يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء اوبيكييتين (Ub) و اوبيكويتين-أمثال (Ubls) بروتينيه محدده من أجل تحديد التعديلات من هذا النوع من التعديلات بعد الانتقالية (PTMs) ، المرتبطة بحاله معينه مثل العلاج أو النمط الظاهري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنميط اوبيكويتين و اوبيكويتين-مثل التعديلات اللاحقة الانتقالية وتحديد التعديلات الهامه
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اوبيكويتين (ub) و اوبيكويتين (ubl) تعتمد التعديلات بعد الانتقالية من البروتينات تلعب الأدوار التنظيمية البيولوجية الاساسيه داخل الخلية عن طريق التحكم في استقرار البروتين ، والنشاط ، والتفاعلات ، وتوطين الخلايا. فهي تمكن الخلية من الاستجابة للإشارات والتكيف مع التغيرات في بيئتها. التعديلات داخل هذه أليات يمكن ان يؤدي إلى حالات مرضيه شديده مثل امراض الأعصاب والسرطان. والهدف من هذه التقنية الموصوفة هنا هو إنشاء ملفات PTMs التابعة ل ub/ubls ، بسرعة ودقه ، من خطوط الخلايا المستزرعة. وتسمح المقارنة بين الملامح المختلفة التي يتم الحصول عليها من ظروف مختلفه بتحديد التعديلات المحددة ، مثل تلك التي يسببها العلاج علي سبيل المثال. يتم تنفيذ لينتيفيرال الخلية بوساطة لإنشاء خطوط خلايا مستقره التعبير عن اثنين من العلامات (6 له والعلم) الإصدار من المعدل (اوبيكويتين أو ubl مثل SUMO1 أو Nedd8). هذه العلامات تسمح لتنقيه اوبيكويتين التالي من البروتينات اوبيتاميناتيد من الخلايا. ويتم ذلك من خلال عمليه تنقيه من خطوتين: يتم تنفيذ أول واحد في ظروف التعتيم باستخدام علامة 6 له ، والثانية في الظروف الاصليه باستخدام علامة العلم. وهذا يؤدي إلى عزله شديده التحديد ونقيه من البروتينات المعدلة التي يتم تحديدها فيما بعد ونصف الكمية بواسطة اللوني السائل متبوعا بتكنولوجيا الطيف الكتلي (LC-MS/MS) الترادفية. يتيح التحليل المعلوماتي السهل لبيانات MS باستخدام برنامج Excel إنشاء ملفات تعريف PTM عن طريق القضاء علي إشارات الخلفية. وتقارن هذه التوصيفات بين كل حاله من أجل تحديد التعديلات المحددة التي ستدرس بعد ذلك بشكل أكثر تحديدا ، بدءا من التحقق من صحتها بواسطة تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية.
المقدمة
الطريقة المقترحة هنا مكرسه لدراسة PTMs بوساطة افراد الاسره اوبيكويتين من خلايا الثدييات مثقف من أجل تحديد التغييرات المحتملة المرتبطة بحاله معينه (العلاج ، والتمايز ، الخ). PTMs تمثل الخطوة الاخيره من تنظيم وظائف البروتينات1. في الواقع ، مره واحده التي تنتجها آلات الانتقالية ، ومعظم ان لم يكن جميع البروتينات الخضوع لأنواع مختلفه من PTMs التي تعدل نشاطها ، والتفاعلات الجزيئية ، والموقع داخل الخلايا1. من بين عدد كبير من PTMs هي تلك التي توسط من قبل عائله اوبيكييتين من البروتينات ، اوبيكويتين نفسها وجميع الأمثال اوبيكويتين ، لديها القدرة علي تنظيم جميع البروتينات الخلوية أو جزئيا الخلايا الدهنية2. لأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد خطوط الخلايا مستقره التعبير عن 6His-العلم-Ubl
ملاحظه: الانتقال المشترك للخلايا 293T مع Pكونتيننت-6HF-Ubl ، pVSVG ودلتا-المساعد.
- اليوم 0: البذور 293T الخلايا في لوحه 6 حسنا للحصول علي 50-70 ٪ التقاء في اليوم التالي.
- اليوم الأول: شارك في transfect 50-70 ٪ متموج الخلايا مع مزيج من 1 ميكروغرام من Pكونتيننت-6HF-Ubl أو Pكونتيننت-GFP ، 1 ميكروغرام من pVSVG و 1 ميكروغرام من ناقلات دلتا المساعد ، وذلك باستخدام كاشف النقل وبروتوكول لإنتاج لينتيفيروس. بعد 6 ح من الانتقال ، تغيير المتوسطة إلى واحده جديده المقابلة للخلايا ان تكون محوله. بذور الخلايا التي سيتم توصيلها في 6 لوحه جيدا من أجل الحصول علي 10-20 ٪ التقاء في اليوم ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توصيل خلايا الثدييات الثقافية لإنشاء خلايا GFP و 6HF-Ub التي تعبر عن
لإنتاج لينتيفيروسيس التي سيتم استخدامها في وقت لاحق إلى transduce MiaPaCa-2 الخلايا ، 70 ٪ متموج يشيك-293T الخلايا هي المشتركة مع كميه متساوية من المتجات الثلاثة ، Pكونتيننت-6HF-اوبيكويتين أو GFP/دلتا-المساعد/pvSvG. بعد 24 ساعة من الإنتاج ، يتم استرداد المتوسطة التي تحتوي علي جزيئات لينتيفيرال وتصفيتها. فمن الممكن في هذه المرحلة للسيطرة علي كفاءه النقل عن طريق التحقق من الفلورية الخضراء من GFP التعبير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد وضعنا منهجيه قويه وموثوق بها لتوليد لمحات من البروتينات التي تم تعديلها من قبل أعضاء الاسره الرئيسية اوبيكويتين. في الواقع ، لقد نجحنا في تطبيق هذا البروتوكول لتوليد لمحات من PTMs من قبل اوبيكويتين ، وأيضا من قبل السومو و Nedd8 ، وللكشف عن التعديلات المرتبطة بالعلاج7، استجابه للتعبير أكثر أو ضربه قاضيه من جين معين (البيانات لا يظهر) وفي الخلايا التي اكتسبت النمط الظاهري المقاوم للادويه العلاج الكيميائي المتنوعة.
هناك فقط عدد قليل من الخطوات الحاسمة خلال الاجراء الذي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما من قبل La رابطه المكافحة السرطان إلى الجهد الحاد والماجستير ، والرابطة من أجل البحوث والسرطان إلى PS ، الانكا (معهد السرطان الوطنية) و Canceropole باكا إلى التنفيذ المشترك. مرفق الطيف الكتلي من البروتينات مرسيليا (marseille-proteomique.univ-amu.fr) بدعم من IBISA (البنية التحتية بيولوج Santé et Agronomie) ، الهضبة التكنولوجية ايكس مرسيليا ، والمركز الكبير ، بروفانس-ألب-كوت دازور ريجيون ، ومعهد باولي-كالميتيتس ، ومركز البحوث الخاصة بمرسيليا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | يربط جميع البروتينات الموسومة بعلامة العلم |
| المضادة للجسم المضاد Flag M2 | Sigma-Aldrich | F3165 | للكشف عن 6His-Flag الموسومة للتعبير عن مصفاة الخلية ub / ubl |
| 40 & micro ؛ م | فالكون | 352350 | لإزالة الحبيبات العائمة من الخلايا المحللة جوانيدين |
| علم الببتيد | Sigma-Aldrich | F3290 | بروتينات العلم الموسومة من الخرز المضادة للعلم |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | عامل الفوضى المستخدم لتغيير طبيعة جميع البروتينات في محللة الخلية |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | يميلل 6بروتينات الرابطة الخاصة به من حبات Ni-NTA |
| L3000015 | Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | لنقل خلايا HEK-293T لإنتاج فيروسات العدسات |
| Lobind | Sigma-Aldrich | Z666491 | يتجنب امتصاص المواد الثمينة |
| مرشح الغشاء ، 0.45 & م | ميليبور | HAWP04700F1 | لتصفية تنقية اللينتفير الخارق |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | لعلامة 6His |
المراجع
- Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).
- Hochstrasser, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
