Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Summary

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Abstract

Les modifications post-traductionnelles dépendantes de l'ubiquitine (ubl) des protéines jouent des rôles biologiques fondamentaux de régulation au sein de la cellule en contrôlant la stabilité des protéines, l'activité, les interactions et la localisation intracellulaire. Ils permettent à la cellule de répondre aux signaux et de s'adapter aux changements de son environnement. Les modifications au sein de ces mécanismes peuvent conduire à des situations pathologiques graves telles que les maladies neurodégénératives et les cancers. Le but de la technique décrite ici est d'établir des profils de PTMdépendants dépendants d'ub/ubls, rapidement et exactement, des lignées cellulaires cultivées. La comparaison de différents profils obtenus à partir de différentes conditions permet d'identifier des altérations spécifiques, telles que celles induites par un traitement par exemple. La transduction des cellules médiées lentivirales est effectuée pour créer des lignées cellulaires stables exprimant une version à deux étiquettes (6His et Drapeau) du modificateur (ubiquitine ou ubl comme SUMO1 ou Nedd8). Ces étiquettes permettent la purification de l'ubiquitine et donc des protéines ubiquitinated des cellules. Cela se fait par un processus de purification en deux étapes: Le premier est effectué dans des conditions dénaturantes en utilisant l'étiquette 6His, et le second dans des conditions natives en utilisant l'étiquette drapeau. Cela conduit à un isolement très spécifique et pur des protéines modifiées qui sont ensuite identifiées et semi-quantifiées par chromatographie liquide suivie par la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) technologie. L'analyse informatique facile des données De SP à l'aide du logiciel Excel permet l'établissement de profils PTM en éliminant les signaux d'arrière-plan. Ces profils sont comparés entre chaque condition afin d'identifier des altérations spécifiques qui seront ensuite étudiées plus spécifiquement, à commencer par leur validation par des techniques de biochimie standard.

Introduction

La méthode proposée ici est dédiée à l'étude des PTM médiées par les membres de la famille de l'ubiquitine à partir de cellules de mammifères cultivées afin d'identifier les altérations potentielles associées à une condition spécifique (traitement, différenciation, etc.). Les PTM représentent la dernière étape de la régulation des fonctions des protéines¹. En effet, une fois produites par la machinerie translationnelle, la plupart sinon toutes les protéines subissent différents types de PTM qui modulent leur activité, interactions moléculaires, et emplacement intracellulaire¹. Parmi la pléthore de PTM sont ceux médiés par la famille d'ubiquitine de protéines, l'ubiquitine elle-même et toutes les ubiquitine-likes, ont le potentiel de réguler toutes les protéines intracellulaires ou partiellement cytoplasmiques². Parce qu'elles sont elles-mêmes des protéines, elles peuvent être conjuguées les unes aux autres, formant des chaînes homogènes et hétérogènes de diverses topologies, chacune associée à des fonctions réglementaires spécifiques². Des outils sont nécessaires pour essayer de déchiffrer et de comprendre cette machinerie complexe. Beaucoup d'approches ont été développées dans le monde entier, ayant leurs propres avantages et inconvénients, et ici nous proposons un avec la haute performance adaptée aux cellules cultivées.

Le principal avantage de cette méthode est sa précision. En effet, la pureté des protéines modifiées isolées est fortement améliorée par l'utilisation combinatoire des deux étiquettes (6His et Flag) et les deux étapes-procédure et donc il est beaucoup plus sélectif qu'une seule étiquette fusion Ub/Ubl^3,4. La présence de l'étiquette 6His permet une première étape de purification dans un état totalement dénaturant évitant ainsi toute co-purification des protéines contenant des domaines de liaison d'ubiquitine ou d'autres protéines se liant aux ubiquitinated. Il s'agit d'un problème technique rencontré par plusieurs autres approches basées sur la purification d'affinité des protéomes ubiquitinated utilisant des anticorps spécifiques⁵ ou des éléments de liaison d'ubiquitine de tandem (TUBEs)^6. Fait important, cette technique n'est pas biaisée en faveur de la purification d'un certain type d'ubiquitination, comme cela pourrait être le cas pour d'autres approches, puisque les deux types de mono et différents types de polyubiquitinations ont été identifiés⁷. Par conséquent, une fois trouvé, une altération de l'ubiquitination devra être étudiée plus en détail par des approches biochimiques standard afin d'identifier le type exact d'ubiquitination impliquée.

Enfin, un autre avantage technique de ce protocole est l'utilisation de lentivirus, qui crée facilement et rapidement des lignées cellulaires stables exprimant avec un niveau raisonnable d'expressions de modificateur marqué sans interférer avec le comportement cellulaire normal.

Alors qu'un rôle important de l'ubiquitination est de cibler les protéines pour la dégradation protéasomale, il est maintenant connu qu'il a de nombreuses autres propriétés réglementaires pour potentiellement la plupart des protéines intracellulaires ou partiellement intracellulaires¹. Le nombre de ces fonctions est encore augmenté par l'existence de nombreuses ubiquitines comme les protéines, formant une famille de protéines régulant presque tous les mécanismes cellulaires¹. Leurs altérations peuvent avoir un impact drastique sur la biologie cellulaire et peuvent conduire ou participer à des situations pathologiques⁸, comme le cancer⁹. Par conséquent, des outils sont nécessaires pour explorer ce vaste paysage et identifier les altérations associées à une condition pathologique qui pourrait servir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Ce protocole est dédié aux cellules en culture car elles doivent être transduisées pour exprimer exogène marqué Ub / Ubl. Une fois créées, ces lignées cellulaires stables peuvent être utilisées pour générer des profils Ubl à partir de la culture en 2D ou 3D ou xénogreffes, prolongeant ainsi l'horizon des différents modèles expérimentaux qui peuvent être appliqués pour étudier les profils ptMs.

Protocol

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant 6His-Flag-Ubl

REMARQUE : Co-transfection des cellules HEK-293T avec pCCL-6HF-Ubl, pVSVG et delta-Helper.

1. Jour 0 : Seed 293T cells in a 6-well plate to obtain 50-70% confluence the day after.
2. Jour 1 : Co-transfect 50-70% cellules confluentes avec un mélange de 1 g de pCCL-6HF-Ubl ou pCCL-GFP, 1 g de pVSVG et 1 g de vecteurs delta-Helper, à l'aide d'un réactif de transfection et d'un protocole pour la production de lentivirus. Après 6 h de transfection, changer le milieu pour un milieu frais correspondant aux cellules à transduire. Ensemencez les cellules à transduire dans une plaque de 6 puits afin d'obtenir une confluence de 10-20% le lendemain (le jour du démarrage de la transduction).
3. Jour 2: 24 h après la transfection, récupérer le milieu contenant des particules lentivirales et filtrer à l'aide de filtres de 0,45 m. Si nécessaire, ajouter le milieu frais à ce point afin de produire un deuxième lot de lentivirus. Remplacer le milieu des cellules à transduire (10-20% de confluence) par celui contenant des lentivirus.
   REMARQUE : Le milieu lentiviral peut être maintenu à 4 oC pendant plusieurs jours avant la transduction ou stocké à -80 oC pendant des mois.
4. Incuber les cellules avec des lentivirus entre 24 h à 72 h dans un incubateur standard (37 oC, 5 % de CO₂), puis changer le milieu pour un standard frais. Si possible, vérifiez l'expression GFP à l'aide d'un microscope fluorescent inversé pour évaluer l'efficacité de la transduction : pourcentage de cellules exprimantes et niveau relatif d'expression par cellule. Si aucune fluorescence n'est détectée, attendez 2-3 jours supplémentaires car l'expression peut prendre plus de temps selon le type de cellules à transduire.
5. Si le contrôle de GFP est positif, cultivez toutes les cellules jusqu'à avoir assez pour exécuter un contrôle d'expression de 6HF-Ubl par immunofluorescence et tache occidentale utilisant l'anticorps anti-Flag.

2. Double purification des protéines modifiées

REMARQUE: Buffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampon 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerol, pH 8.0.
Tampon 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Lyse cellulaire : Une fois prêt, lavez la vaisselle de culture au moins une fois à l'alin salin tamponné par le phosphate (PBS) à température ambiante (RT) et passez à la lyse cellulaire ou, alternativement, au gel flash dans le liquide N₂ et entreposez-le à -80 oC. Pour la lyse, ajouter 2 ml de tampon 1 par plat de 15 cm à RT. Utilisez un grattoir cellulaire pour récupérer tous les lysates dans des tubes coniques de centrifugeuse de 50 ml (volume final d'environ 20 ml).
2. Sonicate les lysates trois fois pour 30 s séparés par une pause de 1 min.
3. Centrifugeles les lysates sonicated à 15.000 x g pendant 15 min.
4. Transférer le supernatant dans un nouveau tube à l'aide d'une passoire cellulaire (40 m).
5. Déterminer la concentration des échantillons et ajuster, si nécessaire, pour obtenir la même quantité de protéines et le même volume. Utilisez une quantité totale de protéines entre 50 et 100 mg (10 plats de 15 cm de diamètre pour les cellules MiaPaCa-2).
6. Ajouter les perles Ni^2MD-NTA,en utilisant 2 ll de perles par 1 mg de protéines.
7. Tourner à 30 tr/min pendant 2,5 h à RT.
8. Pelleter les perles à 500 x g pendant 5 min.
9. Laver les perles avec 1 ml de tampon 1, transférer les échantillons à un tube microcentrifuge de 1,5 ml, puis transférer les tubes sur la glace. Effectuer toutes les prochaines étapes sur la glace ou à 4 oC.
10. Laver deux fois avec 1 ml de tampon 2 glacé contenant 10 mm d'imidazole.
11. Pour éliuer les protéines liées, ajouter 600 l de tampon 2 contenant 250 mM d'imidazole et faire pivoter pendant 2 h à 4 oC.
12. Pelleter les perles par centrifugation à 500 x g pendant 1 min. Transférer les supernatants dans de nouveaux tubes pré-refroidis de 1,5 mL et ajouter 50 l de perles conjuguées d'anticorps M2 anti-Flag.
13. Tourner à 30 tr/min pendant 2,5 h à 4 oC, puis laver 2 fois avec 500 l de tampon 2, puis 2 fois avec 500 oL de tampon 3.
14. Pour l'élution finale, ajouter 100 oL de tampon 3 contenant un peptide de drapeau à 0,1 g/L et tourner à 4 oC pendant 1,5 h.
15. Centrifugeuse à 500 x g pendant 1 min et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes pré-refroidis.
16. Prenez 10 % (10 l) pour charger sur SDS-PAGE et effectuez une coloration argentée du gel pour contrôler la qualité de purification. Si la purification semble bonne, analysez les 90% laissés par LC-MS/MS.

3. Traitement des données de spectrométrie de masse pour générer des profils de PTM Ub/Ubls et identifier des différences significatives entre eux

REMARQUE : Les résultats de l'analyse de la SP contiennent de nombreuses informations, y compris le nombre total de peptides ainsi que les valeurs de la zone de pointe (moyenne de la zone peptide TOP 3¹⁰) pour chaque protéine identifiée dans chaque échantillon. Ces données peuvent être traitées à l'aide des nombres de nombres de peptides ou des valeurs de zone de pointe, ou les deux. Pour le calcul avec les zones de pointe, parce que ces valeurs sont généralement de l'ordre de 10⁶, il est nécessaire de les diviser par cet ordre avant d'appliquer les mêmes formules que ci-dessous. Les résultats obtenus avec les deux méthodologies de comptage devraient montrer une forte corrélation comme il le fait habituellement. Pour chaque protéine identifiée, utilisez les formules suivantes où :
v1 peptides values in non-treated ubiquitin sample (p. ex., Ub - drug)
v2 peptides values in Gemcitabine treated ubiquitin sample (p. ex., Ub et drug)
k1 peptides values in non-treated control GFP sample (p. ex., GFP - drug)
k2 peptides valeurs dans Gemcitabine traité échantillon de contrôle GFP (par exemple, GFP - médicament).

1. Normalisation : Normaliser les valeurs entre les cellules traitées par médicaments et les cellules non traitées pour l'ubiquitine et le GFP en utilisant les formules suivantes. Normalisé v et V et k normalisé.
   V1 v1. (v1 ' v2) / (2. ' v1) ; V2 v2. (v1 v2) / (2. v2)
   K1k1. (k1 k2) / (2. k1) ; K2k2. (k1 k2) / (2. k2)
2. Enlèvement de l'arrière-plan : À l'aide des formules suivantes, soustrayez les valeurs dans l'échantillon témoin (GFP) des valeurs de l'échantillon d'ubiquitine afin d'obtenir des valeurs spécifiques (V'1 et V'2) pour chaque protéine identifiée dans les deux conditions.
   V'1-V1-K1 si V1-K1-0; V'1-0 si V1-K1-lt;0
   V'2-V2-K2 si V2-K2 0; V'2 '0 si V2-K2'lt;0
3. Variation (Var) de l'ubiquitination. Pour obtenir un score (entre -100 et 100 euros) pour les variations positives et négatives des PTM induites par un médicament, utilisez la formule suivante dans laquelle la différence entre les valeurs spécifiques des échantillons traités et non traités est divisée par la somme de toutes les valeurs, y compris celles (pour pénaliser les protéines également identifiées dans le contrôle du GFP), et multiplier par 100.
   Var (V'2-V'1)/(V1'K1'V2'K2)100; -100 lt;Var-lt;100;
   Les variations inférieures à -50 (répression du PTM) ou au-dessus de 50 (induction du PTM) sont généralement considérées comme significatives.
4. Confiance (Conf). Utilisez la formule suivante pour obtenir une valeur de confiance comprise entre 0 et 100 %:
   Conf ((V1'V2)²/(1'V1'V2'K1'K2)²) 100 - 100/(1'V'1'V'2'2) ; 0 si le lt;0
   Les valeurs supérieures à 50 sont généralement considérées comme confiantes.
5. Pour obtenir une plus belle répartition des valeurs d'induction/répression et tenir compte des paramètres de variation et de confiance, multipliez les valeurs Var et Conf selon la formule suivante où V Var et C Conf
   'SI(V2'gt;0;((V2'C2) '2)/(10'6);-((V2'C2) '2)/(10'6)))
   REMARQUE : Comme les valeurs de zone de pointe sont généralement plus précises que le comptage des peptides, il est possible d'utiliser des logiciels spécifiques qui sont dédiés à l'interprétation de ce type de données telles que Persée (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), suivant recommandations d'utilisation.

Representative Results

Transduction des cellules mammifères de culture pour créer des cellules exprimant gFP et 6HF-Ub
Pour produire des lentivirus qui seront utilisés plus tard pour transduire les cellules MiaPaCa-2, 70 % des cellules HEK-293T confluentes sont cotranscérées avec une quantité égale des trois vecteurs, pCCL-6HF-Ubiquitin ou GFP/Delta-Helper/pvSvG. Après 24 h de production, le milieu contenant des particules lentivirales est récupéré et filtré. Il est possible à ce stade de contrôler l'efficacité de la transfection en vérifiant la fluorescence verte de GFP exprimant des cellules 293T sur un microscope inversé. Il devrait être près de 100% des cellules. Les cellules MiaPaCa-2 sont incubées avec un supernatant lentiviral pendant 1 à 3 jours. L'efficacité de la transduction lentivirale est d'abord contrôlée en examinant la fluorescence GFP des cellules transductrices gFP(figure 1Un panneau supérieur). Le niveau d'expression GFP peut varier d'une cellule à l'autre, mais 100% d'entre eux devraient être fluorescents. Une fois ce contrôle effectué, l'expression de Flag-ubiquitin devra également être contrôlée. Ceci est fait par la coloration d'immunofluorescence utilisant un anticorps anti-Flag (habituellement monoclonal de M2)(figure 1Un panneau inférieur). Cela montrera le pourcentage de cellules transductées, qui devrait être de 100% pour garantir une expression stable sur les futurs passages de la culture cellulaire. Afin de contrôler le niveau d'expression de l'exogène Flag-ubiquitin, les lysates des cellules transductées sont analysés par SDS-PAGE suivi s'agit de tache occidentale avec anticorps anti-flag (Figure 1B). Les deux lignées cellulaires peuvent être congelées.

Deux étapes de purification et de contrôle par SDS PAGE et coloration argentée
Une fois que les lignées cellulaires stables exprimant esquissées ont été validées, les cellules GFP et 6HF-ubiquitin sont amplifiées jusqu'à ce que suffisamment de matière soit obtenue afin de procéder à la purification en deux étapes. Il est recommandé de conserver une sauvegarde de ces lignées cellulaires sous forme de bouillon congelé dans de l'azote liquide afin de pouvoir les décongeler en cas de besoin. 36 h avant le traitement, la moitié des cellules (moitié GFP et moitié 6HF-Ubiquitin) sont traitées avec 10 M de Gemcitabine. Lorsqu'elles sont prêtes, les protéines ubiquitinated sont purifiées à partir de 6HF-ubiquitine et de cellules témoins GFP, en utilisant le protocole de purification en deux étapes (Figure 2A). 10 % de l'élution finale est utilisée pour contrôler la quantité et l'intégrité des matériaux purifiés par SDS-PAGE et la coloration argentée du gel (Figure 2B). Des bandes de marqueurs de poids moléculaires peuvent être utilisées pour estimer la quantité de protéines exécifiées ubiquitinated. Alternativement, une quantité connue de BSA ou toute autre protéine peut être chargée dans une ligne du gel pour aider à quantifier les protéines purifiées. Une fois cette vérification effectuée, les 90 % restants d'échantillons sont analysés par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse en tandem pour permettre l'identification et la semi-quantitation des protéines purifiées.

Identification des protéines ubiquitinated par soustraction de fond (échantillons de GFP)
Les données de l'analyse LC-MS/MS des échantillons donnent les noms et les quantifications (zones de pointe et nombre de peptides observés) de chaque protéine identifiée dans les échantillons de GFP et 6HF-Ub. Les protéines ayant la plus forte quantification dans l'échantillon d'ubiquitine par rapport à l'échantillon de GFP sont les plus susceptibles d'être ceux vraiment ubiquitinated et l'application des formules décrites dans les méthodes ci-dessus permet leur classification en donnant un score de confiance de 0 à 100% . Les protéines identifiées avec un score supérieur à 50 % sont considérées comme des protéines ubiquitinated (figure 3A).

Cette étape qui élimine essentiellement les protéines de fond (GFP) des échantillons d'ubiquitine a conduit à l'identification de 364 protéines significativement ubiquitinated (Figure 3B)⁷. Notez ici que les protéines identifiées avec les scores les plus élevés sont pour la plupart déjà connues comme cibles principales de l'ubiquitination qui prouve l'efficacité de cette méthode de purification.

Ensuite, il est possible d'effectuer une analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) de ces protéines ubiquitinated afin de mettre en évidence les processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués (Figure 3C), leurs fonctions moléculaires, leur compartiment cellulaire, ou toute autre catégorisation de l'ontologie génique. Il est intéressant de comparer ce protéome ubiquitinated avec le protéome complet de la cellule si possible. En effet, cette analyse révèle la contribution réelle de ces protéines ubiquitinated dans des processus spécifiques tels que la traduction ou la protéolyse par exemple (Figure 3C).

Le but principal de ce type d'expérience est d'identifier les altérations dans le protéome ubiquitinated induite par un traitement par exemple, ici gemcitabine. En comparant l'ubiquitinome (le protéome spécifique ubiquitinated) dans les cellules traitées et non traitées utilisant la formule spécifique donne une valeur de -100 (répression de l'ubiquitination) à 100 (induction de l'ubiquitination). Si l'on considère que seules les valeurs inférieures à -50 ou au-dessus de 50 euros sont significatives, un total de 73 ubiquitinations induites et 29 ubiquitinations réprimées ont été identifiés (figure 4A). L'analyse de gSEA de ces altérations de l'ubiquitination a indiqué des enrichissements spécifiques dans des processus de réparation d'ADN ou du cycle cellulaire, et des variations importantes dans les processus métaboliques de traduction et d'ARN(figure 4B). Ce résultat est très logique puisque la gemcitabine est un analogue de base qui bloque la synthèse de l'ADN et provoque des dommages à l'ADN.

Pour aller plus loin, il est également intéressant d'utiliser des bases de données de protéines en interaction afin d'explorer et de valider les réseaux d'interaction potentiels formés par des altérations induites par la gemcitabine de l'ubiquitination (Figure 5). Ceci a mené à l'identification des réseaux fonctionnels d'interaction fortement affectés par l'ubiquitination accrue ou diminuée des protéines impliquées.

Enfin, parmi l'ubiquitination altérée, certains peuvent impliquer des protéines d'intérêt le plus élevé, en raison de leurs fonctions connues ou potentielles selon la littérature. Par conséquent, une étape importante est de valider que ce qui est observé par la spectrométrie de masse est réel et digne de confiance. Le PCNA était l'une des protéines les plus ubiquitinated sur le traitement de gemcitabine détecté par l'analyse de spectrométrie de masse (figure 4A). Pour vérifier que la gemcitabine induit en effet l'ubiquitination de PCNA, les cellules MiaPaCa-2 exprimant 6HF-Ub et GFP sont cultivées, traitées ou non, et soumises à la purification Ni-NTA dans des conditions dénaturantes ou à l'immunoprécipitation anti-Flag suivie par le drapeau l'élution de peptide dans les conditions indigènes, résolue sur sDS PAGE suivie de la tache occidentale avec l'anticorps correspondant. Le résultat montré dans la figure 6 a confirmé qu'en effet PCNA est fortement ubiquitinated en réponse au traitement de gemcitabine dans les cellules de MiaPaCa-2.

Figure 1 : Établissement de lignées cellulaires stables exprimant 6His-Flag-Ubl. (A) Contrôle de l'expression gFP dans les cellules transdûs GFP (panneau supérieur) et de 6His-Flag-Ubiquitin par immunofluorescence utilisant l'anticorps anti-Flag (M2) comme anticorps secondaire primaire et alexa-567 anti-souris secondaire. DAPI a été utilisé pour tacher les noyaux. Barre d'échelle : 50 m. (B) Contrôle de l'expression 6His-Flag-Ubiquitin dans les lysates cellulaires par tache occidentale utilisant l'anticorps anti-Flag (Alternativement, un anticorps anti-6his peut être employé) sur la gauche, et l'anticorps anti-ubiquitin, sur la droite, pour comparer l'expression de 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) avec endogène Ubiquitin (Endo. Ubiq). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Purification en deux étapes des protéines ubiquitinated. (A) Représentation schématique de la procédure. (B) 10 % de l'élution finale a été soumise à la PAGE SDS suivie d'une coloration argentée du gel afin d'estimer la quantité et la pureté (par rapport au GFP) des protéines isolées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Identification des protéines ubiquitinated (adaptée de Bonacci et al. ⁷). (A) La quantité relative de peptides spécifiques (échantillon d'ubiquitine) et non spécifiques (échantillon de GFP) pour chaque protéine identifiée a été tracée en fonction de leurs scores confiants. Comme nous l'avons montré, la proportion de protéines non spécifiques par rapport aux protéines ubiquitinated devient trop importante en dessous du score de 50. Par conséquent, seules les protéines identifiées avec un score supérieur à 50 sont considérées comme significatives. (B) Tableau montrant les 20 meilleures protéines ubiquitinated parmi les 364-total identifiés. (C) Repartition des protéines ubiquitinated et des protéines totales des cellules de MiaPaCa-2 dans les processus biologiques (Valeurs 'gt; 1.5% ont été considérés seulement). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Modifications induites par la gemcitabine des profils PTM (adaptées de Bonacci et coll. ⁷). (A) Liste des 20 protéines ayant le plus élevé augmenté (total 73) ou diminué (total 29) ubiquitination sur le traitement de gemcitabine (Conf : confiance ; Ind: induction; Rép: répression). (B) La répartition de la Gemcitabine induite l'ubiquitination altérée dans les processus biologiques et la comparaison avec non-traité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Les interactomes fonctionnels de gemcitabine ont induit l'ubiquitination altérée. Les interactions potentielles entre toutes les protéines avec l'altération induite par la gemcitabine de l'ubiquitination sont identifiées à l'aide d'une base de données d'interactions protéines-protéines (STRING : string-db.org). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Validations biochimiques d'altérations intéressantes induites par la gemcitabine de l'ubiquitination. Afin de valider l'ubiquitination accrue de PCNA après traitement de gemcitabine, les lysates des cellules exprimant 6HF-Ubiquitin, traités ou pas avec la gemcitabine, ont été soumis au nickel pull-down (Ni-NTA) suivi de la tache occidentale anti-PCNA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Nous avons développé une méthodologie robuste et fiable pour générer des profils de protéines modifiées par les principaux membres de la famille de l'ubiquitine. En effet, nous avons appliqué avec succès ce protocole pour générer des profils de PTM par ubiquitine, mais aussi par SUMO et Nedd8, et pour détecter les altérations associées à un traitement⁷, en réponse à la surexpression ou à l'élimination d'un certain gène (données non montré) et dans les cellules qui ont acquis un phénotype résistant à divers médicaments chimiothérapeutiques.

Il n'y a que peu d'étapes critiques au cours de la procédure que le manipulateur doit être prudent avec. Lors de la pipetting des perles (Ni-NTA ou anti-Flag couplé), il est important de les resuspendre à fond, en particulier les perles anti-Flag depuis sont suspendus dans un tampon visqueux à base de glycérol, et de couper un peu l'extrémité de la pointe pour augmenter la section. Une autre précaution à prendre est de pipette lentement afin d'éviter l'empilement des perles. D'autres étapes critiques sont l'élution avec l'imidazole, puis avec le peptide de drapeau. Une seringue Hamilton propre doit être utilisée pour récupérer le supernatant après l'élution pour éviter, autant que possible pipetting des perles sur lesquelles les protéines non spécifiques restent.

Selon le type de cellule et la quantité de matériau final nécessaire pour la spectrométrie de masse, le matériau de départ peut être augmenté ou diminué en conséquence. Ensuite, le seul ajustement important réside dans le volume de perles de nickel car il devrait être de 2 L par 1 mg de protéines dans le lysate. Il peut arriver que la quantité de protéines purifiées soit trop faible. Le niveau d'expression de l'Ub/Ubl étiqueté doit être contrôlé et, s'il est trop bas, les cellules peuvent être re-transdulées en utilisant les mêmes lentivirus. Alternativement, il est possible d'augmenter la quantité de matériel de départ. Parfois, la quantité de matériel purifié non spécifique dans les cellules GFP ou parentales est trop élevée. Une solution pour surmonter ce problème est d'augmenter le volume et le nombre de lavages à la fois Ni-NTA et les étapes de purification du drapeau. Il est également possible d'augmenter la concentration d'imidazole dans les lavages avec tampon de guanidine, jusqu'à 20 mM. Inversement, il n'est pas nécessaire d'augmenter la concentration de peptide du drapeau dans l'étape finale d'élution car il n'augmentera pas l'élution. Il est plus important d'utiliser du peptide frais car au fil du temps, même s'il est stocké à -20 oC, l'efficacité du peptide peut diminuer.

La principale limitation de ce protocole est qu'il ne convient qu'aux cellules cultivées parce qu'elles doivent être transdulées pour exprimer l'Ubl étiqueté souhaité. Par conséquent, toute étude sur les tissus ou les échantillons de tumeur doit être effectuée en utilisant des approches alternatives telles que les enrichissements peptides diGly après la digestion trypsine¹¹, immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques à l'Ub / Ubl d'intérêt⁵, ou l'utilisation de TUBEs⁶. Toutes ces méthodes alternatives sont également adaptées à leur application dans les cellules cultivées. Ils ont l'avantage d'utiliser la machinerie endogène Ub/Ubls. Cependant, plusieurs inconvénients existent. Les immunoprécipitations sont difficiles à effectuer avec un faible fond et, comme les approches TUBEs, les protéines interagissant avec les protéines modifiées, et même le modificateur lui-même, ne peuvent pas être éliminés, même si des améliorations pratiques ont été obtenues en utilisant conditions plus strictes. L'enrichissement des peptides DiGly est un technicien très puissant, mais peut correspondre à différents types de PTM. Par exemple, l'enrichissement diGly d'un lysate dipéicopique identifiera principalement les protéines ubiquitinated mais également neddylated, car Nedd8 laisse la même signature de diGly restante que l'ubiquitin fait¹¹.

Une autre limitation de ce protocole est que la présence de l'étiquette 6His-Flag peut modifier la fonction normale de ub/Ubl et la surexpression par elle-même pourrait modifier la machinerie. Cela pourrait par exemple entraver la génération de chaînes de polyubiquitine et favoriser la monoubiquitination. Cependant, puisque les chaînes mono multi et polyubiquitine ont été identifiées à l'aide de ce protocole, il semble que ce n'est pas le cas⁷. La présence de l'étiquette au N-terminus empêche également la formation de l'ubiquitination linéaire, où les moieties ubiquitine sont reliées entre elles par l'intermédiaire de la méthionine N-terminale de l'ubiquitine. Cependant, même si 6HF-udiquitin ne peut pas être ubiquitinated sur son premier résidu de Met, il a toujours la capacité de mettre fin à ce genre de chaîne.

En outre, alors que c'est un avantage substantiel d'utiliser des lentivirus qui permet la création de lignées de cellules stables en une ou deux semaines, il est possible que toutes les cellules n'expriment pas la construction souhaitée. Ce n'est peut-être pas un vrai problème pour la procédure de purification tant que suffisamment de cellules expriment l'ub/ubl exogène, mais le problème peut venir avec la culture à long terme car sur plusieurs passages il pourrait y avoir une variation clonale avec l'enrichissement dans les cellules avec moins ou pas Expression. Cet inconvénient, cependant, peut être facilement contourné en utilisant des lentivirus contenant soit un gène de sélection de résistance ou une protéine fluorescente qui peut être utilisé dans la cytométrie de flux pour sélectionner uniquement les cellules positives.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag