Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Summary

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Abstract

Ubiquitin (UB) en ubiquitin-achtige (UBL) afhankelijke post-translationele modificaties van eiwitten spelen fundamentele biologische regelgevende rollen binnen de cel door het beheersen van de stabiliteit van het eiwit, activiteit, interacties en intracellulaire lokalisatie. Ze stellen de cel in staat om te reageren op signalen en zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving. Veranderingen binnen deze mechanismen kunnen leiden tot ernstige pathologische situaties zoals neurodegeneratieve ziekten en kankers. Het doel van de hier beschreven techniek is om UB/ubls afhankelijke PTMs-profielen, snel en nauwkeurig, uit gekweekte cellijnen vast te stellen. De vergelijking van verschillende profielen die uit verschillende omstandigheden zijn verkregen, maakt het mogelijk specifieke veranderingen te identificeren, zoals die welke worden veroorzaakt door bijvoorbeeld een behandeling. Lentivirale gemedieerde celtransductie wordt uitgevoerd om stabiele cellijnen te creëren die een twee-tags (6His en Flag) versie van de modifier uitdrukken (ubiquitin of een UBL zoals SUMO1 of Nedd8). Deze tags staan de zuivering van ubiquitine en dus van alomtegenwoordige eiwitten uit de cellen toe. Dit wordt gedaan door middel van een twee stappen zuiveringsproces: de eerste wordt uitgevoerd in denaturerende omstandigheden met behulp van de 6His tag, en de tweede in inheemse omstandigheden met behulp van de vlag tag. Dit leidt tot een zeer specifieke en zuivere isolatie van gemodificeerde eiwitten die vervolgens worden geïdentificeerd en semi-gekwantificeerd door vloeistofchromatografie, gevolgd door tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) technologie. Eenvoudige informatica analyse van MS-gegevens met behulp van Excel-software maakt het mogelijk PTM-profielen te creëren door achtergrond signalen te elimineren. Deze profielen worden vergeleken tussen elke aandoening om specifieke veranderingen te identificeren die dan specifieker bestudeerd zullen worden, te beginnen met hun validering door standaard biochemie technieken.

Introduction

De hier voorgestelde methode is gewijd aan het bestuderen van Ptm's gemedieerd door de ubiquitine familieleden uit gekweekte zoogdiercellen om mogelijke veranderingen in verband met een specifieke aandoening te identificeren (behandeling, differentiatie, enz.). Ptm's vertegenwoordigen de laatste stap in de regulering van de functies van eiwitten¹. Inderdaad, eenmaal geproduceerd door de translationele machines, de meeste zo niet alle eiwitten ondergaan verschillende soorten Ptm's die hun activiteit moduleren, moleculaire interacties, en intracellulaire locatie¹. Onder de overvloed aan Ptm's zijn degenen die worden bemiddeld door de ubiquitine familie van eiwitten, ubiquitine zelf en alle ubiquitine-likes, hebben het potentieel om alle intracellulaire of gedeeltelijk cytoplasmische eiwitten reguleren². Omdat ze zelf eiwitten zijn, kunnen ze aan elkaar worden geconjugeerd, en vormen homogene en heterogene ketens van verschillende topologieën, elk geassocieerd met specifieke regelgevende functies². Tools zijn nodig om te proberen om deze complexe machines te ontcijferen en te begrijpen. Veel benaderingen werden wereldwijd ontwikkeld, met hun eigen voor-en nadelen, en hier stellen we een met hoge prestaties geschikt voor gekweekte cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is de nauwkeurigheid. Inderdaad, de zuiverheid van geïsoleerde gemodificeerde eiwitten wordt sterk verbeterd door het combinatorische gebruik van de twee tags (6his en vlag) en de twee stap-procedure en daarom is het veel selectiever dan een enkele tag Fusion UB/UBL^3,4. De aanwezigheid van de 6His-tag maakt een eerste stap van zuivering mogelijk in een volledig denaturerende aandoening, waardoor elke co-zuivering van eiwitten die ubiquitine-bindende domeinen of andere eiwitten bevatten die aan de alomtegenwoordige stoffen binden, wordt vermeden. Dit is een technisch probleem dat wordt ondervonden door verschillende andere benaderingen op basis van affiniteits zuivering van alomtegenwoordige proteomes met behulp van specifieke antilichamen⁵ of tandem ubiquitine bindings elementen (buizen)⁶. Belangrijk is dat deze techniek niet bevooroordeeld is ten gunste van de zuivering van een bepaald type Ubiquitination, omdat het voor sommige andere benaderingen het geval zou kunnen zijn, omdat zowel mono als verschillende soorten polyubiquitinaties werden geïdentificeerd⁷. Als gevolg hiervan zal een wijziging van ubiquitatie in meer details moeten worden bestudeerd door standaard biochemische benaderingen om de exacte soort alomtegenwoordige activiteiten te identificeren.

Tot slot, een ander technisch voordeel van dit protocol is het gebruik van lentivirussen, dat gemakkelijk en snel creëert stabiele uitdrukken cellijnen met redelijke niveau van expressies van Tagged modifier zonder interfereren met de normale cellulaire gedrag.

Overwegende dat een belangrijke rol van ubiquitisatie is om eiwitten te richten op proteasomale afbraak, het is nu bekend dat het vele andere regulatoire eigenschappen heeft voor potentieel meest intracellulaire of gedeeltelijk intracellulaire eiwitten¹. Het aantal van deze functies wordt verder versterkt door het bestaan van veel ubiquitine zoals eiwitten, het vormen van een familie van eiwitten die bijna elke cel mechanismen reguleren¹. Hun wijzigingen kunnen drastische gevolgen hebben voor de celbiologie en kunnen leiden of deelnemen aan pathologische situaties⁸, zoals kanker⁹. Daarom zijn gereedschappen nodig om dit uitgestrekte landschap te verkennen en de veranderingen te identificeren die gepaard gaan met een pathologische aandoening die als nieuwe therapeutische doelen kan dienen.

Dit protocol is gewijd aan cellen in de cultuur, omdat ze moeten worden getransduceerde om exogene Tagged UB/UBL uit te drukken. Eenmaal gemaakt, kunnen deze stabiele cellijnen worden gebruikt om UBL-profielen te genereren van cultuur in 2D of 3D of xenografts, waardoor de horizon van de verschillende experimentele modellen die kunnen worden toegepast om PTMs-profielen te bestuderen, wordt verlengd.

Protocol

1. generatie van stabiele cellijnen uitdrukken 6His-vlag-UBL

Opmerking: Co-transfectie van HEK-293T cellen met pCCL-6HF-UBL, pVSVG en Delta-helper.

1. Dag 0: zaad 293T cellen in een 6-put plaat te verkrijgen 50-70% samenvloeiing de dag na.
2. Dag 1: Co-transfect 50-70% confluente cellen met een mengsel van 1 μg PCCL-6hf-UBL of PCCL-GFP, 1 μg pvsvg en 1 μg Delta-helper vectoren, met behulp van een transfectie reagens en protocol voor lintvirus productie. Na 6 h van transfectie, verander het medium naar een vers die overeenkomt met cellen te worden transduced. Zaad de cellen worden getransduceerde in een 6 goed plaat om te verkrijgen van een 10-20% samenvloeiing de dag na (de dag van het starten van de transductie).
3. Dag 2:24 h na transfectie, herstel het medium dat lentivirale deeltjes bevat en filtreer met behulp van 0,45 μm filters. Indien nodig, voeg verse medium op dit punt om een tweede partij van lentivirussen te produceren. Vervang het medium van cellen die moeten worden getransduceerde (10-20% samenvloeiing) door degene die lentivirussen bevat.
   Opmerking: Linviraal medium kan gedurende enkele dagen vóór de transductie op + 4 °C worden bewaard of gedurende maanden bij-80 °C worden bewaard.
4. Incuberen de cellen met lentivirussen tussen 24 h tot 72 h in een standaard incubator (37 °C, 5% CO₂) en verander vervolgens het medium voor een nieuwe standaard. Controleer indien mogelijk GFP-expressie met behulp van een omgekeerde fluorescerende Microscoop om de efficiëntie van transductie te evalueren: percentage van het uitdrukken van cellen en het relatieve niveau van expressie per cel. Als er geen fluorescentie wordt gedetecteerd, wacht u nog eens 2-3 dagen, omdat de expressie langer kan duren, afhankelijk van het type cellen dat moet worden transduced.
5. Als GFP-controle positief is, moet u alle cellen laten groeien totdat u genoeg heeft om een expressie controle van 6HF-UBL door immunofluorescentie en Western Blot met Anti-Flag antilichaam uit te voeren.

2. dubbele zuivering van gemodificeerde eiwitten

Opmerking: buffer 1:6 M Guanidinium-HCl, 0,1 M na₂HPO₄/Nah₂PO₄, pH 8,0, 0,5% Triton X-100.
Buffer 2:50 mM NaH₂po₄, 150 mm NaCl, 1% Tween20, 5% glycerol, pH 8,0.
Buffer 3:100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Cellyse: was eenmaal klaar, reinig cultuur gerechten ten minste één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (RT) en ga verder naar cellyse of, als alternatief, vlam in vloeistof N₂ en bewaar bij-80 °c. Voeg voor Lysis 2 mL buffer 1 per 15 cm schaal toe aan RT. gebruik een celscraper om alle lysaten in 50 mL conische centrifugebuizen te recupereren (eindvolume ongeveer 20 mL).
2. Soniceren de lysaten driemaal gedurende 30 sec. gescheiden door een pauze van 1 minuut.
3. Centrifugeer de gesoniceerde lysaten bij 15.000 x g gedurende 15 minuten.
4. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis met behulp van een celzeef (40 μm).
5. Bepaal de concentratie van de monsters en pas zo nodig de hoeveelheid eiwitten en hetzelfde volume aan. Gebruik een totale hoeveelheid eiwit tussen 50 en 100 mg (10 gerechten met een diameter van 15 cm voor MiaPaCa-2 cellen).
6. Voeg ni^{2 +}-NTA kralen toe, met 2 μL kralen per 1 mg eiwit.
7. Roteren bij 30 rpm tijdens 2,5 uur bij RT.
8. Pellet de parels op 500 x g gedurende 5 min.
9. Was de parels met 1 mL buffer 1, breng de monsters over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL en zet de buisjes op het ijs. Voer alle volgende stappen uit op ijs of bij 4 °C.
10. Was tweemaal met 1 mL ijskoude buffer 2 met 10 mM imidazol.
11. Om gebonden eiwitten te elzen, voeg 600 μL buffer 2 met 250 mM imidazol toe en draai voor 2 uur bij 4 °C.
12. Pellet de kralen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 1 min. Breng de supernatanten over naar nieuwe, voorgekoelde, 1,5 ml buizen en voeg 50 μL Anti-Flag m2 antilichaam geconjugeerde kralen toe.
13. Roteer bij 30 rpm voor 2,5 uur bij 4 °C en was 2 keer met 500 μL buffer 2 en 2 keer met 500 μL buffer 3.
14. Voeg voor de uiteindelijke elutie 100 μL buffer 3 met een vlag Peptide van 0,1 μg/μL toe en draai bij 4 °C voor 1,5 uur.
15. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 1 minuut en breng de supernatanten over naar nieuwe voorgekoelde buizen.
16. Neem 10% (10 μL) om te laden op SDS-PAGE en voer een zilver kleuring van de gel uit om de zuiverings kwaliteit te controleren. Als de zuivering er goed uitziet, analyseer dan de 90% achtergelaten door LC-MS/MS.

3. verwerking van massaspectrometrie gegevens om profielen van UB/Ubls Ptm's te genereren en significante verschillen tussen hen te identificeren

Opmerking: resultaten van MS Analysis bevatten veel informatie, waaronder het totale aantal peptiden en de piek gebied waarden (gemiddelde van TOP 3 peptide Area¹⁰) voor elk eiwit geïdentificeerd in elke monsters. Deze gegevens kunnen worden verwerkt met behulp van de peptide Count nummers of de piek gebied waarden, of beide. Voor berekening met piek gebieden, omdat deze waarden meestal in het bereik van 10⁶zijn, is het noodzakelijk om ze te verdelen door deze volgorde voordat ze dezelfde formules als hieronder toepassen. De resultaten die met beide methoden van tellen worden verkregen, moeten een sterke correlatie vertonen, zoals gewoonlijk gebeurt. Gebruik voor elk geïdentificeerd eiwit de volgende formules:
v1 peptiden waarden in niet-behandeld ubiquitine monster (bijv., UB-medicijn)
v2 peptiden waarden in Gemcitabine behandeld ubiquitine monster (bijvoorbeeld UB + drug)
K1 peptiden in niet-behandelde controle GFP-monster (bv., GFP-medicijn)
K2 peptiden waarden in Gemcitabine behandelde controle GFP monster (bijv., GFP + drug).

1. Normalisatie: Normaliseer waarden tussen geneesmiddelen behandelde cellen en onbehandelde cellen voor Ubiquitin en GFP met behulp van de volgende formules. Genormaliseerde v = V en genormaliseerde k = K.
   V1 = V1. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v1); V2 = v2. (∑ v1 + ∑ v2)/(2. ∑ v2)
   K1 = K1. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ K1); K2 = K2. (∑ k1 + ∑ k2)/(2. ∑ K2)
2. Verwijdering van de achtergrond: gebruik de volgende formules om waarden in het controlemonster (GFP) af te trekken van waarden in het ubiquitine-monster om specifieke waarden (V ' 1 en V ' 2) te verkrijgen voor elk geïdentificeerd eiwit in beide omstandigheden.
   V ' 1 = v1-K1 als v1-K1 ≥ 0; V ' 1 = 0 als v1-K1 < 0
   V ' 2 = v2-K2 als v2-K2 ≥ 0; V ' 2 = 0 als v2-K2 < 0
3. Variatie (var) van Ubiquitination. Om een score te verkrijgen (tussen-100 en + 100) voor positieve en negatieve variaties van PTMs geïnduceerd door een medicijn, gebruikt u de volgende formule waarin het verschil tussen specifieke waarden van behandelde en onbehandelde monsters wordt gedeeld door de som van alle waarden, inclusief die in controle (voor het bestraffen van eiwitten ook geïdentificeerd in Control GFP), en vermenigvuldigen met 100.
   Var = (V'2-V ' 1)/(v1 + K1 + v2 + K2) * 100; -100 < var < 100;
   Variaties onder-50 (onderdrukking van PTM) of boven 50 (inductie van PTM) worden meestal beschouwd als significant.
4. Vertrouwen (conf). Gebruik de volgende formule om een betrouwbaarheids waarde te verkrijgen tussen 0 en 100%,:
   Conf = ((v1 + v2)²/(1 + v1 + v2 + k1 + k2)²) * 100-100/(1 + V ' 1 + v ' 2); = 0 als < 0
   Waarden boven 50 worden meestal beschouwd als vertrouwen.
5. Om een mooiere verdeling van Inductie-/onderdrukkings waarden te verkrijgen en om zowel variatie-als betrouwbaarheidsparameters te overwegen, vermenigvuldigt u de var -en conf -waarden met behulp van de volgende formule, waarbij V var en C conf
   = SI (v2 > 0;((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6);-((v2 * C2) ^ 2)/(10 ^ 6))
   Opmerking: aangezien piek gebieds waarden meestal nauwkeuriger zijn dan het tellen van peptide, is het mogelijk om specifieke software te gebruiken die is gewijd aan de interpretatie van dit soort gegevens, zoals Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), na aanbevelingen van gebruik.

Representative Results

Transductie van kweek zoogdiercellen om GFP en 6HF-UB te creëren die cellen uitdrukken
Om lentivirussen te produceren die later zullen worden gebruikt om MiaPaCa-2 cellen te leiden, worden 70% Confluent Health HEK-293T cellen samen met een gelijke hoeveelheid van de drie vectoren, pCCL-6HF-Ubiquitin of GFP/Delta-helper/pvSvG. Na 24 h van de productie wordt het medium dat linvirale deeltjes bevat, teruggewonnen en gefilterd. Het is mogelijk op dit punt om de efficiëntie van de transfectie controleren door het controleren van de groene fluorescentie van GFP uitdrukken 293T cellen op een omgekeerde Microscoop. Het moet in de buurt van 100% van de cellen. MiaPaCa-2 cellen worden gedurende 1 tot 3 dagen geïnfiltreerd met linviraal supernatant. De werkzaamheid van lentivirale transductie wordt eerst gecontroleerd door te kijken naar de GFP-fluorescentie van GFP-getransduceerde cellen (Figuur 1een bovenste paneel). Het GFP-expressie niveau kan variëren van de ene cel naar de andere, maar 100% van hen moet fluorescerend zijn. Zodra deze controle is uitgevoerd, zal de uitdrukking van de vlag-ubiquitin ook moeten worden gecontroleerd. Dit wordt gedaan door immunofluorescentie kleuring met behulp van een Anti-Flag antilichaam (meestal m2 monoklonaal) (Figuur 1A onderste paneel). Dit toont het percentage getransduceerde cellen, dat 100% moet zijn om een stabiele uitdrukking over toekomstige passages van de celcultuur te garanderen. Om het uitdrukkings niveau van exogene vlag-ubiquitin te beheersen, worden lysaten uit getransduceerde cellen geanalyseerd door SDS-PAGE, gevolgd door Western Blot met Anti-Flag antilichaam (Figuur 1B). Beide cellijnen kunnen worden bevroren.

Twee stappen zuivering en controle door SDS PAGE en zilver kleuring
Zodra de stabiel uitdrukken cellijnen zijn gevalideerd, zowel GFP en 6HF-ubiquitin cellen worden versterkt totdat er voldoende materiaal wordt verkregen om te gaan met de twee-stap zuivering. Het wordt aanbevolen om een back-up van deze cellijnen te houden als bevroren voorraad in vloeibare stikstof om ze te kunnen ontdooien wanneer dat nodig is. 36 h voor de verwerking wordt de helft van de cellen (halve GFP en half 6HF-ubiquitine) behandeld met 10 μM Gemcitabine. Wanneer klaar, worden alomtegenwoordige eiwitten gezuiverd uit 6HF-ubiquitine en uit GFP-controle cellen, met behulp van het tweestapszuiverings Protocol (Figuur 2A). 10% van de uiteindelijke elutie wordt gebruikt om de hoeveelheid en de integriteit van gezuiverd materiaal te beheersen door SDS-PAGE en zilver kleuring van de gel (Figuur 2B). Het molecuulgewicht markers kan worden gebruikt om de hoeveelheid gezuiverde alomtegenwoordige eiwitten te schatten. Als alternatief kan een bekende hoeveelheid BSA of enig ander eiwit in een lijn van de gel worden geladen om de gezuiverde eiwitten te kwantificeren. Zodra deze controle is uitgevoerd, worden de resterende 90% van de monsters geanalyseerd met vloeibare chromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie om identificatie en semi-kwantatie van gezuiverde eiwitten mogelijk te maken.

Identificatie van alomtegenwoordige eiwitten op achtergrond (GFP-voorbeelden) aftrekken
Gegevens uit de LC-MS/MS-analyse van de monsters geven de namen en kwantificaties (piek gebieden en het aantal waargenomen peptiden) van elk geïdentificeerd eiwit in GFP-en 6HF-UB-monsters. De eiwitten met de hoogste kwantificering in ubiquitine monster in vergelijking met GFP monster zijn waarschijnlijk degenen die echt alomtegenwoordig zijn en het toepassen van de formules beschreven in bovenstaande methoden maakt hun classificatie mogelijk door het geven van een betrouwbaarheidsscore van 0 tot 100% . Eiwitten die met een Score van meer dan 50% worden geïdentificeerd, worden beschouwd als alomtegenwoordige proteïnen (Figuur 3a).

Deze stap die in feite verwijdert achtergrond eiwitten (GFP) uit ubiquitine monsters leidde tot de identificatie van 364 eiwitten significant alomtegenwoordig (Figuur 3B)⁷. Houd er rekening mee dat de eiwitten die met de hoogste scores worden geïdentificeerd, meestal al bekend staan als belangrijkste doelen van Ubiquitination, wat de werkzaamheid van deze zuiveringsmethode bewijst.

Dan is het mogelijk om een genset verrijking analyse (gsea) van deze alomtegenwoordige eiwitten uit te voeren om de biologische processen waarin ze betrokken zijn te belichten (Figuur 3C), hun moleculaire functies, hun cellulaire compartiment, of een andere genontologie categorisatie. Het is interessant om dit alomtegenwoordige Proteoom te vergelijken met het volledige proteoom van de cel indien mogelijk. Deze analyse onthult inderdaad de werkelijke bijdrage van deze alomtegenwoordige eiwitten in specifieke processen zoals translatie of proteolyse bijvoorbeeld (Figuur 3C).

Het belangrijkste doel van dit soort experimenten is het identificeren van veranderingen binnen het alomtegenwoordige Proteoom geïnduceerd door een behandeling bijvoorbeeld, hier Gemcitabine. Door het ubiquitinome (het alomtegenwoordige specifieke Proteoom) in behandelde en onbehandelde cellen met behulp van de specifieke formule te vergelijken, resulteert dit in een waarde van-100 (onderdrukking van Ubiquitination) tot + 100 (inductie van Ubiquitination). Gezien alleen de waarden onder-50 of hoger + 50 als significant, een totaal van 73 geïnduceerde ubiquitinations en 29 onderdrukt ubiquitinations zijn geïdentificeerd (Figuur 4a). GSEA-analyse van deze veranderingen van Ubiquitination onthulde specifieke enrichments in DNA-herstelprocessen of celcyclus, en belangrijke variaties in translatie-en RNA metabolische processen (Figuur 4B). Dit resultaat is zeer logisch, omdat Gemcitabine een basis analogon is dat DNA-synthese blokkeert en DNA-schade veroorzaakt.

Om verder te gaan, het is ook interessant om databases van de interactie eiwitten gebruiken om te verkennen en valideren van potentiële interactie netwerken gevormd door Gemcitabine geïnduceerde veranderingen van Ubiquitination (Figuur 5). Dit leidde tot de identificatie van functionele interactie netwerken sterk beïnvloed door toegenomen of afgenomen Ubiquitination van de betrokken eiwitten.

Tot slot, onder de veranderde ubiquitatie, sommige kunnen eiwitten van de hoogste belang zijn, vanwege hun bekende of potentiële functies volgens de literatuur. Vandaar, een belangrijke stap is om te valideren dat wat wordt waargenomen door massaspectrometrie is reëel en betrouwbaar. PCNA was een van de meest over-alomtegenwoordige eiwitten op Gemcitabine-behandeling gedetecteerd door massaspectrometrie analyse (Figuur 4A). Om te verifiëren dat Gemcitabine inderdaad de Ubiquitination van PCNA induceert, worden MiaPaCa-2 cellen die 6HF-UB en GFP uitdrukken, geteeld, behandeld of niet, en onder voorbehoud van ni-NTA-zuivering in denatureringscondities of Anti-Flag immunoprecipitatie gevolgd door vlag Peptide elutie in inheemse omstandigheden, opgelost op SDS page gevolgd door Western Blot met het overeenkomstige antilichaam. Het resultaat in Figuur 6 bevestigde dat pcna inderdaad sterk alomtegenwoordig is als reactie op de behandeling met Gemcitabine in MiaPaCa-2 cellen.

Figuur 1: vaststelling van stabiele cellijnen die 6His-Flag-UBL uitdrukken. A) controle van de GFP-expressie in GFP-getransduceerde cellen (bovenste paneel) en van 6his-Flag-Ubiquitin door immunofluorescentie met Anti-Flag (m2) antilichaam als primair en alexa-567 anti-muis secundair antilichaam. DAPI werd gebruikt voor het vlekken van kernen. Schaalbalk: 50 μm. (B) controle van 6His-Flag-ubiquitin-expressie in celllysates door Western Blot met Anti-Flag-antilichamen (alternatief, kan een anti-6his antilichaam worden gebruikt) aan de linkerzijde, en anti-ubiquitine antilichamen, aan de rechterkant, om de uitdrukking te vergelijken van 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) met endogene Ubiquitin (endo. Ubiq). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: twee stappen zuivering van alomtegenwoordige eiwitten. A) schematische weergave van de procedure. B) 10% van de eind elutie werd onderworpen aan een sds-pagina gevolgd door zilver kleuring van de gel om de hoeveelheid en zuiverheid (vergeleken met GFP) van geïsoleerde eiwitten te schatten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: identificatie van alomtegenwoordige eiwitten (aangepast van Bonacci et al. ⁷). (A) relatieve hoeveelheid specifiek (ubiquitin-monster) en niet-specifieke (GFP-monster) peptiden voor elk geïdentificeerd eiwit werden uitgezet in functie van hun zelfverzekerde scores. Zoals getoond, wordt het aandeel van niet-specifieke over alomtegenwoordige eiwitten te belangrijk onder de Score van 50. Vandaar dat alleen eiwitten geïdentificeerd met een score superieur aan 50 worden beschouwd als significant. B) tabel met de 20 beste alomtegenwoordige eiwitten onder de geïdentificeerde 364-totaal. C) herverdelings van alomtegenwoordige eiwitten en totale eiwitten van MiaPaCa-2 cellen binnen biologische processen (waarden > 1,5% werden alleen overwogen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Gemcitabine veroorzaakte veranderingen van PTM profielen (aangepast van Bonacci et al. ⁷). A) notering van de 20 eiwitten met de hoogste gestegen (totaal 73) of afgenomen (totaal 29) alomtegenwoordige behandeling met Gemcitabine (conf: Confidence; Ind: inductie; Rep: repressie). B) herverdelings van Gemcitabine geïnduceerde veranderde ubiquitisatie binnen biologische processen en vergelijking met niet-behandelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: functionele interactomes van Gemcitabine geïnduceerde veranderde Ubiquitination. Mogelijke interacties tussen alle eiwitten met Gemcitabine geïnduceerde verandering van Ubiquitination worden geïdentificeerd met behulp van een eiwit-eiwit interacties database (STRING: string-db.org). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: biochemische validaties van interessante Gemcitabine geïnduceerde veranderingen van Ubiquitination. Om de toegenomen alomtegenwoordige eigenschappen van PCNA na de behandeling met Gemcitabine te valideren, werden lysaten van cellen die 6HF-ubiquitine uitdrukken, behandeld of niet met Gemcitabine, onderworpen aan een opklapbare nikkel (NI-NTA), gevolgd door anti-PCNA Western Blot. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

We hebben een robuuste en betrouwbare methodologie ontwikkeld om profielen van eiwitten te genereren die zijn aangepast door de belangrijkste ubiquitine-familieleden. Inderdaad, we hebben dit protocol met succes toegepast om profielen van Ptm's te genereren door ubiquitin, en ook door SUMO en Nedd8, en om veranderingen in verband met een behandeling te detecteren⁷, in reactie op de over expressie of knockdown van een bepaald gen (gegevens niet weergegeven) en in cellen die een resistent fenotype hebben verkregen voor diverse chemotherapeutische geneesmiddelen.

Er zijn slechts enkele kritische stappen tijdens de procedure dat de manipulator voorzichtig moet zijn met. Bij het pipetteren van kralen (NI-NTA of Anti-Flag gekoppeld), is het belangrijk om ze grondig te hervatten, vooral de anti-vlag kralen omdat ze zijn opgehangen in een visceuze glycerol gebaseerde buffer, en om een beetje het uiteinde van de tip te snijden om de sectie te vergroten. Een andere voorzorgsmaatregel moet worden gevolgd is om te Pipetteer langzaam om te voorkomen dat kralen stapelen. Extra kritische stappen zijn de elutie met imidazol en vervolgens met vlag peptide. Een schone Hamilton-spuit moet worden gebruikt om het supernatant na elutie te herstellen om te voorkomen dat zoveel mogelijk Pipetteer van de parels waarop niet-specifieke eiwitten achterblijven.

Afhankelijk van het celtype en de hoeveelheid benodigd eindmateriaal voor massaspectrometrie kan het uitgangsmateriaal dienovereenkomstig worden verhoogd of verlaagd. Vervolgens bevindt de enige belangrijke aanpassing zich in het volume van nikkel kralen, aangezien deze van 2 μL per 1 mg eiwitten in lysaat moet zijn. Het kan gebeuren dat de hoeveelheid gezuiverde eiwitten te laag is. Het uitdrukkings niveau van Tagged UB/UBL moet worden gecontroleerd en, als het te laag is, kunnen cellen opnieuw worden getransducteerd met dezelfde linvirussen. Als alternatief is het mogelijk om de hoeveelheid startmateriaal te verhogen. Soms is de hoeveelheid niet-specifiek gezuiverd materiaal in GFP of ouderlijke cellen te hoog. Een oplossing om dit probleem te overwinnen is het verhogen van het volume en het aantal wast op zowel ni-NTA en vlag zuivering stappen. Het is ook mogelijk om de concentratie van imidazol in wasses met guanidine buffer, tot 20 mM te verhogen. Omgekeerd is het niet nodig om de concentratie van vlag peptide in de laatste elutie-stap te verhogen, omdat het de elutie niet zal verhogen. Het is belangrijker om verse peptide te gebruiken als na verloop van tijd, zelfs als opgeslagen bij-20 ° c, de werkzaamheid van de peptide kan afnemen.

De belangrijkste beperking van dit protocol is dat het alleen geschikt is voor gekweekte cellen, omdat ze moeten worden getransduceerde om de gewenste gelabelde UBL uitdrukken. Vandaar dat elke studie over weefsels of tumormonsters moet worden uitgevoerd met behulp van alternatieve benaderingen zoals digly peptiden enrichments na trypsine spijsvertering¹¹, immunoprecipitatie met antilichamen die specifiek zijn voor de UB/UBL van belang⁵, of het gebruik van Buizen⁶. Al deze alternatieve methoden zijn ook geschikt voor hun toepassing in gekweekte cellen. Ze hebben het voordeel dat ze de endogene UB/Ubls-machines gebruiken. Er bestaan echter verschillende nadelen. Immunoprecipitaties zijn moeilijk uit te voeren met een lage achtergrond en, net als buizen benaderingen, eiwitten die interactie hebben met gemodificeerde eiwitten, en zelfs de modifier zelf, kunnen niet worden geëlimineerd, hoewel er praktische verbeteringen zijn verkregen met behulp van strengere voorwaarden. Digly peptiden verrijking is een zeer krachtige TECHNIC maar kan corresponderen met verschillende soorten ptm's. Bijvoorbeeld, diGly verrijking van een trypsine verteerd lysaat zal voornamelijk alomtegenwoordige eiwitten, maar ook geneddylated identificeren, zoals Nedd8 laat dezelfde overblijfsel diGly handtekening als ubiquitine doet¹¹.

Een andere beperking van dit protocol is dat de aanwezigheid van de 6His-vlag tag de normale functie van UB/UBL kan veranderen en dat de overexpressie door zelf de machine kan veranderen. Dit kan bijvoorbeeld het genereren van polyubiquitinketens belemmeren en monoubiquitatie bevoordelen. Echter, aangezien zowel mono multi en polyubiquitin ketens zijn geïdentificeerd met behulp van dit protocol, het lijkt erop dat het niet het geval⁷. De aanwezigheid van de tag bij het N-Terminus voorkomt ook de vorming van lineaire Ubiquitination, waarbij ubiquitinmoties met elkaar verbonden zijn via de N-terminale methionine van ubiquitine. Hoewel 6HF-udiquitin niet kan worden alomtegenwoordig op het eerste met-met-residu, heeft het nog steeds de mogelijkheid om dit soort ketting te beëindigen.

Ook, overwegende dat het een aanzienlijk voordeel is voor het gebruik van lentivirussen die het creëren van stabiele cellijnen in één of twee weken mogelijk maakt, is het mogelijk dat niet alle cellen de gewenste constructie uitdrukken. Dit is misschien geen reëel probleem voor de zuiverings procedure zolang voldoende cellen de exogene UB/UBL uitdrukken, maar het probleem kan komen met lange termijn cultuur als over verschillende passages kan er een klonale variatie zijn met verrijking in cellen met minder of geen Expressie. Dit nadeel, echter, kan gemakkelijk worden omzeild door het gebruik van lentivirussen met ofwel een resistentie selectie gen of een fluorescerende eiwit dat kan worden gebruikt in flow cytometrie om alleen positieve cellen te selecteren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag