Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Summary

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Abstract

Proteinlerin ubikitin (ub) ve ubiquitin benzeri (ubl) bağımlı post-translational modifikasyonları protein stabilitesini, aktivitesini, etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonunu kontrol ederek hücre içinde temel biyolojik düzenleyici rolleri oynar. Hücrenin sinyallere yanıt vermesine ve çevredeki değişikliklere uyum sağlamasına olanak sağlar. Bu mekanizmalar içinde değişiklikler nörodejeneratif hastalıklar ve kanserler gibi ciddi patolojik durumlara yol açabilir. Burada açıklanan tekniğin amacı, kültürlü hücre çizgilerinden ub/ubls bağımlı PTM profillerinin hızlı ve doğru bir şekilde oluşturulmasıdır. Farklı koşullardan elde edilen farklı profillerin karşılaştırılması, örneğin bir tedavi tarafından indüklenenler gibi belirli değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır. Lentiviral aracılı hücre transdüksiyonu, değiştiricinin (ubiquitin veya SUMO1 veya Nedd8 gibi bir ubl) iki tag (6His ve Bayrak) sürümünü ifade eden kararlı hücre çizgileri oluşturmak için gerçekleştirilir. Bu etiketler her yerde saflaştırma ve bu nedenle hücrelerden her yerde proteinlerin izin verir. Bu iki aşamalı bir arınma işlemi ile yapılır: İlki 6His etiketi kullanılarak denatüre koşullarında gerçekleştirilir ve ikincisi bayrak etiketi kullanılarak yerel koşullarda gerçekleştirilir. Bu, daha sonra sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) teknolojisi ile tanımlanan ve yarı-nicelleştirilmiş modifiye proteinlerin son derece spesifik ve saf izolasyonuna yol açar. Excel yazılımını kullanarak MS verilerinin kolay enformatik analizi, arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak PTM profillerinin oluşturulmasını sağlar. Bu profiller, standart biyokimya teknikleri ile doğrulanmalarından başlayarak, daha spesifik olarak incelenecek belirli değişiklikleri belirlemek için her durum arasında karşılaştırılır.

Introduction

Burada önerilen yöntem, belirli bir durumla ilişkili potansiyel değişiklikleri (tedavi, farklılaşma, vb.) belirlemek için kültürlü memeli hücrelerinden ubikitin aile üyeleri tarafından aracılık edilen PtM'leri incelemek için ayrılmıştır. Ptm'ler proteinlerin fonksiyonlarının düzenlenmesinin son adımını temsil eder^1. Nitekim, bir kez çeviri makineleri tarafından üretilen, çoğu değilse tüm proteinler kendi aktivitesini modüle PTM'ler farklı türde uğrar, moleküler etkileşimleri, ve hücre içi konumu¹. PtM bolluk arasında proteinlerin ubiquitin ailesi tarafından aracılık olanlar, ubiquitin kendisi ve tüm ubikitin benzeri, tüm hücre içi veya kısmen sitoplazmik proteinleri düzenlemek için potansiyele sahip². Kendileri protein oldukları için, her biri belirli düzenleyici işlevlerle ilişkili homojen ve heterojen çeşitli topolojilerin homojen ve heterojen zincirlerini oluşturarak birbirlerine konjuge edilebilirler^2. Bu karmaşık makineyi çözmek ve anlamak için araçlara ihtiyaç vardır. Birçok yaklaşımlar dünya çapında, kendi avantajları ve dezavantajları olan geliştirilmiştir ve burada kültürlü hücreler için uygun yüksek performanslı bir öneriyoruz.

Bu yöntemin en büyük avantajı doğruluğudur. Nitekim, izole modifiye proteinlerin saflığı son derece iki etiket (6His ve Bayrak) ve iki adım prosedürü kombinatoryal kullanımı ile geliştirilmiş ve bu nedenle tek bir etiket füzyon ub / Ubl³çok daha seçici olduğunu^,4. 6His etiketinin varlığı, tamamen inkar eden bir durumda arınmanın ilk adımını sağlar ve böylelikle ubikitin bağlayıcı etki alanları veya her yerde bulunanlara bağlanan diğer proteinler içeren proteinlerin birlikte saflaştırılmasından kaçınır. Bu teknik bir sorun ya spesifik antikorlar⁵ veya tandem ubiquitin bağlayıcı elemanları (TUBEs)⁶kullanarak ubiquitinated proteomların yakınlık saflaştırma dayalı birçok diğer yaklaşımlar tarafından karşılaşılan bir teknik sorundur . Daha da önemlisi, bu teknik her yerde belirli bir tür arınma lehine önyargılı değildir, bu bazı diğer yaklaşımlar için durum olabilir gibi, poliubiquitinations hem mono ve farklı türde tespit edildi beri⁷. Sonuç olarak, bir kez bulundu, ubiquitination bir değişiklik ilgili her yerde tam türünü belirlemek için standart biyokimyasal yaklaşımlar tarafından daha ayrıntılı olarak incelenmesi gerekecektir.

Son olarak, bu protokolün bir diğer teknik avantajı, normal hücresel davranışa müdahale etmeden etiketli değiştiriciifadelerinin makul düzeyde olan kararlı ifade hücre çizgileri oluşturan lentivirüslerin kullanımıdır.

Ubikitinasyonun önemli bir rolü proteazomal bozulma için proteinleri hedeflemek ise, şimdi potansiyel olarak en hücre içi veya kısmen hücre içi proteinler için birçok düzenleyici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir¹. Bu fonksiyonların sayısı daha proteinler gibi birçok ubiquitin varlığı ile artar, proteinlerin hemen hemen her hücre mekanizması nı düzenleyen bir aile oluşturan¹. Onların değişiklikler hücre biyolojisi üzerinde köklü etkisi olabilir ve yol açabilir veya patolojik^durumlarakatılabilir 8 , kanser gibi⁹. Bu nedenle, araçlar bu geniş manzara keşfetmek ve yeni terapötik hedefler olarak hizmet verebilir patolojik bir durum ile ilişkili değişiklikleri belirlemek için gereklidir.

Bu protokol, ub/Ubl etiketli eksojeni ifade etmek için transeksedilmesi gerektiğinden kültürdeki hücrelere adanmıştır. Oluşturulduktan sonra, bu kararlı hücre çizgileri 2D veya 3D veya ksenogreft kültüründen Ubl profilleri oluşturmak için kullanılabilir, böylelikle PTM profilleri çalışmak için uygulanabilir farklı deneysel modellerin ufkunu genişleterek.

Protocol

1. 6His-Bayrak-Ubl ifade kararlı hücre hatları nesil

NOT: HEK-293T hücrelerinin pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ve delta-Helper ile birlikte transfeksiyonu.

1. 0. Gün: Tohum 293T hücreleri 6-iyi plaka elde etmek için 50-70% ertesi gün biraraya.
2. 1. Gün: Lentivirüs üretimi için transfeksiyon reaktifi ve protokolü kullanarak 1 μg pCCL-6HF-Ubl veya pCCL-GFP, 1 μg pVSVG ve 1 μg delta-Helper vektörleri karışımı ile co-transfect%50-70 konfluent hücreler. Transfeksiyon 6 saat sonra, transekedilecek hücrelere karşılık gelen taze bir orta değiştirin. Bir gün sonra (transdüksiyonun başladığı gün) %10-20'lik bir kesişme elde etmek için 6 kuyuplakasına geçirilecek hücreleri tohumlayın.
3. 2. Gün: Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 μm filtreler kullanarak filtre uygulayın. Gerekirse, lentiviruses ikinci bir parti üretmek için bu noktada taze orta ekleyin. Lentivirüsler içeren bir hücre transdüktör (%10-20) için orta değiştirin.
   NOT: Lentiviral ortam transdüksiyondan önce +4 °C'de birkaç gün tutulabilir veya -80 °C'de aylarca saklanabilir.
4. Hücreleri standart bir kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO₂₎24 saat ile 72 saat arasında lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze standart bir tüp olarak değiştirin. Mümkünse, transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin: hücre ifade yüzdesi ve hücre başına göreceli ifade düzeyi. Floresan saptanmazsa, ifadenin transdüktör hücre türüne bağlı olarak daha uzun sürmesi nedeniyle ek 2-3 gün bekleyin.
5. GFP kontrolü pozitifse, anti-Flag antikor kullanarak immünoresans ve Batı leke tarafından 6HF-Ubl bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek.

2. Modifiye proteinlerin çift saflaştırılması

NOT: Tampon 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampon 2: 50 mM NaH₂PO_4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Gliserol, pH 8.0.
Tampon 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Hücre lisisi: Hazır olduktan sonra kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücre lisise devam edin veya alternatif olarak sıvı N_2'de flaş dondurulup -80 °C'de saklayın. Lysis için, RT'de 15 cm'lik bir tabağa 2 mL Tampon 1 ekleyin. 50 mL konik santrifüj tüplerinde (son hacim yaklaşık 20 mL) tüm lysatları kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
2. Sonicate 30 s için üç kez lysate 1 dk duraklama ile ayrılmış.
3. 15 dk için 15.000 x g sonicated lysates santrifüj.
4. Supernatant'ı bir hücre süzgeci (40 μm) kullanarak yeni bir tüpe aktarın.
5. Örneklerin konsantrasyonunu belirleyin ve gerekirse aynı miktarda protein ve aynı hacim elde etmek için ayarlayın. 50 ve 100 mg (MiaPaCa-2 hücreleri için 15 cm çapında 10 tabak) arasında toplam miktarda protein kullanın.
6. Protein 1 mg başına boncuk 2 μL kullanarak, Ni^{2 +}-NTA boncuk ekleyin.
7. RT'de 2.5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün.
8. 5 dk için 500 x g boncuk pelet.
9. Boncukları 1 mL Tampon 1 ile yıkayın, numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın, ardından tüpleri buzüzerinde aktarın. Sonraki tüm adımları buzda veya 4 °C'de gerçekleştirin.
10. 10 mM imidazol içeren 1 mL buz gibi Tampon 2 ile iki kez yıkayın.
11. Bağlı proteinleri eleştirmek için, 250 mM imidazol içeren 600 μL Tampon 2 ekleyin ve 4 °C'de 2 saat döndürün.
12. 1 dk. Süpernatantları yeni, önceden soğutulmuş, 1,5 mL tüplere aktarın ve 50 μL anti-Flag M2 antikor konjuge boncuk ekleyin.
13. 4 °C'de 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün, ardından 500 μL Tampon 2 ile 2 kez, 500 μL Tampon 3 ile 2 kez yıkayın.
14. Son elüsyon için, 0,1 g/μL'de bayrak peptidiçeren 100 μL Tampon 3 ekleyin ve 4 °C'de 1,5 saat döndürün.
15. 1 dk için 500 x g'da santrifüj edin ve süpernatantları yeni önceden soğutulmuş tüplere aktarın.
16. SDS-PAGE'e yüklemek için %10 (10 μL) alın ve arıtma kalitesini kontrol etmek için jelin gümüş boyamasını gerçekleştirin. Arınma iyi görünüyorsa, LC-MS/MS'den kalan %90'ı analiz edin.

3. Ub/Ubls PTM'lerinin profillerini oluşturmak ve aralarındaki önemli farklılıkları belirlemek için kütle spektrometresi verilerinin işlenmesi

NOT: MS analizinden elde edilen sonuçlar, her numunede tanımlanan her protein için toplam peptid sayısı ve en yüksek alan değerleri (TOP 3 peptid alanı^{ortalaması 10)}dahil olmak üzere birçok bilgi içerir. Bu veriler, peptit sayısı sayıları veya tepe alan değerleri veya her ikisi kullanılarak işlenebilir. Tepe alanları ile hesaplama için, bu değerler genellikle 10⁶aralığında olduğundan, aşağıdaki gibi aynı formülleri uygulamadan önce bu sıraya göre bölmek için gereklidir. Sayma metodolojisi ile elde edilen sonuçlar, her zaman olduğu gibi güçlü bir korelasyon göstermelidir. Tanımlanan her protein için aşağıdaki formülleri kullanın:
tedavi edilmeyen ubiquitin numunesinde v1 peptid değerleri (örn. Ub - ilaç)
Gemcitabine tedavi ubiquitin örnekv2 peptiddeğerleri (örneğin, Ub + ilaç)
tedavi edilmeyen kontrol GFP numunesinde k1 peptid değerleri (örn. GFP - ilaç)
Gemcitabine tedavi kontrol GFP örnek k2 peptidler değerleri (örneğin, GFP + ilaç).

1. Normalleştirme: Aşağıdaki formülleri kullanarak ubiquitin ve GFP için ilaç tedavi edilen hücreler ile tedavi edilmeyen hücreler arasındaki değerleri normalleştirin. Normalleştirilmiş v = V ve normalleştirilmiş k = K.
   V1=v1. (•v1+ (v2) / (2. •v1) ; V2=v2. (•v1+ (v2) / (2. +v2)
   K1=k1. (•k1+ (k2) / (2. (k1) ; K2=k2. (•k1+ (k2) / (2. (k2)
2. Arka planın çıkarılması: Aşağıdaki formülleri kullanarak, her iki koşulda tanımlanan her protein için belirli değerleri (V'1 ve V'2) elde etmek için kontrol örneğindeki (GFP) değerleri ubikitin örneğindeki değerlerden (GFP) çıkarın.
   V'1=V1-K1 eğer V1-K1≥0; V'1=0 ise V1-K1<0
   V'2=V2-K2 ise V2-K2≥0 ; V'2 =0 ise V2-K2<0
3. Varyasyon (Var) ubiquitination. Bir ilaç tarafından indüklenen PtM'lerin pozitif ve negatif varyasyonları için bir puan (-100 ile +100 arasında) elde etmek için, tedavi edilen ve tedavi edilmeyen numunelerin belirli değerleri arasındaki farkın, kontrol (gfp kontrolünde tanımlanan proteinleri cezalandırmak için) ve 100 ile çarpar.
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100; -100-50'nin altındaki varyasyonlar (PTM baskısı) veya 50'nin üzerindeki (PTM indüksiyonu) genellikle anlamlı olarak kabul edilir.
4. Güven (Conf). 0 ile %100 arasında bir güven değeri elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0 ise <0
   50'nin üzerindeki değerler genellikle kendinden emin olarak kabul edilir.
5. İndüksiyon/bastırma değerlerinin daha güzel bir dağılımını elde etmek ve hem varyasyon hem de güven parametrelerini göz önünde bulundurmak için, V Var ve C Conf'ın bulunduğu aşağıdaki formülü kullanarak Var ve Conf değerlerini çarpın
   =SI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
   NOT: Tepe alan değerleri genellikle peptit sayma daha doğru olduğundan, Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) gibi verilerin yorumlanması için adanmış özel yazılım lar kullanmak mümkündür, aşağıdaki kullanım önerileri.

Representative Results

GFP ve 6HF-Ub ifade hücreleri oluşturmak için kültür memeli hücrelerinin transdüksiyon
Daha sonra MiaPaCa-2 hücrelerini nakletmek için kullanılacak lentivirüsler üretmek için, 70% confluent HEK-293T hücreleri üç vektör, pCCL-6HF-Ubiquitin veya GFP / Delta-Helper / pvSvG eşit miktarda transfected vardır. 24 saat üretimden sonra merceksi viral partiküller içeren ortam geri kazanılır ve süzülür. Bu noktada transfeksiyonun verimliliğini, ters bir mikroskop üzerinde 293T hücreleri ifade eden GFP'nin yeşil floresansını kontrol ederek kontrol etmek mümkündür. Hücrelerin %100'e yakın olması gerekir. MiaPaCa-2 hücreleri 1-3 gün boyunca lentiviral supernatant ile kuluçkaya yatırılır. Lentiviral transdüksiyonun etkinliği ilk olarak GFP transdüktörü hücrelerin GFP floresansına bakarak kontrol edilir(Şekil 1A üst panel). GFP ifade düzeyi bir hücreden diğerine değişebilir, ancak %100 floresan olmalıdır. Bu denetim yapıldıktan sonra, Bayrak-ubiquitin ifadesi de kontrol edilmelidir. Bu bir anti-Bayrak antikor (genellikle M2 monoklonal) kullanılarak immünororesans boyama tarafından yapılır(Şekil 1Alt panel). Bu, hücre kültürünün gelecekteki pasajlar üzerinde istikrarlı bir ifade garanti etmek için% 100 olmalıdır transduced hücrelerin yüzdesi gösterecektir. Eksojen Bayrak-ubiquitin in ekspresyon düzeyini kontrol etmek için transeksed hücrelerden lysates SDS-PAGE tarafından analiz edilir ve ardından Anti-Flag antikorlu Batı lekesi(Şekil 1B). Her iki hücre hattı da dondurulabilir.

SDS PAGE ve gümüş boyama ile iki adımda arınma ve kontrol
Kararlı ifade hücre hatları doğrulandıktan sonra, iki aşamalı arınma ile devam etmek için yeterli malzeme elde edilene kadar hem GFP hem de 6HF-ubiquitin hücreleri yükseltilir. Gerektiğinde eritmek mümkün olması için sıvı azot dondurulmuş stok olarak bu hücre hatlarının bir yedek tutmak için tavsiye edilir. İşlemeden önce 36 saat, hücrelerin yarısı (yarım GFP ve yarısı 6HF-Ubiquitin) 10 μM Gemcitabine ile tedavi edilir. Hazır olduğunda, her yerde bulunan proteinler 6HF-ubiquitin'den ve GFP kontrol hücrelerinden iki aşamalı arıtma protokolü kullanılarak saflaştırılır(Şekil 2A). Son elüsyonun %10'u, Saflaştırılmış malzemenin miktarını ve bütünlüğünü SDS-PAGE ve jelin gümüş boyama ile kontrol etmek için kullanılır(Şekil 2B). Molekülağırlık belirteçleri bantları saflaştırılmış her yerde protein miktarını tahmin etmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, bsa veya başka bir protein bilinen bir miktar saflaştırılmış proteinlerin sayısallaştırılmasına yardımcı olmak için jel bir çizgi yüklenebilir. Bu doğrulama yapıldıktan sonra, numunelerin geri kalan %90'ı sıvı kromatografi ile analiz edilerek saflaştırılmış proteinlerin tanımlanması ve yarı-nicelliği sağlamak için kütle spektrometresi biraraya gelmiştir.

Her yerde bulunan proteinlerin arka plan (GFP örnekleri) çıkarma ile tanımlanması
Örneklerin LC-MS/MS analizinden elde edilen veriler, GFP ve 6HF-Ub örneklerinde tanımlanan her proteinin adlarını ve niceliklerini (pik alanlar ve gözlenen peptid sayısı) verir. GFP örneğine göre ubikitin örneğinde en yüksek nicelik seli olan proteinlerin gerçekten her yerde bulunan proteinler olma olasılığı yüksektir ve yukarıdaki yöntemlerde açıklanan formüllerin uygulanması% 0'dan % 100'e kadar güven puanı vererek sınıflandırılmasına olanak sağlar. . %50'nin üzerinde bir skorla tanımlanan proteinler her yerde bulunanlar olarak kabul edilir(Şekil 3A).

Temelde her yerde bulunan proteinlerden arka plan proteinlerini (GFP) çıkaran bu adım, 364 proteinin önemli ölçüde her yerde tanımlanmasına yol açmıştır (Şekil 3B)⁷. Burada en yüksek skorlarla tanımlanan proteinlerin, bu arınma yönteminin etkinliğini kanıtlayan her yerde ki ana hedefler olarak bilindiğini unutmayın.

Daha sonra, bu her yerde bulunan proteinlerin gen seti zenginleştirme analizini (GSEA) yapmak mümkün olup, bu proteinlerin dahil oldukları biyolojik süreçleri vurgulamak için(Şekil 3C),moleküler işlevlerini, hücresel bölmelerini, veya başka bir gen ontoloji kategorizasyonu. Mümkün olduğunda hücrenin tam proteomu ile bu ubiquitinated proteome karşılaştırmak ilginçtir. Nitekim bu analiz, bu her yerde bulunan proteinlerin çeviri veya proteolysis gibi belirli süreçlerdeki gerçek katkısını ortaya koymaktadır (Şekil 3C).

Bu tür deneylerin temel amacı, örneğin burada gemcitabine gibi bir tedavi tarafından indüklenen her yerde bulunan proteom içindeki değişiklikleri belirlemektir. Belirli formülü kullanarak tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş hücrelerde ubiquitinome (ubiquitinated spesifik proteom) karşılaştırarak -100 (ubiquitination baskı) ile +100 (ubiquitination indüksiyon) bir değer verir. Sadece -50'nin altındaki ve +50'nin üzerindeki değerler dikkate alınarak anlamlı olarak, toplam 73 indüklenen ubiquitinations ve 29 bastırılmış ubiquitinations tespit edilmiştir(Şekil 4A). Ubikitinasyondaki bu değişikliklerin GSEA analizi, DNA onarım süreçlerinde veya hücre döngüsünde spesifik zenginleştirmeler, çeviri ve RNA metabolik süreçlerinde önemli varyasyonlar ortaya koymuştur(Şekil 4B). Gemsitain DNA sentezini engelleyen ve DNA hasarlarını tetikleyen bir baz analogolduğu için bu sonuç son derece mantıklıdır.

Daha ileri gitmek için, gemsitabin indüklenen her yerde ki değişikliklerin oluşturduğu potansiyel etkileşimli ağları araştırmak ve doğrulamak için etkileşim halindeki proteinlerin veritabanlarını kullanmak da ilginçtir(Şekil 5). Bu, ilgili proteinlerin artmış veya azalmış her yerde bulunan etkilerinden güçlü bir şekilde etkilenen işlevsel etkileşim ağlarının tanımlanmasına yol açmıştır.

Son olarak, değiştirilmiş her yerde, bazı yüksek ilgi proteinleri içerebilir, literatüre göre bilinen veya potansiyel işlevleri nedeniyle. Bu nedenle, önemli bir adım kütle spektrometresi tarafından gözlenen gerçek ve güvenilir olduğunu doğrulamaktır. PCNA, kütle spektrometresi analizi ile saptanan gemsitatürat tedavisi üzerine en çok rastlanan proteinlerden biridir (Şekil 4A). Gemsitabin pcna'nın her yerde görülmesine neden olduğunu doğrulamak için, 6HF-Ub ve GFP'yi ifade eden MiaPaCa-2 hücreleri yetiştirilir, tedavi edilir veya edilmez ve denaturing koşullarında Ni-NTA saflaştırmasına veya Bayrak tarafından takip edilen anti-Bayrak immünopresinesine tabi tutulur yerli koşullarda peptit elüsasyonu, SDS PAGE üzerinde çözülür ve buna karşılık gelen antikor ile batı leke. Şekil 6'da gösterilen sonuç, PCNA'nın MiaPaCa-2 hücrelerinde gemsitain tedavisine yanıt olarak güçlü bir şekilde her yerde olduğunu doğrulamıştır.

Şekil 1: 6His-Bayrak-Ubl'u ifade eden sabit hücre hatlarının oluşturulması. (A) GFP transdüktif hücrelerde GFP ekspresyonunun kontrolü (üst panel) ve 6His-Flag-Ubiquitin immünoresans ile anti-Flag (M2) antikorkullanarak primer ve alexa-567 anti-fare ikincil antikor. DAPI çekirdekleri lekelemek için kullanıldı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) Hücre lysates 6His-Flag-Ubiquitin ifade kontrolü anti-Flag antikor kullanarak Batı leke (Alternatif olarak, bir anti-6his antikor kullanılabilir) sol, ve anti-ubiquitin antikor, sağda, ifade karşılaştırmak için ve 6His-Flag-Ubiquitin (6HF-Ubiq) endojen Ubiquitin (Endo. Ubiq). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Her yerde bulunan proteinlerin iki adımar arındırması. (A) Prosedürün şematik gösterimi. (B) son elüsyonun %10'u sds page'e tabi tutuldu ve ardından izole proteinlerin miktarını ve saflığını (GFP ile karşılaştırıldığında) tahmin etmek için jelin gümüş boyanması yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Her yerde bulunan proteinlerin tanımlanması (Bonacci ve ark.'dan uyarlanmıştır. ⁷). (A) Tanımlanan her protein için spesifik (ubiquitin örneği) ve spesifik olmayan (GFP örneği) peptidlerin göreceli miktarı, kendine güvenen skorlarının işlevinde çizildi. Görüldüğü gibi, her yerde bulunan proteinler üzerinde spesifik olmayan ların oranı 50 puanın altında çok önemlidir. Bu nedenle, sadece 50'den daha yüksek bir puan ile tanımlanan proteinler önemli kabul edilir. (B) Tespit edilen 364 toplam protein arasında en iyi 20 proteini gösteren tablo. (C) Biyolojik süreçler içinde ubikitinated proteinlerin ve MiaPaCa-2 hücrelerinin toplam proteinlerinin yeniden bölünmesi (Değerler > %1.5 sadece kabul edildi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: GEMSITain PTM profillerinde indüklenen değişiklikler (Bonacci ve ark.'dan uyarlanmıştır. ⁷). (A) Gemsitabin tedavisi üzerine en yüksek artış (toplam 73) veya azalmış (toplam 29) her yerde bulunan 20 proteinin listelenmesi (Conf: güven; Ind: indüksiyon; Rep: baskı). (B) Gemcitabine repartition biyolojik süreçler içinde değiştirilmiş her yerde indüklenen ve tedavi edilmeyen ile karşılaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Gemsitain fonksiyonel etkileşimleri değiştirilmiş her yerde indüklenen. Tüm proteinler ile her yerde indüklenen her yerde ki değişim arasındaki potansiyel etkileşimler protein-protein etkileşimleri veritabanı (STRING: string-db.org) kullanılarak tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İlginç gemsitain biyokimyasal doğrulamaları her yerde değişiklik indüklenen. Gemsitabin tedavisinden sonra PCNA'nın artmış ubiquitinasyonunu doğrulamak için, gemsitabin ile tedavi edilen veya tedavi edilmeyen 6HF-Ubiquitin'i ifade eden hücrelerin lysatları Nikel pull-down 'a (Ni-NTA) ve ardından anti-PCNA Western lekesine maruz kalındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Biz ana ubikitin aile üyeleri tarafından modifiye protein profilleri oluşturmak için sağlam ve güvenilir bir metodoloji geliştirdik. Nitekim, biz başarıyla ubiquitin tarafından PTMs profilleri oluşturmak için bu protokolü uyguladık, ve ayrıca SUMO ve Nedd8 tarafından, ve bir tedavi ile ilişkili değişiklikleri tespit etmek^{için 7}, belirli bir genin aşırı ifade veya nakavt yanıt olarak (veri değil gösterilen) ve çeşitli kemoterapötik ilaçlara dirençli fenotip edinilen hücrelerde.

İşlem sırasında manipülatörün dikkatli olması gereken yalnızca birkaç kritik adım vardır. Boncuk pipetting üzerine (Ni-NTA veya anti-Flag birleştiğinde), iyice onları yeniden askıya almak için önemlidir, özellikle anti-Bayrak boncuklar beri viskoz gliserol bazlı tampon askıya alınır, ve bölümü artırmak için ucun ucunu biraz kesmek için. Takip edilmesi gereken bir diğer önlem de boncuk istiflememek için yavaş yavaş pipet etmektir. Ek kritik adımlar imidazol ile elution ve daha sonra Bayrak peptid ile vardır. Temiz bir Hamilton şırınga önlemek için elution sonra supernatant kurtarmak için kullanılmalıdır, nonspesifik proteinler kalır boncuk mümkün olduğunca pipetleme.

Hücre tipine ve kütle spektrometresi için gerekli son malzeme miktarına bağlı olarak, başlangıç malzemesi buna göre artırılabilir veya azaltılabilir. Daha sonra, tek önemli ayarlama nikel boncuk hacminde bulunur, çünkü lysate'deki proteinlerin 1 mg'ı başına 2 μL olmalıdır. Saflaştırılmış protein miktarının çok düşük olduğu gerçekleşebilir. Etiketli Ub/Ubl'un ifade düzeyi kontrol edilmeli ve çok düşükse hücreler aynı lentivirüsler kullanılarak yeniden transeedilebilir. Alternatif olarak, başlangıç malzemesi miktarını artırmak mümkündür. Bazen, GFP veya ebeveyn hücrelerinde nonspesifik saflaştırılmış malzeme miktarı çok yüksektir. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir çözüm hem Ni-NTA ve Bayrak arıtma adımlarında ses ve yıkıntı sayısını artırmaktır. Guanidin tamponu ile yıkıtalarda imidazol konsantrasyonunun 20 mM'ye kadar arttırMak da mümkündür. Ters, bu elüsyon artmayacak gibi son elüsyon adımda Bayrak peptid konsantrasyonu artırmak için gerekli değildir. -20 °C'de depolanmış olsa bile, zaman içinde taze peptit kullanmak daha önemlidir, peptitin etkinliği azalabilir.

Bu protokolün ana sınırlaması, istenilen etiketli Ubl'ü ifade etmek için transdükse edilmesi gerektiği için sadece kültürlü hücreler için uygun olmasıdır. Bu nedenle, dokular veya tümör örnekleri üzerinde herhangi bir çalışma tripsin sindirim¹¹sonra diGly peptidler zenginleştirmeler gibi alternatif yaklaşımlar kullanılarak yapılmalıdır , ilgi Ub / Ubl özgü immünopredibat⁵, veya kullanımı KÜVETLER⁶. Tüm bu alternatif yöntemler kültürlü hücrelerde uygulanması için de uygundur. Onlar endojen Ub / Ubls makine kullanma avantajına sahip. Ancak, çeşitli dezavantajları var. İmmünoenserlerin düşük arka planla yapılması zordur ve TÜBit'lerin yaklaşması gibi modifiye proteinlerle etkileşime girilen proteinler ve hatta modifiye edicinin kendisi, pratik iyileştirmeler kullanılarak elde edilmiş olsa bile ortadan kaldırılamaz. daha sıkı koşullar. DiGly peptidler zenginleştirme çok güçlü bir teknik tir ama PTM'ler farklı tür karşılık gelebilir. Örneğin, bir tripsin sindirilmiş lysate diGly zenginleştirme esas olarak her yerde proteinleri belirleyecek ama aynı zamanda neddylated olanları, Nedd8 ubiquitin yok aynı kalıntı diGly imza bırakır gibi¹¹.

Bu protokolün bir diğer sınırlaması, 6His-Flag etiketinin varlığının Ub/Ubl'un normal işlevini değiştirebileceği ve aşırı ifadenin makineyi değiştirebileceğidir. Bu örneğin poliubiquitin zincirlerinin nesil engel olabilir ve monoubiquitination lehine. Ancak, hem mono multi hem de poliubiquitin zincirleri bu protokol kullanılarak tespit edilmiş olduğundan,^budurumda 7 değil gibi görünüyor . N-terminus etiketin varlığı da doğrusal ubiquitination oluşumunu engeller, ubiquitin moieties ubiquitin N-terminal metiyonin ile birbirine bağlı nerede. Ancak, 6HF-udiquitin ilk Met kalıntısı üzerinde her yerde tutulamaz olsa da, yine de bu tür bir zincire son verme yeteneğine sahiptir.

Ayrıca, bir veya iki hafta içinde kararlı hücre hatları oluşturulmasını sağlayan lentiviruses kullanmak için önemli bir avantaj ise, tüm hücrelerin istenilen yapı ifade etmek mümkündür. Yeterli hücre eksojen Ub/ubl ifade sürece bu arıtma prosedürü için gerçek bir sorun olmayabilir, ama sorun daha az veya hiç hücrelerde zenginleştirme ile klonal bir varyasyon olabilir çeşitli pasajlar üzerinde uzun vadeli kültür ile gelebilir Ifa -de. Ancak bu dezavantaj, direnç seçim geni veya sadece pozitif hücreleri seçmek için akış sitometrisinde kullanabilen floresan protein içeren lentivirüsler kullanılarak kolayca atlanabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag