Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Sommario

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Abstract

L'ubiquitina (ubiquitina) e le modifiche post-traduzionali dipendenti (ubl) delle proteine svolgono ruoli normativi biologici fondamentali all'interno della cellula controllando la stabilità delle proteine, l'attività, le interazioni e la localizzazione intracellulare. Consentono alla cellula di rispondere ai segnali e di adattarsi ai cambiamenti nel suo ambiente. Le alterazioni all'interno di questi meccanismi possono portare a gravi situazioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i tumori. Lo scopo della tecnica qui descritta è quello di creare profili ptMs dipendenti ub/ubls, rapidamente e con precisione, da linee cellulari coltivate. Il confronto di diversi profili ottenuti da diverse condizioni consente l'identificazione di alterazioni specifiche, come quelle indotte ad esempio da un trattamento. La trasduzione cellulare mediata Lentiviral viene eseguita per creare linee cellulari stabili che esprimono una versione a due tag (6His e Flag) del modificatore (ubiquitina o un ubl come SUMO1 o Nedd8). Queste etichette permettono la purificazione dell'ubiquitina e quindi delle proteine ubiquitinate dalle cellule. Questa operazione viene eseguita tramite un processo di purificazione in due fasi: il primo viene eseguito in condizioni di defatura utilizzando il tag 6His e il secondo in condizioni native utilizzando il tag Flag. Ciò porta ad un isolamento altamente specifico e puro delle proteine modificate che vengono successivamente identificate e semi-quantificate dalla cromatografia liquida seguita dalla tecnologia di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). La facile analisi informatica dei dati MS utilizzando il software Excel consente la creazione di profili PTM eliminando i segnali in background. Questi profili vengono confrontati tra ogni condizione al fine di identificare alterazioni specifiche che saranno poi studiate in modo più specifico, a partire dalla loro convalida mediante tecniche di biochimica standard.

Introduzione

Il metodo qui proposto è dedicato allo studio dei PTM mediati dai membri della famiglia ubiquitina da cellule di mammiferi coltivati al fine di identificare potenziali alterazioni associate a una condizione specifica (trattamento, differenziazione, ecc.). I PTM rappresentano l'ultimo passo della regolazione delle funzioni delle proteine¹. Infatti, una volta prodotte dalla macchina traslazionale, la maggior parte se non tutte le proteine subiscono diversi tipi di PTM che modulano la loro attività, interazioni molecolari e posizione intracellulare¹. Tra le pletora di PTM sono quelli mediati dalla famiglia ubiquitina di pro....

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono 6His-Flag-Ubl

NOTA: Co-trasfezione di cellule HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG e delta-Helper.

1. Giorno 0: Seme 293T cellule in una piastra 6-bene per ottenere 50-70% confluenza il giorno dopo.
2. Giorno 1: Co-transfett 50-70% cellule confluenti con una miscela di 1 g di pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g di pVSVG e 1 g di vettori delta-helper, utilizzando un reagente di trasfusione e un protocollo per la produzione di lentivirus lentivirus. Dopo 6 h di trasfezione, cambiare il mezzo in uno fresco corrispondente alle cellule da trasdure. Semina le cellule da tradursi in una pi....

Risultati

Trasduzione delle cellule di mammiferi di coltura per creare cellule espressi GFP e 6HF-Ub
Per produrre lentivirus che saranno successivamente utilizzati per trasdurre le cellule MiaPaCa-2, le cellule HEK-293T confluenti 70% sono co-trascate con una quantità uguale dei tre vettori, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Dopo 24 ore di produzione, il mezzo contenente particelle lentivirali viene recuperato e filtrato. A questo punto è possibile controllare l'effic.......

Discussione

Abbiamo sviluppato una metodologia robusta e affidabile per generare profili di proteine modificate dai principali membri della famiglia ubiquitina. Infatti, abbiamo applicato con successo questo protocollo per generare profili di PTM da ubiquitina, e anche da SUMO e Nedd8, e per rilevare alterazioni associate a un trattamento⁷, in risposta alla sopra espressione o knockdown di un certo gene (dati non cellule che hanno acquisito un fenotipo resistente a diversi farmaci chemioterapici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	lega tutte le proteine contrassegnate
anticorpi anti-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165	per rilevare l'espressione marcata 6His-Flag di ub/ubl
Filtro cellulare 40 &; m	Falcon	352350	per rimuovere il pellet galleggiante dalle cellule lizzate di guanidina
Peptide bandiera	Sigma-Aldrich	F3290	eluire le proteine marcate con bandiera dalle perle anti-bandiera
Guanidina cloridrato	Sigma-Aldrich	50933	agente caotropico utilizzato per denaturare tutte le proteine nel lisato cellulare
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	elua le proteine di legame 6His dalle perle Ni-NTA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	per trasfettare le cellule HEK-293T per produrre lentivirus
Provette	Lobind Sigma-Aldrich	Z666491	evita l'assorbimento di materiale prezioso
Filtro a membrana, 0,45 &; m	Millipore	HAWP04700F1	per filtrare il supernante lentivirale
Ni-NTA	Qiagen	30210	purificazione del tag 6His