Summary
Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.
Abstract
L'ubiquitina (ubiquitina) e le modifiche post-traduzionali dipendenti (ubl) delle proteine svolgono ruoli normativi biologici fondamentali all'interno della cellula controllando la stabilità delle proteine, l'attività, le interazioni e la localizzazione intracellulare. Consentono alla cellula di rispondere ai segnali e di adattarsi ai cambiamenti nel suo ambiente. Le alterazioni all'interno di questi meccanismi possono portare a gravi situazioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i tumori. Lo scopo della tecnica qui descritta è quello di creare profili ptMs dipendenti ub/ubls, rapidamente e con precisione, da linee cellulari coltivate. Il confronto di diversi profili ottenuti da diverse condizioni consente l'identificazione di alterazioni specifiche, come quelle indotte ad esempio da un trattamento. La trasduzione cellulare mediata Lentiviral viene eseguita per creare linee cellulari stabili che esprimono una versione a due tag (6His e Flag) del modificatore (ubiquitina o un ubl come SUMO1 o Nedd8). Queste etichette permettono la purificazione dell'ubiquitina e quindi delle proteine ubiquitinate dalle cellule. Questa operazione viene eseguita tramite un processo di purificazione in due fasi: il primo viene eseguito in condizioni di defatura utilizzando il tag 6His e il secondo in condizioni native utilizzando il tag Flag. Ciò porta ad un isolamento altamente specifico e puro delle proteine modificate che vengono successivamente identificate e semi-quantificate dalla cromatografia liquida seguita dalla tecnologia di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). La facile analisi informatica dei dati MS utilizzando il software Excel consente la creazione di profili PTM eliminando i segnali in background. Questi profili vengono confrontati tra ogni condizione al fine di identificare alterazioni specifiche che saranno poi studiate in modo più specifico, a partire dalla loro convalida mediante tecniche di biochimica standard.
Introduction
Il metodo qui proposto è dedicato allo studio dei PTM mediati dai membri della famiglia ubiquitina da cellule di mammiferi coltivati al fine di identificare potenziali alterazioni associate a una condizione specifica (trattamento, differenziazione, ecc.). I PTM rappresentano l'ultimo passo della regolazione delle funzioni delle proteine1. Infatti, una volta prodotte dalla macchina traslazionale, la maggior parte se non tutte le proteine subiscono diversi tipi di PTM che modulano la loro attività, interazioni molecolari e posizione intracellulare1. Tra le pletora di PTM sono quelli mediati dalla famiglia ubiquitina di proteine, ubiquitina stessa e tutti i tipi di ubiquitina, hanno il potenziale per regolare tutte le proteine intracellulari o parzialmente citoplasmate2. Poiché sono esse stesse proteine, possono essere coniugate tra loro, formando catene omogenee ed eterogenee di topologie diverse, ciascuna associata a specifiche funzioni normative2. Sono necessari strumenti per cercare di decifrare e comprendere questo complesso macchinario. Molti approcci sono stati sviluppati in tutto il mondo, con i propri vantaggi e svantaggi, e qui ne proponiamo uno con alte prestazioni adatte per le cellule coltivate.
Il vantaggio principale di questo metodo è la sua precisione. Infatti, la purezza delle proteine isolate modificate è altamente migliorata dall'uso combinatorio dei due tag (6His e Flag) e le due step-procedure e quindi è molto più selettiva di una fusione a singolo tag Ub/Ubl3,4. La presenza del 6His tag consente un primo passo di purificazione in una condizione di denatura completamente evitando così qualsiasi co-purificazione di proteine contenenti domini di legame dell'ubiquitina o altre proteine che si legano a quelle ubiquitinate. Si tratta di un problema tecnico riscontrato da diversi altri approcci basati sulla purificazione dell'affinità dei proteomi ubiquiturati utilizzando specifici anticorpi5 o elementi di legame dell'ubiquitina tandem (TUBEs)6. È importante sottolineare che questa tecnica non è di parte a favore della purificazione di un certo tipo di ubiquitinazione, come potrebbe essere il caso per alcuni altri approcci, dal momento che sia mono e diversi tipi di poliubiquitinations sono stati identificati7. Di conseguenza, una volta trovata, un'alterazione dell'ubiquitazione dovrà essere studiata in maggiori dettagli da approcci biochimici standard al fine di identificare il tipo esatto di ubiquitinazione coinvolto.
Infine, un altro vantaggio tecnico di questo protocollo è l'uso di lentivirus, che crea facilmente e rapidamente linee cellulari che esprimono stabili con ragionevole livello di espressioni di modificatore con tag senza interferire con il normale comportamento cellulare.
Mentre un ruolo importante dell'onniquitazione è quello di colpire le proteine per la degradazione proteasomica, è ora noto che ha molte altre proprietà regolatorie per le proteine potenzialmente più intracellulari o parzialmente intracellulari1. Il numero di queste funzioni è ulteriormente accresciuto dall'esistenza di molte ubiquitine come proteine, formando una famiglia di proteine che regolano quasi tutti i meccanismi cellulari1. Le loro alterazioni possono avere un impatto drastico sulla biologia cellulare e possono condurre o partecipare a situazioni patologiche8, come il cancro9. Quindi, sono necessari strumenti per esplorare questo vasto paesaggio e identificare le alterazioni associate a una condizione patologica che potrebbe servire come nuovi bersagli terapeutici.
Questo protocollo è dedicato alle cellule in coltura poiché devono essere trasdotte per esprimere Ub/Ubl esogeno. Una volta create, queste linee cellulari stabili possono essere utilizzate per generare profili Ubl dalla coltura in 2D o 3D o xenografts, estendendo così l'orizzonte dei diversi modelli sperimentali che possono essere applicati per studiare i profili PTMs.
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Protocol
1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono 6His-Flag-Ubl
NOTA: Co-trasfezione di cellule HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG e delta-Helper.
- Giorno 0: Seme 293T cellule in una piastra 6-bene per ottenere 50-70% confluenza il giorno dopo.
- Giorno 1: Co-transfett 50-70% cellule confluenti con una miscela di 1 g di pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g di pVSVG e 1 g di vettori delta-helper, utilizzando un reagente di trasfusione e un protocollo per la produzione di lentivirus lentivirus. Dopo 6 h di trasfezione, cambiare il mezzo in uno fresco corrispondente alle cellule da trasdure. Semina le cellule da tradursi in una piastra di 6 pozze al fine di ottenere una confluenza del 10-20% il giorno dopo (il giorno di inizio della trasduzione).
- Giorno 2: 24 h dopo la trasfezione, recuperare il mezzo contenente particelle lentivirali e filtrare utilizzando filtri 0,45 m. Se necessario, aggiungere un nuovo mezzo a questo punto al fine di produrre un secondo lotto di lentivirus. Sostituire il mezzo di cellule da tradur (confluenza del 10-20%) da quello contenente lentivirus.
NOTA: Il mezzo lentivirale può essere mantenuto a 4 gradi centigradi per diversi giorni prima della trasduzione o immagazzinato a -80 gradi centigradi per mesi. - Incubare le cellule con lentivirus tra 24 h a 72 h in un'incubatrice standard (37 , 5% CO2), quindi cambiare il mezzo per uno standard fresco. Se possibile, controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio fluorescente invertito per valutare l'efficienza della trasduzione: percentuale di cellule che esprimono e relativo livello di espressione per cellula. Se non viene rilevata alcuna fluorescenza, attendere altri 2-3 giorni poiché l'espressione può richiedere più tempo a seconda del tipo di cellule da tradursi.
- Se il controllo GFP è positivo, far crescere tutte le cellule fino ad avere un controllo di espressione di 6HF-Ubl da immunofluorescenza e macchie occidentali utilizzando anticorpi anti-Bandiera.
2. Doppia purificazione delle proteine modificate
NOTA: Buffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Buffer 2: 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerol, pH 8.0.
Buffer 3: 100 mM NH4HCO3, pH 8.0.
- Lisi cellulare: Una volta pronti, lavare i piatti di coltura almeno una volta con la salina tampone di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) e procedere al lisi cellulare o, in alternativa, il congelamento del flash nel liquido N2 e conservare a -80 gradi centigradi. Per il lisi, aggiungere 2 mL di Buffer 1 per un piatto di 15 cm a RT. Utilizzare un raschietto cellulare per recuperare tutti i lismi in tubi di centrifugazione conicale da 50 mL (volume finale di circa 20 mL).
- Sonicare i lisati tre volte per 30 s separati da una pausa di 1 min.
- Centrifugare i lisati sonicati a 15.000 x g per 15 min.
- Trasferire il supernatante in un nuovo tubo utilizzando un colino cellulare (40 m).
- Determinare la concentrazione dei campioni e regolare, se necessario, per ottenere la stessa quantità di proteine e lo stesso volume. Utilizzare una quantità totale di proteine tra 50 e 100 mg (10 piatti con 15 cm di diametro per le cellule MiaPaCa-2).
- Aggiungere le perline Ni2o-NTA, usando 2 gradi di perline per 1 mg di proteine.
- Ruotare a 30 giri/min durante 2,5 h a RT.
- Pellet le perline a 500 x g per 5 min.
- Lavare le perline con 1 mL di Buffer 1, trasferendo i campioni in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, quindi trasferire i tubi sul ghiaccio. Eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
- Lavare due volte con 1 mL di buffer 2 ghiacciato contenente 10 mM di imidazolo.
- Per eluire le proteine legate, aggiungere 600 l of Buffer 2 contenente 250 mM di imidazolo e ruotare per 2 h a 4 gradi centigradi.
- Portare le perline mediante centrifugazione a 500 x g per 1 min. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi pre-raffreddati, da 1,5 mL e aggiungere 50 ll di perline coniugate anti-Bandiera M2.
- Ruotare a 30 giri/ per 2,5 h a 4 gradi centigradi, quindi lavare 2 volte con 500 l of Buffer 2, quindi 2 volte con 500 gradi L di Buffer 3.
- Per l'eluizione finale, aggiungere 100 l di Buffer 3 contenente un peptide Flag a 0,1 g/l e ruotare a 4 gradi centigradi per 1,5 h.
- Centrifuga a 500 x g per 1 min e trasferire i supernatanti a nuovi tubi pre-raffreddati.
- Prendere il 10% (10 l) per caricare su SDS-PAGE ed eseguire una colorazione d'argento del gel per controllare la qualità di purificazione. Se la purificazione sembra buona, analizzare il 90% lasciato da LC-MS/MS.
3. Elaborazione di dati di spettrometria di massa per generare profili di PTM Ub/Ubls e per identificare differenze significative tra di esse
NOTA: I risultati dell'analisi della SM contengono molte informazioni, tra cui il numero totale di peptidi e i valori di area di picco (media dell'area del peptide TOP 310) per ogni proteina identificata in ogni campione. Questi dati possono essere elaborati utilizzando i numeri di conteggio peptide o i valori di area di picco, o entrambi. Per il calcolo con le aree di picco, poiché questi valori sono in genere compresi nell'intervallo di 106, è necessario dividerli per questo ordine prima di applicare le stesse formule di seguito. I risultati ottenuti con entrambe le metodologie di conteggio dovrebbero mostrare una forte correlazione come di solito. Per ogni proteina identificata, utilizzare le seguenti formule in cui:
valori 
di peptidi v1 nel campione di ubiquitina non trattato (ad esempio, Ub - droga)
valori di peptidi v2 nel campione di ubiquitina trattato di Gemcitabine (ad es., Ub - droga)
k1 valori di peptidi nel campione GFP di controllo non trattato (ad esempio, GFP - droga)
k2 valori di peptidi nel campione GFP trattato di Gemcitabine (ad es., GFP e droga).
- Normalizzazione: normalizzare i valori tra le cellule trattate con farmaci e le cellule non trattate per Ubiquitina e GFP utilizzando le seguenti formule. Normalizzato v - V e normalizzato k .
V1-v1. ('''v1') . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V2-v2. (Sezione v1 e n. v2) / (2.
K1k1. (e , k1 , k2 ) / (2. k1) ; K2-k2. (EP1 x k2) / (2. - Rimozione dello sfondo: utilizzando le seguenti formule, sottrarre i valori nel campione di controllo (GFP) dai valori nel campione di ubiquitina per ottenere valori specifici (V'1 e V'2) per ogni proteina identificata in entrambe le condizioni.
V'1-V1-K1 se V1-K1 V'1/0 se V1-K1<0
V'2-V2-K2 se V2-K2'0 ; V'2 x 0 se V2-K2<0 - Variazione (Var) dell'ubiquitazione. Per ottenere un punteggio (tra -100 e 100) per variazioni positive e negative delle PTM indotte da un farmaco, utilizzare la seguente formula in cui la differenza tra valori specifici di campioni trattati e campioni non trattati è divisa per la somma di tutti i valori, compresi quelli in (per penalizzare le proteine identificate anche nella GFP di controllo) e moltiplicare per 100.
Var (V'2-V'1)/(V1,K1,V2,K2) , 100 ; -100 - Fiducia (Conf). Utilizzare la formula seguente per ottenere un valore di confidenza compreso tra 0 e 100%:
Conf ((V1/V2)2/(1/V1/V1/K1/K2) 2 )2) - 100 - 100/(1'V'1'V'2) ; 0 se <0
I valori superiori a 50 sono generalmente considerati sicuri. - Per ottenere una distribuzione più piacevole dei valori di induzione/repressione e considerare entrambi i parametri
di variazione e confidenza, moltiplicare i valori Var e Conf utilizzando la seguente formula in cui V Var e C Conf
(V2>0;(((V2))2)/((10'6);-((V2'C2)'2)/(10'6))
NOTA: Poiché i valori delle aree di picco sono solitamente più accurati del conteggio dei peptidi, è possibile utilizzare software specifico dedicato all'interpretazione di questo tipo di dati come Perseo (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), raccomandazioni d'uso.
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Representative Results
Trasduzione delle cellule di mammiferi di coltura per creare cellule espressi GFP e 6HF-Ub
Per produrre lentivirus che saranno successivamente utilizzati per trasdurre le cellule MiaPaCa-2, le cellule HEK-293T confluenti 70% sono co-trascate con una quantità uguale dei tre vettori, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Dopo 24 ore di produzione, il mezzo contenente particelle lentivirali viene recuperato e filtrato. A questo punto è possibile controllare l'efficienza della trasfezione controllando la fluorescenza verde della GFP che esprime 293T cellule al microscopio invertito. Dovrebbe essere vicino al 100% delle cellule. Le cellule MiaPaCa-2 sono incubate con supernatali lentivirali per 1 o 3 giorni. L'efficacia della trasduzione lentivirale viene prima controllata osservando la fluorescenza GFP delle cellule trasdotte GFP(Figura 1A pannello superiore). Il livello di espressione GFP può variare da una cella all'altra, ma il 100% di esse dovrebbe essere fluorescente. Una volta che questo controllo è fatto, l'espressione di Flag-ubiquitin dovrà anche essere controllata. Questo viene fatto colorando immunofluorescenza utilizzando un anticorpo anti-Bandiera (di solito M2 monoclonale) (Figura 1A pannello inferiore). Questo mostrerà la percentuale di cellule trasdotte, che dovrebbe essere 100% per garantire un'espressione stabile sui futuri passaggi della coltura cellulare. Per controllare il livello di espressione della Flag-ubiquitina esogena, i lisati delle cellule trasdotte vengono analizzati da SDS-PAGE seguiti da western blot con anticorpo anti-Flag (Figura 1B). Entrambe le linee cellulari possono essere congelate.
Purificazione e controllo a due fasi da parte di SDS PAGE e colorazione argento
Una volta che le linee cellulari che esprimono stabili sono state convalidate, sia le cellule GFP che 6HF-ubiquitina vengono amplificate fino a quando non si ottiene abbastanza materiale per procedere con la purificazione in due fasi. Si raccomanda di mantenere un backup di queste linee cellulari come scorte congelate in azoto liquido per essere in grado di scongelarle quando necessario. 36 h prima dell'elaborazione, metà delle cellule (metà GFP e metà 6HF-Ubiquitina) vengono trattate con 10 M di Gemcitabine. Quando sono pronte, le proteine ubiquitinate vengono purificate dalla 6HF-ubiquitina e dalle cellule di controllo GFP, utilizzando il protocollo di purificazione in due fasi (Figura 2A). Il 10% dell'eluizione finale viene utilizzato per controllare la quantità e l'integrità del materiale purificato da SDS-PAGE e colorazione argento del gel (Figura 2B). Le bande di marcatori di peso molecolare possono essere utilizzate per stimare la quantità di proteine ubiquitane purificate. In alternativa, una quantità nota di BSA o qualsiasi altra proteina può essere caricata in una linea del gel per aiutare a quantificare le proteine purificate. Una volta effettuata questa verifica, il restante 90% dei campioni viene analizzato dalla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem per consentire l'identificazione e la semiquantitazione delle proteine purificate.
Identificazione delle proteine ubiquitanate per sottrazione di fondo (campioni GFP)
I dati dell'analisi LC-MS/MS dei campioni forniscono i nomi e le quantificazioni (aree di picco e numero di peptidi osservati) di ciascuna proteina identificata nei campioni GFP e 6HF-Ub. Le proteine che hanno la più alta quantificazione nel campione di ubiquitina rispetto al campione GFP sono più probabili essere quelle realmente ubiquitinate e l'applicazione delle formule descritte nei metodi sopra consente la loro classificazione dando un punteggio di confidenza da 0 a 100% . Le proteine identificate con un punteggio superiore al 50% sono considerate ubiquitinate(Figura 3A).
Questa fase che rimuove fondamentalmente le proteine di fondo (GFP) dai campioni di ubiquitina ha portato all'identificazione di 364 proteine significativamente ubiquitinated (Figura 3B)7. Si noti qui che le proteine identificate con i punteggi più alti sono per lo più già conosciute come principali obiettivi di ubiquitinazione che dimostra l'efficacia di questo metodo di purificazione.
Poi è possibile eseguire un'analisi dell'arricchimento del set genico (GSEA) di queste proteine ubiquitingate al fine di evidenziare i processi biologici in cui sono coinvolti (Figura 3C), le loro funzioni molecolari, il loro compartimento cellulare, o qualsiasi altra categorizzazione dell'ontologia genica. È interessante confrontare questo proteoma oniquitato con il proteoma completo della cellula quando possibile. Infatti, questa analisi rivela il reale contributo di queste proteine ubiquitanate in processi specifici come la traduzione o la proteolisi per esempio (Figura 3C).
Lo scopo principale di questo tipo di esperimento è quello di identificare le alterazioni all'interno del proteoma oniquitato indotto da un trattamento per esempio, qui gemcitabine. Confrontando l'onniquitinome (il proteoma specifico onniacco) in cellule trattate e non trattate utilizzando la formula specifica produce un valore da -100 (repressione dell'ubiquitazione) a 100 dollari (induzione dell'ubiquitazione). Considerando solo i valori inferiori a -50 o superiori a 50 come significativi, sono state identificate un totale di 73 ubiquitinazioni indotte e 29 ubiquizioni represse (Figura 4A). L'analisi GSEA di queste alterazioni dell'ubiquitinazione ha rivelato specifici arricchimenti nei processi di riparazione del DNA o nel ciclo cellulare, e importanti variazioni nei processi metabolici di traduzione e RNA (Figura 4B). Questo risultato è altamente logico poiché la gemcitabina è un analogo di base che blocca la sintesi del DNA e provoca danni al DNA.
Per andare oltre, è anche interessante utilizzare database di proteine interagenti al fine di esplorare e convalidare potenziali reti interagenti formate da alterazioni indotte da gemcitabine dell'ubiquitinazione (Figura 5). Ciò ha portato all'identificazione di reti interagenti funzionali fortemente influenzate dall'aumento o dalla diminuzione dell'ubiquitazione delle proteine coinvolte.
Infine, tra l'ubiquitinazione alterata, alcuni possono comportare proteine di maggiore interesse, a causa delle loro funzioni note o potenziali secondo la letteratura. Quindi, un passo importante è quello di convalidare che ciò che viene osservato dalla spettrometria di massa è reale e affidabile. PcNA era una delle proteine più ubiquitinate al momento del trattamento delle gemcitabine rilevate dall'analisi della spettrometria di massa (Figura 4A). Per verificare che la gemcitabina induca effettivamente l'onniquitazione del PCNA, le cellule MiaPaCa-2 che esprimono 6HF-Ub e GFP sono coltivate, trattate o meno, e soggette alla purificazione Ni-NTA in condizioni di denaturazione o all'immunoprecipitazioni anti-Bandiera seguita da Flag eluizione peptide in condizioni native, risolta su SDS PAGE seguita da macchia occidentale con l'anticorpo corrispondente. Il risultato mostrato nella Figura 6 ha confermato che effettivamente il PCNA è fortemente onniattato in risposta al trattamento delle gemcitabine nelle cellule MiaPaCa-2.
Figura 1: Creazione di linee cellulari stabili che esprimono 6His-Flag-Ubl. (A) Controllo dell'espressione GFP nelle cellule transdotte GFP (pannello superiore) e della 6His-Flag-Ubiquitin by immunofluorescence using anti-Flag (M2) anticorpo come anticorpo primario e alexa-567 anti-tono secondario. DAPI è stato utilizzato per macchiare i nuclei. Barra della scala: 50 m. (B) Controllo dell'espressione 6HisHis-Flag-Ubiquitin in cell lysates by western blot using anti-Flag anticorp (In alternativa, un anticorpo anti-6his può essere usato) a sinistra, e anticorpo anti-ubiquitina, a destra, per confrontare l'espressione di 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) con Ubiquitina endogena (Endo. Ubiq). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Purificazione in due fasi delle proteine ubiquitinate. (A) Rappresentazione schematica della procedura. (B) Il 10% dell'eluizione finale è stato sottoposto a PAGINA SDS seguita da colorazione argento del gel per stimare la quantità e la purezza (rispetto alla GFP) delle proteine isolate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Identificazione delle proteine ubiquitinate (adattate da Bonacci et al. 7). (A) La quantità relativa di peptidi specifici (campione di ubiquitina) e non specifici (campione GFP) per ogni proteina identificata è stata tracciata in funzione dei loro punteggi fiduciosi. Come mostrato, la proporzione di proteine non specifiche rispetto a proteine onniquite diventa troppo importante al di sotto del punteggio di 50. Quindi, solo le proteine identificate con un punteggio superiore a 50 sono considerate significative. (B) Tabella che mostra le 20 migliori proteine ubiquitinate tra le 364-totale identificate. (C) Ripartizione delle proteine ubiquite e proteine totali delle cellule MiaPaCa-2 all'interno dei processi biologici (Valori > 1,5% erano considerati solo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Alterazioni indotte da Gemcitabine dei profili PTM (adattate da Bonacci et al. 7). (A) Elenco delle 20 proteine con il più alto aumento (totale 73) o diminuzione (totale 29) ubiquitinazione al momento del trattamento gemcitabine (Conf: fiducia; Ind: induzione; Rep: repressione). (B) La ripartizione della Gemcitabine ha indotto l'ubiquitinazione alterata all'interno dei processi biologici e il confronto con i non trattati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Interactomi funzionali delle gemcitabine indotte dall'ubiquitinazione alterata. Le potenziali interazioni tra tutte le proteine con l'alterazione dell'ubiquitinazione indotta dalle gemcitabine sono identificate utilizzando un database di interazioni proteina-proteina (STRING: string-db.org). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Convalide biochimiche di interessanti alterazioni dell'ubiquitinazione indotte da gemcitabine. Al fine di convalidare l'accresciuta ubiquitinazione del PCNA dopo il trattamento delle gemcitabine, le cellule che esprimono 6HF-Ubiquitina, trattate o meno con gemcitabine, sono state sottoposte a Nickel pull-down (Ni-NTA) seguito da una macchia anti-PCNA Western. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo sviluppato una metodologia robusta e affidabile per generare profili di proteine modificate dai principali membri della famiglia ubiquitina. Infatti, abbiamo applicato con successo questo protocollo per generare profili di PTM da ubiquitina, e anche da SUMO e Nedd8, e per rilevare alterazioni associate a un trattamento7, in risposta alla sopra espressione o knockdown di un certo gene (dati non cellule che hanno acquisito un fenotipo resistente a diversi farmaci chemioterapici.
Ci sono solo pochi passaggi critici durante la procedura che il manipolatore dovrebbe stare attento con. Al pipettaggio di perline (Ni-NTA o anti-Bandiera accoppiato), è importante risospende a fondo, soprattutto le perline anti-Bandiera poiché sono sospese in un buffer a base di glicerolo viscoso, e per tagliare un po 'la punta della punta per aumentare la sezione. Un'altra precauzione dovrebbe essere seguita è quello di pipette lentamente al fine di evitare l'impilamento di perline. Ulteriori passaggi critici sono l'elusione con imidazolo e poi con Peptide Bandiera. Una siringa Hamilton pulita deve essere utilizzata per recuperare il supernatante dopo l'eluizione per evitare, per quanto possibile la pipettatura delle perline su cui rimangono le proteine non specifiche.
A seconda del tipo di cellula e della quantità di materiale finale richiesto per la spettrometria di massa, il materiale iniziale può essere aumentato o diminuito di conseguenza. Quindi, l'unica regolazione importante risiede nel volume di perline di nichel come dovrebbe essere di 2 -L per 1 mg di proteine in lisato. Può accadere che la quantità di proteine purificate sia troppo bassa. Il livello di espressione di Ub/Ubl etichettato deve essere controllato e, se è troppo basso, le cellule possono essere ri-traducite utilizzando gli stessi lentivirus. In alternativa, è possibile aumentare la quantità di materiale iniziale. A volte, la quantità di materiale purificato non specifico in GFP o nelle cellule parentali è troppo alta. Una soluzione per superare questo problema è aumentare il volume e il numero di lavamenti sia nei passaggi di purificazione Ni-NTA che di bandiera. È anche possibile aumentare la concentrazione di imidazolo in lavamenti con guanidina tampone, fino a 20 mM. Inversamente, non è necessario aumentare la concentrazione di peptide Bandiera nella fase di eluizione finale in quanto non aumenterà l'eluzione. È più importante usare peptidi freschi poiché nel tempo è immagazzinato, anche se immagazzinato a -20 gradi centigradi, l'efficacia del peptide può diminuire.
La limitazione principale di questo protocollo è che è adatto solo per le cellule coltivate perché devono essere trasdotte per esprimere il desiderato etichettato Ubl. Pertanto, qualsiasi studio sui tessuti o campioni tumorali deve essere eseguito utilizzando approcci alternativi come gli arricchimenti di peptidi diGly dopo la digestione della cipessitta11, l'immunoprecipitazioni con anticorpi specifici per l'Ub/Ubl di interesse5, o l'uso di TUBEs6. Tutti questi metodi alternativi sono adatti anche per la loro applicazione nelle cellule coltivate. Hanno il vantaggio di utilizzare i macchinari Endogeni Ub/Ubls. Tuttavia, esistono diversi inconvenienti. Le immunoprecipitazioni sono difficili da eseguire con uno sfondo basso e, come gli approcci TUBEs, le proteine che interagiscono con le proteine modificate e persino il modificatore stesso, non possono essere eliminate, anche se sono stati ottenuti miglioramenti pratici utilizzando condizioni più rigorose. L'arricchimento dei peptidi DiGly è una tecnica molto potente, ma può corrispondere a diversi tipi di PTM. Ad esempio, l'arricchimento diGly da un lisato digerito trypsin identificherà principalmente le proteine ubiquitinate ma anche quelle neddylated, poiché Nedd8 lascia lo stesso residuo diGly firma come ubiquitina fa11.
Un'altra limitazione di questo protocollo è che la presenza del tag 6His-Flag può alterare la normale funzione di Ub/Ubl e la sovraespressione di per sé potrebbe alterare il macchinario. Ciò potrebbe ad esempio ostacolare la generazione di catene di poliubiquitina e favorire la monoubiquitinazione. Tuttavia, poiché sono state identificate sia catene mono multi che poliubiquitina utilizzando questo protocollo, sembra che non sia il caso7. La presenza del tag all'N-terminus impedisce anche la formazione di ubiquitinazione lineare, dove le moieties dell'ubiquitina sono collegate tra loro attraverso la methionina N-terminale dell'ubiquitina. Tuttavia, anche se il 6HF-udiquitin non può essere ubiquitinato al suo primo residuo di Met, ha ancora la capacità di porre fine a questo tipo di catena.
Inoltre, mentre è un vantaggio sostanziale utilizzare lentivirus che consentono la creazione di linee di cellule stabili in una o due settimane, è possibile che non tutte le cellule esprimano il costrutto desiderato. Questo potrebbe non essere un vero problema per la procedura di purificazione fintanto che un numero sufficiente di cellule esprima l'Esogeno Ub/ubl, ma il problema può venire con una coltura a lungo termine poiché in diversi passaggi potrebbe esserci una variazione clonale con arricchimento in celle con meno o nessuna Espressione. Questo inconveniente, tuttavia, può essere facilmente bypassato utilizzando lentivirus contenenti un gene di selezione di resistenza o una proteina fluorescente che può essere utilizzata nella citometria di flusso per selezionare solo le cellule positive.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue Contre le Cancer a HV e MS, e l'ARC (associazione pour la recherche sur le cancer) a PS, INCa (istituto nazionale du cancro) e Canceropole PACA a JI. Lo strumento di spettrometria di massa della Proteomica di Marsiglia (marseille-proteomique.univ-amu.fr) sostenuto da IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, la Cola Cancéropàle PACA, la Provenza-Alpi-C Région, l'Institut Paoli-Calmettes e il Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220-5ML | binds all Flag tagged proteins |
| anti-Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl |
| Cell strainer 40 µm | Falcon | 352350 | to remove floating pellet from guanidine lysed cells |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | F3290 | elute flag tagged proteins from anti-flag beads |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses |
| Lobind tubes | Sigma-Aldrich | Z666491 | avoids absorption of precious material |
| Membrane Filter, 0.45 µm | Millipore | HAWP04700F1 | to filter the lentiviral supernantant |
| Ni-NTA | Qiagen | 30210 | purification of the 6His tag |
References
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