस प्रणाली के अभाव में, कैमरे को प्रकाशित प्रोटोकॉल33लागू करने के लिए कैलिब्रेट किया जा सकता है।
  5. कैमरा फाइल ऑटोसेव ऑप्शन चुनें।
  6. छवि श्रृंखला के अधिग्रहण शुरू करते हैं। न्यूनतम 700 फ्रेम न्यूनतम एस/एन अनुपात 2 पर प्राप्त करें।
    नोट: विश्लेषण के लिए आवश्यक फ्रेम की संख्या फोटोब्लीचिंग और डेटा के फैलाव पर नमूना स्थिरता पर निर्भर करती है। इसलिए, एन एंड बी विश्लेषण के दौरान प्रत्येक बार श्रृंखला की गुणवत्ता का आकलन किया जाता है।
  7. डिश को माइक्रोस्कोप से बाहर ले बिना लिगामेंट डालें।
  8. एक उज्ज्वल फ्लोरेसेंस झिल्ली के साथ एक कोशिका का चयन करें और जल्दी से गतिज रन की पहली बार श्रृंखला शुरू करें।
    नोट: यदि लिगामेंट का जोड़ जल्दी किया जाता है, तो यह पहला कैप्चर लिगामेंट काइनेटिक्स का पॉइंट = 0 समय सेट करता है। सॉफ्टवेयर कैप्चरिंग का सही समय दर्ज करता है।
  9. एक दूसरी कोशिका खोजें और गतिज के दूसरी बार बिंदु प्राप्त करें।
    नोट: प्वाइंट-विजिटिंग दिनचर्या एक्स, वाई, जेड मोटराइज्ड चरणों से लैस कुछ माइक्रोस्कोप में उपलब्ध हैं। ये सेल डिश पर कई पदों के याद रखने की अनुमति देते हैं, और विभिन्न कोशिकाओं पर छवि-श्रृंखला के बीच अधिक निरंतर अंतराल रखने में मदद कर सकते हैं।
  10. गतिज चलाने के हर समय बिंदु के लिए एक नया सेल कैप्चर करें।
    नोट: कैप्चर करने के बाद, एक सेल आंशिक रूप से फोटोब्लीच किया जाता है और इसे फिर से इमेज नहीं किया जा सकता है। इस वजह से, कई कोशिकाओं की समय श्रृंखला के संयोजन से गतिज प्राप्त किया जाता है, प्रत्येक को एक अलग समय बिंदु पर कब्जा कर लिया जाता है।
  11. प्रत्येक नई डिश के लिए, चरण 2.3 से 3.9 तक प्रोटोकॉल दोहराएं।
    नोट: संदर्भ व्यंजनों के लिए, लिगांड के लिए उपयोग किए जाने वाले वाहन (0.01% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के साथ पूरक पीबीएस) की मात्रा जोड़ें।

4. संख्या और चमक (एन एंड बी): समय श्रृंखला की गुणवत्ता की जांच

  1. कन्वर्ट और के रूप में बचाने के लिए । कैमरा सॉफ्टवेयर (इस उदाहरण में sif फ़ाइलें) के साथ अधिग्रहीत फ़ाइलों का झगड़ा।
  2. आयात. N & B ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) MATLAB को सक्रिय करके विश्लेषण सॉफ्टवेयर दिनचर्या में झगड़ा फाइल करता है।
    नोट: एक अनुकूलित मैटलैब निष्पादित एन एंड बी दिनचर्या का उपयोग यहां (एन एंड बी विश्लेषण https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia) किया जाता है। आयातित खोलकर । झगड़ा फ़ाइल, दिनचर्या औसत तीव्रता छवि, औसत तीव्रता प्रोफ़ाइल उत्पन्न करती है और यह श्रृंखला फ्रेम-बाय-फ्रेम(पूरक चित्रा 1)का निरीक्षण करने की अनुमति देती है। अन्य सॉफ्टवेयर एन एंड बी विश्लेषण (जैसे, सिमएफसी सॉफ्टवेयर) के लिए उपलब्ध हैं।
  3. डिस्कार्ड श्रृंखला जिसके लिए औसत तीव्रता प्रोफ़ाइल 10% से अधिक फोटोब्लीचिंग दिखाती है, और श्रृंखला जिसमें अधिग्रहण के दौरान एक स्पष्ट कोशिका झिल्ली विरूपण या अनुवाद हुआ है।
  4. फसल फ्रेम जो स्पष्ट रूप से आउट-ऑफ-फोकस हैं।
    नोट: छवि श्रृंखला के भीतर एकल या कई फ्रेम को छोड़ने के लिए दिनचर्या में एक फसल उपकरण लागू किया जाता है। इस ऑपरेशन की अनुमति इसलिए दी जाती है क्योंकि फ्रेम-टू-फ्रेम समय महत्वपूर्ण नहीं है जबकि पिक्सेल निवास समय (एक्सपोजर समय) है (चर्चा देखें)।
  5. विश्लेषण के लिए कम से कम 500 समय फ्रेम के साथ केवल श्रृंखला रखें।

5. संख्या और चमक (एन एंड बी): कैमरा पैरामीटर्स का निर्धारण (ऑफसेट, और एस)

  1. रूटीन कैलिब्रेट कैमराको सक्रिय करें।
  2. डिटेक्टर शोर क्षेत्र में कम से कम 20 x 50 पिक्सल के क्षेत्र का चयन करें(चित्रा 4)।
    नोट: दिनचर्या मूल्यों के एक हिस्टोग्राम (डिजिटल स्तर, डीएल को भी परिभाषित करती है) निकलती है और यह आवृत्ति बनाम डिजिटल स्तर का एक लॉगरिथम प्लॉट देती है।
  3. लॉग फ्रीक्वेंसी बनाम डिजिटल लेवल प्लॉट में, गॉसियन और वक्र के रैखिक भाग को परिसीमित करने के लिए रैखिक लाल कर्सर को स्थानांतरित करें।
    नोट: लाल कर्सर वक्र के दो वर्गों को विभाजित करता है, और ऑफसेट लौटने वाली दिनचर्या को सक्रिय करता है, जो कैमरा प्रतिक्रिया के गॉसियन फ़ंक्शन का केंद्र है, गॉसियन फिट का केंद्र है, और एस फैक्टर, जो कैमरा जिम्मेदारों के रैखिक भाग की ढलान है ई(चित्रा 4सी-डी)।

6. संख्या और चमक (एन एंड बी): चयनित क्षेत्र-ब्याज (आरओआई) में बी-मूल्यों की गणना

  1. बी कुंजी को सक्रिय करें।
    नोट: यह क्रिया औसत तीव्रता छवि(चित्र5,पहला कॉलम) और बी-छवि उत्पन्न करती है जिसमें प्रत्येक व्यक्ति बी-वैल्यू छवि(पूरक चित्रा 1)में संबंधित पिक्सेल से जुड़ा होता है।
  2. डेटा के फैलाव को कम करने और बी-1 हिस्टोग्राम(चित्रा 5,दूसरा कॉलम) उत्पन्न करने के लिए न्यूनतम बिनिंग (2 2) लागू करें।
    नोट: बी-1 हिस्टोग्राम पिक्सेल तीव्रता बनाम छवि के सभी पिक्सल के बी-मूल्यों के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। Y = बी/एस; X = (- ऑफसेट)/एस(पूरक चित्रा 1 और eq. 11 और 15) ।
  3. इंटरैक्टिव स्क्वायर कर्सर का उपयोग करके बी-1 हिस्टोग्राम का निरीक्षण करें।
  4. विश्लेषण के लिए एक वर्ग आरओआई चुनें(चित्र5,तीसरा कॉलम)।
    नोट: कर्सर औसत तीव्रता छवि पर एक मोबाइल मास्क को सिंक्रोनाइज करता है, जो स्क्वायर कर्सर क्षेत्र(पूरक चित्रा 1)के अंदर चुने गए पिक्सेल को हाइलाइट करता है। इस निरीक्षण से, बहुत कम तीव्रता वाले पृष्ठभूमि और क्षेत्रों के विश्लेषण से बाहर करना संभव है।
  5. चयनित आरओआई(चित्र 5,चौथा कॉलम) का बी-मैप जनरेट करें।
  6. चयन से जुड़े बी-मान की एएससीआईआई फाइल को सेव करें।
  7. डेटा के आवृत्ति वितरण की गणना करने और औसत बी-वैल्यू ± एसई(चित्रा 5,पांचवां कॉलम) प्राप्त करने के लिए एक ग्राफिक सॉफ्टवेयर में एएससीआईआई फ़ाइल का आयात करें।
    नोट: यदि डेटा सजातीय हैं, तो बी-मूल्यों की आवृत्ति वितरण गॉसियन वितरण का अनुमान है।
  8. गतिज रन के प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक कोशिका के लिए औसत चमक =-1 [(मायने रखता है/अणु) प्रति निवास समय प्राप्त करने के लिए eq. 15 लागू करें । के अनुसार डेटा सामान्य:

    लिगामेंट अलावा के बाद समय "टी" पर मापा जाने वाला औसत बी-वैल्यू कहां है, और यह औसत बी-वैल्यू है जो उस समय टी =0 (लिगांड अतिरिक्त के बाद 10-20 एस) पर मापा जाता है।
    नोट: परिणामों का सामान्यीकरण विभिन्न दिनों में किए जाने वाले प्रयोगों की सीधी तुलना की अनुमति देता है। यह लेजर पावर और तकनीकी उतार-चढ़ाव के कारण मापी गई चमक में अंतर की भरपाई करता है।
  9. गतिज रन(चित्रा 6)बनाने के लिए सामान्यीकृत औसत चमक बनाम अधिग्रहण समय प्लॉट करें।

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Representative Results

एक ही संस्कृति पकवान में वरीयता प्राप्त दो प्रतिनिधि HeLa-mEGFP-FGFR1 कोशिकाओं के लिए परिणाम चित्रा 5 और पूरक तालिका 1में दिखाए गए हैं । एफजीएफ2 लिगामेंट के अलावा दोनों कोशिकाओं को समय 0 मिन(चित्रा 5ए,टॉप) और 7 मिन(चित्रा 5ए,नीचे) पर कब्जा कर लिया गया था।

चित्रा 5 दो प्रतिनिधि हेला कोशिकाओं के परिणामों को भी दिखाता है जो या तो शुद्ध मोनोमर, जीपीआई-mEGFP(चित्रा 5बी,शीर्ष), या सहसंयोजक से जुड़े डिमेरिक फ्लोरोफोर, जीपीआई-mEGFP-mEGFP(चित्रा 5बी,नीचे) व्यक्त करते हैं ), कोशिका झिल्ली पर उजागर और एक ही प्रयोगात्मक परिस्थितियों में कब्जा कर लिया।

औसत स्पष्ट चमक, बी, HeLa-mEGFP-FGFR1 कोशिकाओं में 1.070 ± 0.001 एसई से 1.141 ± 0.001 एसई, जबकि संदर्भ मोनोमेरिक(चित्रा 5बी,शीर्ष) और मंद(चित्रा 5बी,नीचे) नमूने वापसी बी क्रमशः 1.070 ± 0.001 एसई और 1.141 ± 0.001 एसई के मूल्य। इस प्रकार, तुलना करके, FGFR1 रिसेप्टर मुख्य रूप से शुरू में कोशिका झिल्ली सतह पर मोनोमेरिक रूप में मौजूद है, लेकिन यह अपने विहित लिगामेंट और एफजीएफ2 के साथ उत्तेजना पर एक प्रमुख मंद स्थिति की ओर बढ़ता है। औसतन तो, दो प्रतिनिधि कोशिकाओं में FGFR1 अणुओं की प्रचलित स्थिति स्पष्ट रूप से अलग है ।

एक ही डिश में कई कोशिकाओं के लिए विश्लेषण लागू करके, हर एक एक अलग समय बिंदु पर कब्जा कर लिया, समय के एक समारोह के रूप में औसत चमक प्राप्त की है(चित्र6ए)। चित्रा 6ए में गतिज रन डिमराइजेशन की एक धीमी प्रक्रिया का वर्णन करता है जो कोशिका की सतह पर कई मिनट तक बनी रहती है। एफजीएफएफ2-प्रेरित एफजीएफआर1 डामरीकरण और रिसेप्टर का बाद में आंतरिककरण एक प्रसिद्ध तंत्र34है; इसलिए, परिणाम FGFR1 सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन पर वर्तमान धारणा के साथ पूर्ण समझौते में हैं, और सूक्ष्म के निर्धारण तक सेल झिल्ली प्रोटीन के अल्पाधिकारी का अध्ययन करने के लिए टीआईआरएफ-एन एंड बी दृष्टिकोण की क्षमता की पुष्टि करते हैं मोनोमर-डिमर गतिशीलता।

परिणामों का सामान्यीकृत औसत चमक विश्लेषण एक ही रिसेप्टर पर विभिन्न लिगांड के प्रभाव की तुलना करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण है। इसका एक उदाहरण चित्र6बीमें दिया गया है । प्रोटोकॉल को एक ही मानकों का उपयोग करके दोहराया गया था और कोशिकाओं को गैर-विहित FGFR1 लिगांड, NCAM-Fc (50 μg/mL) के साथ उत्तेजित किया गया था। इस मामले में, गतिज प्रोफ़ाइल ओलिगोमेरिक मिश्रण में रिसेप्टर के तेजी से और चक्रीय संक्रमण का पता चलता है, जो डिमर के ऊपर चमक मूल्यों तक भी पहुंचता है। 3 का सामान्यीकृत औसत मूल्य बार-बार देखा जाता है। हालांकि, एन एंड बी विश्लेषण की सीमा (समय बनाम तीव्रता में उतार-चढ़ाव के केवल दो क्षण ों पर विचार किया जाता है) निस्संदेह एक ट्रिमेरिक रूप के गठन को प्रदर्शित करने की अनुमति नहीं देता है। एक ही सामान्यीकृत औसत चमक बड़े ओलिगोमर और रिसेप्टर के मोनोमर के विभिन्न संयोजनों का परिणाम हो सकती है। फिर भी, परिणाम स्पष्ट रूप से एक ही रिसेप्टर पर दो ligands के प्रभाव के स्थानिक मतभेदों को प्रदर्शित करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रोटोकॉल का अवलोकन। (ए)कोशिकाओं को कांच के नीचे के व्यंजनों पर चढ़ाया जाता है और फ्लोरोसेंटी टैग किए गए रिसेप्टर से ट्रांस्पर किया जाता है। (ख)टाइम सीरीज छवियों को एक वाणिज्यिक टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप पर कैप्चर किया जाता है जो एक टीआईआरटीएफ 100x 100x 1.46 तेल उद्देश्य और इनक्यूबेटर चैंबर से लैस है। इस वाणिज्यिक सेटअप में, सॉफ्टवेयर अंतर्निहित EMCCD कैमरा #1 एन एंड बी समय श्रृंखला प्राप्त करने के लिए आवश्यक बहुत कम एक्सपोजर समय पर काम करने की अनुमति नहीं देता है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि एक्सपोजर समय आणविक प्रसार की सीमा को सीमित करता है जिसे कैप्चर किया जा सकता है। एक्सपोजर समय जितना कम होगा, उतनी ही तेजी से आणविक प्रसार का विश्लेषण किया जा सकता है। झिल्ली प्रोटीन प्रसार के लिए 0.5 से 1 एमएस तक एक्सपोजर पर्याप्त रूप से तेज होते हैं। इसलिए, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर को दरकिनार करते हुए कैमरा सॉफ्टवेयर के नीचे सीधे काम करने के लिए माइक्रोस्कोप के एक अतिरिक्त बंदरगाह में एक दूसरा EMCCD कैमरा (#2) जोड़ा जाता है। इस अनुकूलित विन्यास में, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और कैमरा #1 का उपयोग केवल टीआईआरएफ संरेखण के लिए किया जाता है। TIRF समय श्रृंखला तो कैमरा #2 है कि इस तरह के 1 एमएस और अधिकतम EM लाभ पर के रूप में बहुत कम जोखिम समय पर चलाता है का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । कैमरा #2 में 124 एनएम का पिक्सेल आकार भी है जो छवियों के ओवरसैंपलिंग और बिनिंग की अनुमति देता है (प्रोटोकॉल अनुभाग 6.2 देखें)। इमेजिंग गति हासिल करने के लिए अन्य विन्यास संभव हैं, विभिन्न टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप की विशेषताओं पर निर्भर करता है, जबकि एससीएमओएस कैमरों का उपयोग उचित नहीं है, क्योंकि छवि35में शोर यादृच्छिक नहीं है। (ग)कैप्चर करने के बाद क्वालिटी चेक के तौर पर टाइम सीरीज का निरीक्षण किया जाता है। यदि फोटोब्लीचिंग 10% से अधिक है तो श्रृंखला को छोड़ दिया जाता है क्योंकि यह औसत फ्रेम तीव्रता बनाम फ्रेम संख्या की साजिश रचकर निर्धारित किया जा सकता है। यदि अधिग्रहण के दौरान कोशिका झिल्ली या सेल के अनुवाद की स्पष्ट विकृति आई है तो श्रृंखला को भी छोड़ दिया जाता है। (D)प्रत्येक पिक्सेल में औसत तीव्रता से वस् ता को बचाया जाता है। (ई)छवि के प्रत्येक पिक्सेल में स्पष्ट चमक, बी का प्रतिनिधित्व करने वाला बी-आई हिस्टोग्राम उत्पन्न होता है। (एफ)बी-1 हिस्टोग्राम का उपयोग पृष्ठभूमि से ऊपर के आरओआई के चयन के लिए किया जाता है। (जी)बी-मूल्यों के आवृत्ति वितरण का विश्लेषण औसत बी-वैल्यू ± एसई निर्धारित करने के लिए किया जाता है, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एन एंड बी सिद्धांत। एन एंड बी "कश्मीर" छवियों की एक समय ढेर श्रृंखला के अधिग्रहण के दौरान रोशनी की मात्रा में और बाहर ले जाने वाले फ्लोरोसेंस उतार-चढ़ाव को मापने के द्वारा फ्लोरोफोरस की औसत अल्पायु स्थिति की मात्रा निर्धारित करता है। उतार-चढ़ाव के आयाम को सांख्यिकीय रूप से उतार-चढ़ाव वाले संकेत के विचरण के बीच अनुपात की गणना करके,2और मतलब तीव्रता मूल्य, की विशेषता है। सबसे सरल परिदृश्य(ए)में, जब रोशनी की मात्रा खाली होती है (यानी, कोई फ्लोरोफोरस नहीं), अनुपात साधन शोर का वर्णन करता है। यदि फ्लोरेसेंस सिग्नल मोबाइल फ्लोरोफोरस(बी, सी)के कारण उतार-चढ़ाव करता है, तो "अतिरिक्त" विचरण सीधे आणविक चमक, ε (प्रति अणु और प्रति सेकंड फोटॉन मायने रखता है) के आनुपातिक है, विसारित अणुओं का। (बी)में, 8 मोनोमेरिक डिफ्यूजिंग फ्लोरोफोरस और(सी)में हैं, वही फ्लोरोफोरस 2 टेट्रामिक ओलिगोमर्स के रूप में फैलाते हैं। इन दो मामलों में, औसत तीव्रता एक ही है, लेकिन मानक विचलन और चमक अलग हैं (1ε, 4ε), क्योंकि उतार-चढ़ाव के आयाम अलग हैं। ε = 0 जब फ्लोरोफोरस स्थिर या अनुपस्थित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: TIRF माइक्रोस्कोपी । हालांकि एन एंड बी मल्टीफोर्न, निरंतर लहर या स्पंदित एकल फोटॉन लेजर और एनालॉग या फोटॉन गिनती डिटेक्टरों से लैस रैस्टर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ समान रूप से अच्छी तरह से चलता है, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी आणविक गतिशील के तेज अस्थायी इमेजिंग के लिए आदर्श है गति, संकल्प और संकेत/शोर अनुपात (एस/एन) के साथ सेल सतह पर या उसके पास होने वाली घटनाएं जो अन्य इमेजिंग तकनीकों द्वारा प्राप्त करना संभव नहीं हैं । (A)टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी कुल आंतरिक प्रतिबिंब के सिद्धांत को नियोजित करती है जिसके द्वारा एक कोणउत्तेजा लेजर लाइट केवल फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करती है जो कवरस्लिप के ग्लास-वॉटर इंटरफेस के ठीक नीचे हैं। लेजर अपवर्तन के महत्वपूर्ण कोण से अधिक या बराबर घटना ओं के कोण पर नमूना को विकिरणित करता है जबकि उत्तेजना लेजर प्रकाश पूरी तरह से परिलक्षित होता है। प्रतिबिंब नमूने में एक बहुत ही पतली विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र उत्पन्न करता है जिसे इवेनसेंट वेव कहा जाता है। नमूने के छोटे प्रबुद्ध खंड द्वारा उत्सर्जित परिणामी फ्लोरोसेंट प्रकाश को स्लाइड के नीचे लंबवत रखा गया माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से एकत्र किया जाता है। (ख)पैनल एक इव्सेंट क्षेत्र बनाम गहराई की सापेक्ष तीव्रता की एक दी गई तरंगदैर्ध्य में एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है, जो सतह से बढ़ती दूरी के साथ तेजी से कम हो जाता है, उच्च अक्षीय संकल्प फ्लोरेसेंस प्रदान करता है छवियां. पार्श्व संकल्प संख्यात्मक अपर्चर और उद्देश्य के आवर्धन और डिटेक्शन कैमरे के पिक्सेल आकार द्वारा निर्धारित किया गया है। सेल इंटीरियर प्रबुद्ध नहीं है और यह इंट्रासेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ संकेत में योगदान नहीं करता है। मल्टी-एंगल टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप विभिन्न प्रवेश गहराई का चयन करने की अनुमति देते हैं। वे एक पैमाने पर प्रदान करते हैं जो उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर निर्भर करता है और आमतौर पर एकल रंग टीआईआरएफ छवि के लिए 70 एनएम से 250 एनएम गहराई तक जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए चुनी गई इवेनसेंट रोशनी गहराई 110 एनएम है, और यह कम लेजर पावर का उपयोग करने की आवश्यकता और फ्लोरेसेंस सिग्नल की तीव्रता के बीच एक समझौते का परिणाम है जो प्रवेश गहराई की कमी के साथ तेजी से कम हो जाती है। अत्यधिक बड़े वाष्पांसेंट क्षेत्रों से बचना महत्वपूर्ण है जो फ्लोरोफोरस की कई इंट्रासेलुलर वेसिकल्स और इंट्रासेलुलर आबादी को रोशन कर सकते हैं। इसलिए, नमूने के प्रकार के आधार पर, कई प्रवेश गहराई का पता लगाया जाना चाहिए, सबसे अच्छा संयोजन की खोज: उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, कम उत्तेजना शक्ति, कम एक्सपोजर समय, कम प्रवेश गहराई। एक बार जब यह अनुकूलन हो जाता है, तो प्रवेश गहराई को सभी नियंत्रणों और नमूनों के लिए स्थिर रखा जाता है। (ग)इवेनसेंट क्षेत्र की गहराई और दिशा के सॉफ्टवेयर-निर्देशित अनुकूलन के बाद वाघेला-जीपीआई-जीईएफपी सेल के प्रतिनिधि एपिफ्लोरेसेंस और टीआईआरएफ छवियां । मल्टी एंगल टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप भी इवेनसेंट फील्ड की दिशा को अनुकूलित करने की अनुमति देते हैं। इस कदम को बिखरने (यानी, तीव्रता की तेज वृद्धि और कम कुरकुरा छवि) को कम करने के लिए सिफारिश की जाती है, और इसे उपयोग किए गए विशिष्ट माइक्रोस्कोप के निर्देशों के अनुसार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में इवेनसेंट फील्ड की दिशा का स्वचालित अनुकूलन शामिल है। मैन्युअल अनुकूलन के लिए, प्रकाशित प्रोटोकॉल36,37देखें। (घ)प्रतिनिधि प्रकोष्ठ ने एमईएफएफपी-एफजीएफआर1 का निर्माण एपिफ्लोरेसेंस में और टीआईआरएफ रोशनी के अनुकूलन के बाद व्यक्त किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: समय श्रृंखला का कब्जा और एकल फोटॉनों के लिए कैमरा प्रतिक्रिया का अंशांकन। (क)फसली सेंसर मोड में एक HeLa-mEGFP-FGFR1 सेल पर कब्जा कर लिया ७०० फ्रेम समय श्रृंखला से बाहर पहले फ्रेम का उदाहरण । कैमरा चिप आंशिक रूप से नकाबपोश है (लाल आयत) TIRF माइक्रोस्कोप पर स्थापित दोहरी दृश्य कनेक्टर का उपयोग कर(चित्रा 1बी)। आंतरिक अंशांकन क्षेत्रों को लॉग-फ्रीक्वेंसी बनाम डिजिटल स्तर(डी)की साजिश रचकर कैमरे के मापदंडों का आकलन करने के लिए औसत तीव्रता छवि(बी)और संसाधित(सी)में पहचाना जाता है । एक एनालॉग डिटेक्शन सिस्टम, जैसे कि ईएमसीसीडी कैमरा, फोटॉन काउंट के बजाय फोटोकरंट की दालों का पता लगाता है, और फोटॉन पल्स ऊंचाई वितरण अर्ध-घातीय है। वितरण का पहला भाग एम्पलीफायर और एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर के कारण है और यह गॉसियन रीडआउट शोर (सिग्नल रिकॉर्डिंग द्वारा शुरू किया गया विचरण) का योगदान देता है। वितरण का सबसे अधिक आबादी वाला चैनल (यानी सबसे अधिक बार मूल्य) ऑफसेट (ईक्यू 13) है। एक लॉग प्लॉट में एक ऊर्ध्वाधर कर्सर का उपयोग करना, वितरण का पहला भाग घातीय दूसरे भाग से अलग हो जाता है, जो 250 डीएल से ऊपर है, जो एक फोटॉन के औसत कैमरा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है (ढलान ईक्यू 12 में एस फैक्टर है)। इन मापदंडों का माप अधिग्रहण के दौरान दर्ज किए गए फोटॉनों के घनत्व का आकलन करने की अनुमति देता है। काउंट्स (डीएल) छद्म रंग स्केल में हैं। पिक्सेल आकार = 124 एनएम; छवि प्रारूप = 256x256 पिक्सल, इवेनसेंट फील्ड की पैठ गहराई ~ 110 एनएम; अंशांकन आरओआई #1 = 19x256 पिक्सल; अंशांकन आरओआई #2 = 5x256 पिक्सल। डीएल = डिजिटल स्तर। एक्सपोजर = 1 एमएस और EMGain (ईक्यू में जी फैक्टर। 12, 13 और 14) = 1000। ध्यान दें कि पृष्ठभूमि के साथ फोटॉन काउंटिंग मोड में काम करने वाले कैमरेएस = 1 (ईक्यू. 12) के साथ एनालॉग डिटेक्टरों के बराबर हैं और 2डी और ऑफसेट (ईक्यू 13) के साथ एक एनालॉग सिस्टम18के लिए उसी तरह मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: FGFR1 oligomerization के एन एंड बी विश्लेषण। (क)एक ही डिश में दो वाला कोशिकाओं से प्रतिनिधि परिणाम mEGFP-FGFR1 व्यक्त और समय पर कब्जा कर लिया 0 मिन (ऊपर) और7 मिन (नीचे) 20 एनजी के अलावा के बाद/ और जीपीआई-mEGFP-mEGFP (नीचे) । पूरे विश्लेषण अनुक्रम से पता चलता है (बाएं से दाएं): समय श्रृंखला की औसत तीव्रता; फ्लोरेसेंस तीव्रता के एक समारोह के रूप में सभी बी-मूल्यों की साजिश जिसमें रंग कोड छवि में एक ही बी-वैल्यू वाले पिक्सल की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है और आयताकार कर्सर ब्याज के क्षेत्र (आरओआई), पृष्ठभूमि (बीजी) और बहुत कम क्षेत्रों का परिसीमन करते हैं तीव्रता (ली) । ध्यान दें कि स्थिर फ्लोरोफोरस बी-वैल्यू = 1 देंगे क्योंकि उतार-चढ़ाव के अभाव में Ε = 0; चुने हुए आरओआई का बी-मैप और इससे जुड़ा बी-डिस्ट्रीब्यूशन हिस्टोग्राम। बी-वैल्यू डिस्ट्रीब्यूशन में औसत स्पष्ट चमक, बी (फुल रेड लाइन) और डिस्ट्रीब्यूशन स्टैटिस्टिक्स(सप्लीमेंट्री टेबल 1)बी-वैल्यू = बी ' = बी/एस (ईक्यू 15) की गणना करने के लिए गॉसियन फंक्शन (धराशायी लाल रेखा) लगे हैं; तीव्रता = (- ऑफसेट)/एस; एम = मोनोमर; D = डिमर; स्केल बार = 10 माइक्रोन। पूरक मूवी 1, पूरक मूवी 2, पूरक मूवी 3,और पूरक मूवी 4में रॉ डेटा समय श्रृंखला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: लिगेंड सक्रियण द्वारा प्रेरित एफजीएफआर1 ओलिगोमराइजेशन के काइनेटिक्स। प्रतिनिधि गतिज 20 एनजी/mL FGF2(A)या ५० μg/mL NCAM-Fc(B)के साथ उत्तेजना के बाद वाघेला-mEGFP-FGFR1 कोशिकाओं के सामान्यीकृत औसत चमक (eq. 16) द्वारा वर्णित रन । एक ही डिश में कोशिकाओं को समय अंक बढ़ाने पर कब्जा कर लिया गया था और स्पष्ट औसत चमक, बी ± एसई, बी वितरण हिस्टोग्राम से गणना की गई थी । यह आंकड़ा जमाई एट अल जर्नल ऑफ सेल साइंस (2019)31से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: फास्ट काइनेटिक्स और डेटा व्याख्या। दोहराने गतिज रन जिसमें HeLa-mEGFP-FGFR1 कोशिकाओं या तो NCAM-एफसी (५० μg/mL) या FGF2 (20 एनजी/mL) के साथ उत्तेजित किया गया से प्राप्त सभी सामान्यीकृत औसत चमक मूल्यों के तितर बितर साजिश । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: MatLab में विश्लेषण दिनचर्या के स्क्रीन स्नैपशॉट । एन एंड बी ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) मैटलैब रूटीन का स्क्रीन स्नैपशॉट प्रारंभिक विश्लेषण चरणदिखा: समय श्रृंखला अपलोड करें; औसत तीव्रता छवि की गणना, तीव्रता प्रोफ़ाइल की गणना, बी-मैप और बी-1 हिस्टोग्राम की गणना करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पैरामीटर जीपीआई-mEGFP जीपीआई-mEGFP-mEGFP mEGFP-FGFR1 (समय = 0') mEGFP-FGFR1 (समय = 10')
गॉसियन मतलब बी-वैल्यू 1.070 1.141 1.070 1.141
मतलब बी मूल्य पर एसई 0.001 0.001 0.001 0.001
बी-वायू वितरण के एसडी 0.059 0.067 0.077 0.075
मतलब बी-वैल्यू का 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल 1.069 से 1.071 1.139 से 1.143 1.069 से 1.072 1.139 से 1.143
बी-वैल्यू के 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल का एसडी 0.058 से 0.060 0.065 से 0.069 तक 0.075 से 0.079 तक 0.073 से 0.078
फिटिंग विवश एसडी एंड जीटी 0 एसडी एंड जीटी 0 एसडी एंड जीटी 0 एसडी एंड जीटी 0
एसई मानक त्रुटि; एसडी मानक विचलन

पूरक तालिका 1: स्पष्ट चमक विश्लेषण। आंकड़ा 5 में बी-वितरण के सांख्यिकी और गॉसियन फिटिंग मापदंडों को अंजाम दिया गया । सबसे कम वर्ग गॉसियन फिट पदार्थ मानक विचलन के विवश के तहत प्राप्त किए गए थे और 0 एक्स-रेंज स्वचालित रूप से चुने गए और अधिकतम पुनरावृत्ति = 1000 के साथ। आर स्क्वायर: mEGFP-FGFR1 मोनोमर = 0.9957, mEGFP-FGFR1 डिमर 0.9940; जीपीआई-mEGFP = 0.9985; जीपीआई-mEGFP-mEGFP = 0.9970।

Supplemental Movie 1
पूरक फिल्म 1: समय पर एक HeLa-mEGFP-FGFR1 सेल की समय श्रृंखला = 0 मिनट के बाद FGF2 उत्तेजना (पीबीएस में 20 एनजी/mL ०.०१% बीएसए के साथ पूरक) आंकड़ा 5में दिखाया गया है । 800 फ्रेम की श्रृंखला 7 एफपीएस पर असंपित पुन: पेश की जाती है। छवि प्रारूप = 256 x 256 पिक्सल; पिक्सेल आकार = 124 एनएम; आंतरिक अंशांकन क्षेत्र की पहचान डार्क लेटरल बैंड के रूप में की जाती है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Supplemental Movie 2
पूरक मूवी 2: समय श्रृंखला समय पर एक HeLa-mEGFP-FGFR1 सेल के चित्रा 5 में दिखाया गया है = FGF2 उत्तेजना के बाद 7 मिनट (पीबीएस में 20 एनजी/mL ०.०१% बीएसए के साथ पूरक) ८०० फ्रेम की श्रृंखला 7 fps पर दबाया दमनित कर रहे हैं । छवि प्रारूप = 256 x 256 पिक्सल; पिक्सेल आकार = 124 एनएम; आंतरिक अंशांकन क्षेत्र की पहचान डार्क लेटरल बैंड के रूप में की जाती है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Supplemental Movie 3
पूरक मूवी 3: वाहन (0.01% बीएसए के साथ पूरक पीबीएस) को जोड़ने के बाद वाघेला-जीपीआई-जीईएफपीपी सेल के चित्र 5 में दिखाई गई समय श्रृंखला।) 1,000 फ्रेम की श्रृंखला 7 एफपीएस पर असंपित पुन: पेश की जाती है। छवि प्रारूप = 256 x 256 पिक्सल; पिक्सेल आकार = 124 एनएम; आंतरिक अंशांकन क्षेत्र की पहचान डार्क लेटरल बैंड के रूप में की जाती है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Supplemental Movie 4
पूरक मूवी 4: वाहन (0.01% बीएसए के साथ पूरक पीबीएस) को जोड़ने के बाद वाघेला-जीपीआई-एमईएफपीएफपी सेल के चित्र 5 में दिखाई गई समय श्रृंखला। 1,000 फ्रेम की श्रृंखला 7 एफपीएस पर असंपित पुन: पेश की जाती है। छवि प्रारूप = 256 x 256 पिक्सल; पिक्सेल आकार = 124 एनएम; आंतरिक अंशांकन क्षेत्र की पहचान डार्क लेटरल बैंड के रूप में की जाती है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

एनएंडबी को सेल मॉडल और लेबलिंग रणनीति के चुनाव में कई सावधानियों की आवश्यकता होती है। इसे केवल जीवित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है जो छवि कैप्चर समय के दौरान स्थिर रूप से पालन करते रहते हैं। पूरे सेल कठोर विस्थापन के कारण अतिरिक्त उतार-चढ़ाव को उचित छवि बहाली दृष्टिकोण38के साथ संभाला जा सकता है। हालांकि, आम तौर पर जब एक कोशिका चलती है, तो कोशिका झिल्ली भी विकृत होती है, और संरचना विरूपण, बड़े अतिरिक्त विचरण का उत्पादन करती है, झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण के लिए गंभीर सीमा का परिचय देती है। इस काम में, फ्लोरोसेंट निर्माण हेला सेल लाइन में व्यक्त किया जाता है क्योंकि संविलियन FGFR1 नगण्य है। संविलियन प्रोटीन की उपस्थिति से बचने के लिए एक शर्त है, अन्यथा फ्लोरोसेंट और गैर-फ्लोरोसेंट रिसेप्टर ओलिगोमर्स की मिश्रित आबादी की संभावना होगी। नतीजतन, एन एंड बी विश्लेषण, जो केवल फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन आबादी की चमक पर आधारित है, औसत ओलिगोमेरिक राज्य का अविश्वसनीय अनुमान वापस करेगा। रिसेप्टर डामरीकरण की घटनाओं का पता लगाने के लिए एन एंड बी को लागू करते समय यह पहलू विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जिसमें चमक केवल 2 के कारक से बढ़ जाती है, जैसे FGF2 लिगांड की उपस्थिति में FGFR1 डामरीकरण। ऐसे मामले में, मिश्रित डिमर्स की उपस्थिति एन एंड बी द्वारा पता लगाने योग्य डामरीकरण की घटनाओं को पूरी तरह से छुपा सकती है। गैर फ्लोरोसेंट संविलियन रूपों के साथ फ्लोरोसेंट ओलिगोमर्स का संदूषण फ्लोरोसेंस का पता लगाने के आधार पर किसी भी दृष्टिकोण के संभावित नुकसान में से एक है, जब तक कि टैग किए गए प्रोटीन को काफी हद तक अधिक व्यक्त नहीं किया जाता है। हालांकि, प्रोटीन अतिअभिव्यक्ति की स्थितियों में अल्पाओमराइजेशन अध्ययन उनके कार्यात्मक महत्व के बारे में चिंताएं बढ़ाते हैं। क्षणिक रूप से ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस (यानी प्रोटीन एकाग्रता) का परिवर्तनीय स्तर होगा और प्रोटीन एकाग्रता पर औसत चमक की स्वतंत्रता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हैं, क्योंकि एन एंड बी को विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है सांद्रता, डिटेक्टर की रैखिक प्रतिक्रिया की स्थिति के तहत (चमक की परिभाषा देखें, eq. 1)।

एक और बाधा लाइव कोशिकाओं में एक स्थिर फ्लोरोफोर का उपयोग कर रिसेप्टर की स्टोइचियोमेट्रिक लेबलिंग है। कोशिका में प्रोटीन के प्रति अणु के प्रति बाउंड फ्लोरोफोर्स की सटीक संख्या प्राप्त करने के लिए हेलो-टैग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) या अन्य सहसंयोजक फ्लोरोसेंट टैग उपयुक्त लेबल हैं। एन एंड बी विश्लेषण की जटिलता को कम करने के लिए, हम या तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन या हेलो-टैग का उपयोग करते हैं जो 1-से-1 फ्लोरोफोर-टू-प्रोटीन लेबलिंग देते हैं। पसंद का एफपी परिपक्व रूप में एकाक्षरी होना चाहिए, जिसमें नगण्य आत्म-संघ की प्रवृत्ति है, अन्यथा, एफपी-टैग रिसेप्टर्स के कृत्रिम ओलिगोमेराइजेशन को प्रेरित कर सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हम (A207K) mEGFP का उपयोग करते हैं क्योंकि यह एकल बिंदु उत्परिवर्तन mEGFP आत्म-एकत्र प्रवृत्ति को समाप्त करता है जैसा कि पहले31,39,40दिखाया गया था। लेबलिंग रणनीति की परवाह किए बिना, फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन को चुने हुए सेल मॉडल में जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए जांचकी जानी चाहिए, क्योंकि टैग किए गए अणुओं की कार्यक्षमता ओलिगोमराइजेशन की घटनाओं को जोड़ने के लिए आवश्यक है रिसेप्टर सिग्नलिंग। हमारे मॉडल में, हमने रिसेप्टर लिगांड एफजीएफ231के साथ ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं को उत्तेजित करने के बाद फ्लोरोसेंट (A207K) mEGFP-FGFR1 के ऑटोफोस्फोरिलेशन को साबित किया।

एन एंड बी रोशनी की मात्रा में अणुओं के प्रसार पर आधारित है। डिजिटल कैमरा डिटेक्शन में एक्सपोजर टाइम (यानी, पिक्सल एलॉग डिटेक्शन, टीनिवासमें समय निवास करता है) काफी कम होना चाहिए कि फोकल वॉल्यूम में कणों का एक और केवल एक कॉन्फिगरेशन कैप्चर किया जाता है । यह कहना है कि एक्सपोजर समय के दौरान प्रबुद्ध मात्रा में फ्लोरोफोर प्रवेश करने या बाहर निकलने की संभावना बहुत छोटी है। एक्सपोजर समय फ्लोरोफोर निवास समय(αडी)से कम होना चाहिए जो औसत समय है कि एक फ्लोरोफोर प्रबुद्ध मात्रा में खर्च करता है। इसलिए, एन एंड बी प्रयोग शुरू करने से पहले, लक्ष्य प्रोटीन के निवास समय (या प्रसार गुणांक) के बारे में कुछ धारणा होना आवश्यक है, जो पहले सन्निकटन में, उपसेलुलर स्थानीयकरण और आणविक द्रव्यमान पर निर्भर करता है। फ्रेम दर कैमरे के लिए एक छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय का उलटा है और फिर पूरी तरह से उस छवि को पढ़ने के लिए, और यह अक्सर, पिक्सल की कुल संख्या और readout दर से लगभग गणना की जाती है, एक्सपोजर समय के साथ संयुक्त। हालांकि फ्रेम दर को तेज होने की आवश्यकता नहीं है, चक्र समय(टीचक्र),जो फ्रेम दर का योग है और अगले फ्रेम के कब्जे को तैयार करने का समय है, विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है। इन बाधाओं को सामान्यीकृत किया जा सकता है: टीसाइकिल >τ D >t d: यदि चक्र का समय बहुत तेज है, तो अणु उस समय में एक फ्रेम से अगले तक प्रशंसनीय रूप से स्थानांतरित नहीं होंगे, और स्थिर (बी = 1) के रूप में दिखाई देंगे। हालांकि, क्योंकि विश्लेषण के लिए सैकड़ों फ्रेम की आवश्यकता होती है, सेल विस्थापन और कोशिका झिल्ली की विकृति से बचने के लिए साइकिल चलाना यथासंभव तेजी से सेट किया जाता है (पिक्सेल की संख्या में छवि प्रारूप को बढ़ाना या कम करना) जो बड़े अतिरिक्त विचरण को जोड़ देगा श्रृंखला अधिग्रहण के दौरान। इस प्रोटोकॉल के उदाहरण में, सबसे धीमी चक्र समय 22 एमएस है, ताकि 500 फ्रेम 11 एस में प्राप्त किया जा सकता है।

आणविक चमक एक पूर्ण मात्रा नहीं है; यह फ्लोरोफोर (क्रॉस सेक्शन और क्वांटम यील्ड) के आणविक गुणों पर निर्भर करता है, प्रायोगिक सेट अप (डिटेक्टर और प्रकाशिकी) के साथ-साथ लेजर पावर जैसी उत्तेजना की स्थिति पर भी निर्भर करता है। इस प्रकार, टीआईआरएफ-एन एंड बी दृष्टिकोण एक स्पष्ट चमक पैदा करता है और इसके कारण एक "संदर्भ सेल मॉडल" स्थापित करना मौलिक है जो एकही मुखर ओलिगोमेरिक राज्य के साथ एक संदर्भ निर्माण व्यक्त करता है। संदर्भ निर्माण अध्ययन के तहत प्रोटीन का एक ही फ्लोरोफोर टैग किया जाता है [यहां, (A207K) mEGFP] और यह एक ही उपकोशिकीय डिब्बे में स्थानीयकृत (यहां, प्लाज्मा झिल्ली) । इस काम में हम एक ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिलिओसिटोल (जीपीआई) लंगर डाले-(A207K) mEGFP निर्माण का उपयोग करते हैं जिसे हमने बार-बार एक ही फ्लोरोफोर30के साथ लेबल किए गए सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए एक विश्वसनीय मोनोमेरिक ब्राइटनेस मानक का प्रदर्शन कियाहै, 31.

एक प्रमुख दोष फ्लोरोफोर फोटोब्लीचिंग की घटना है जो बहुत संभावना होती है जब एक ही कोशिका बार-बार एक गतिज रन के दौरान प्रकाश के संपर्क में आती है, और ओलिगोमराइजेशन राज्य के कम अनुमान की ओर जाता है। इसे रोकने के लिए, चमक गतिज को अलग-अलग समय बिंदु(चित्र6)पर कब्जा कर लिया गया विभिन्न कोशिकाओं की औसत चमक के संयोजन से प्राप्त किया जाता है। यह कहना है कि पेट्री डिश में प्रत्येक कोशिका गतिज का एक अलग समय बिंदु है और एक पेट्री डिश एक पूरे गतिज रन का प्रतिनिधित्व करता है।

जब ओलिगोमराइजेशन गतिशीलता तेज और जटिल होती है, जैसे कि गैर-विहित लिगाण्ड, एनसीएएम31द्वारा प्रेरित FGFR1 ओलिगोमराइजेशन, सामान्यीकृत औसत चमक बनाम समय का प्रोफाइल चर और अस्थिर हो सकता है(चित्रा 6बी ). ऐसे मामले में, प्रत्याक्षेप सटीक समय बिंदुओं पर कोशिकाओं की दोहराने वाले व्यंजनों को पढ़कर, हर बार एक नए सेल पर जाने और ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता के कारण, आरओआई का चयन करें, आरओआई का चयन करें/ इस प्रकार, गतिज प्रोफ़ाइल समानता और चमक परिवर्तन के आयाम के संदर्भ में प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन किया जा सकता है।

परिणामों का अवलोकन चित्र 7में प्रस्तुत किया जाता है । स्कैटर प्लॉट केवल एक ही डिश की कोशिकाओं में मापा औसत चमक दिखाता है, प्रत्येक कैप्चर के समय की उपेक्षा करता है। इस साजिश में रिसेप्टर के अल्पाचार की स्थिति पर दो लिगांड द्वारा प्रेरित प्रमुख अंतर स्पष्ट रहता है, हालांकि सभी गतिज जानकारी हटा दी जाती है। हालांकि, प्रयोगों के दोनों सेट के लिए (FGF2-बनाम NCAM-प्रेरित oligomerization), मतलब ± 7 में प्रत्येक रन के एसडी निर्धारित करने के पारंपरिक दृष्टिकोण FGFR1 FGF2 द्वारा उत्तेजित अणुओं के बाद से भ्रामक निष्कर्ष के लिए नेतृत्व करेंगे स्पष्ट रूप से दो अच्छी तरह से परिभाषित राज्यों में पारगमन, जबकि NCAM अस्थिर और चक्रीय अल्पाके FGFR1 मिश्रण है कि अच्छी तरह से एक मतलब ± एसडी मूल्य द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं किया जाएगा लाती है ।

संक्षेप में, एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से, एन एंड बी को केवल एक तेजी से अधिग्रहण मॉड्यूल और एक समर्पित सॉफ्टवेयर से लैस माइक्रोस्कोप तक पहुंच की आवश्यकता होती है। ब्याज के प्रोटीन को विभिन्न प्रकार के मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या कार्बनिक फ्लोरोफोरस के साथ टैग किया जा सकता है, लेकिन मात्रात्मक मापन को पूरा करने के लिए कई शर्तों की आवश्यकता होती है: स्टोइकिओमेट्रिक लेबलिंग, संदर्भ चमक मानक, डिटेक्टर अंशांकन और कोई फोटोब्लीचिंग नहीं। इस संदर्भ में, एन एंड बी दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के स्थानिक अल्पाओकोमराइजेशन को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, सांख्यिकीय भार४१ को हल करने के लिए कच्चे डेटा के पुनर्नमूनाकरण में हाल ही में प्रगति और क्रॉस-सहसंबंध एन एंड बी42 के साथ फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी को मिलाकर एन की प्रयोज्यता को परिष्कृत और बेहतर बना रहे हैं और प्रोटीन ओलिगोमराइजेशन और इंटरैक्शन स्टडीज के लिए बी दृष्टिकोण।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

सीएनआईसी को सीआईएनसिया, इनोवेटियन वाई यूनीवर्सिडीज और प्रो सीएनआईसी फाउंडेशन मंत्रालय द्वारा समर्थित किया जाता है, और यह एक सेवेरो ओचोआ सेंटर ऑफ एक्सीलेंस (सेव-2015-0505) है। हमें यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (फेडर) "ऊना मनारा डी हैसर यूरोपा" द्वारा भी समर्थन दिया जाता है। यूसी Associazione इटालियन Ricerca सुल Cancro, अंतरराष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान के लिए एसोसिएशन (अब दुनिया भर में कैंसर अनुसंधान के रूप में जाना जाता है), और इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय से समर्थन स्वीकार करते हैं । एटी ने पीवी फेलोशिप "प्रोगेटो प्रोफेशनलिटा इवानो बेची" 2011-2012 के साथ अपने काम का आंशिक रूप से समर्थन करने के लिए "फोंडाज़िओन बैंका डेल मोंटे डि लोम्बार्डिया" को स्वीकार किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 21063029 Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10566-016 Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Biowest, Nuaillé, France X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2 TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 10270106 10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes MatTek, Ashland, MA, USA P35G-0.170-14-C uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA LONZA 17-602E supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2 PeproTech EC, Ltd., London, UK Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO ThermoFisher Scientific 11360070 1 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent MirusBio LLC, Madison, WI, USA MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA 25200056
Type F Immersion liquid 10 mL Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific AM2618 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

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References

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जीव विज्ञान अंक 153 रिसेप्टर क्लस्टर एन एंड बी संख्या और चमक पल विश्लेषण प्रोटीन ओलिगोमर सेल झिल्ली टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी
कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लिविंग सेल में सेल सरफेस रिसेप्टर्स की ओलिगोमेराइजेशन गतिशीलता संख्या और चमक विश्लेषण के साथ संयुक्त
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Zamai, M., Trullo, A., Arza, E.,… More

Zamai, M., Trullo, A., Arza, E., Cavallaro, U., Caiolfa, V. R. Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60398, doi:10.3791/60398 (2019).

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