Summary
Этот протокол описывает, как измерить кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. Этот метод полезен для фундаментальных биологических исследований по здоровью кишечника, связанных с взаимодействием кишечных бактерий и их хозяина и для скрининга для выявления пробиотических и химических агентов для лечения синдрома вытекающей кишечника и воспалительных заболеваний кишечника.
Abstract
В живых организмах гиперпроницаемость кишечника является серьезным симптомом, который приводит ко многим воспалительным заболеваниям кишечника (IBD). Caenorhabditis elegans является немлекопитающим животных модель, которая широко используется в качестве системы анализа из-за его короткий срок службы, прозрачность, рентабельность и отсутствие вопросов этики животных. В этом исследовании был разработан метод для исследования воздействия различных бактерий и 3,3'-diindolylmethane (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans с высокой пропускной способностью системы анализа изображений. Черви были инфицированы различными бактериями кишечника или cotreated с DIM в течение 48 ч и кормили флуоресцен изотиоцианат (FITC)-dextran ночь. Затем проницаемость кишечника была изучена путем сравнения флуоресценции изображений и интенсивности флуоресценции внутри червя органов. Этот метод может также иметь потенциал для выявления пробиотических и патогенных кишечных бактерий, которые влияют на проницаемость кишечника в животной модели и эффективен для изучения влияния вредных или способствующих здоровью химических веществ на проницаемость кишечника и кишечного здоровья. Однако, этот протокол также имеет некоторые значительные ограничения на генетическом уровне, особенно для определения того, какие гены изменяются для контроля болезни, потому что этот метод в основном используется для фенотипического определения. Кроме того, этот метод ограничивается определением того, какие именно патогенные субстраты вызывают воспаление или увеличивают проницаемость кишечника червей во время инфекции. Поэтому для полной оценки функции бактерий и химических веществ при определении проницаемости кишечника необходимы дальнейшие углубленные исследования, включая изучение молекулярно-генетического механизма с использованием мутантных бактерий и нематод, а также анализ химических компонентов бактерий.
Introduction
Проницаемость кишечника считается одним из основных барьеров, связанных с кишечной микробиотой и слизистым иммунитетом и, вероятно, будет зависеть от нескольких факторов, таких как изменения микрофлоры кишечника, эпителиальные нарушения, или изменения слизистого слоя1. Последние документы сообщили эффективные протоколы для измерения кишечной проницаемости культивированных клеток кишечника человека путем анализа флуоресценции поток ставки через слой клеток кишечника2, но меньше научных работ представляют собой подходящую процедуру для измерения проницаемости кишечника в нематод, особенно в C. elegans, с помощью FITC-dextran пятен.
Есть два репрезентативных протокола для измерения проницаемости кишечника в C. elegans с использованием Нила красный3 и erioglaucine динайди (или Smurf асссе)4,5. В этом протоколе мы использовали FITC-dextran (средний молекулярный вес 10 000), который имеет гораздо более высокий молекулярный вес, чем красный Нил (МВс 318,37) и эриоглауцин динайоя (МВт 792,85). FITC-dextran больше похож, чем красный Нил или erioglaucine динатрия красителей фактических макромолекулярных питательных веществ, таких как углеводы, которые поглощаются через кишечный слой. Проницаемость кишечника C. elegans, питаемых с помощью erioglaucine disodium (голубой краситель Smurf), может быть легко оценена без флуоресценционной микроскопии. Однако, в анализе Smurf, количественный анализ кишечной проницаемости затруднен из-за отсутсвия стандартизации и должен быть оценен вручную4,5. В случае Красного нила, Красный Нил также пятна липидных капель в клетках, которые могут помешать точное определение проницаемости кишечника в C. elegans6. Настоящие протоколы позволяют быстро и точно анализировать проницаемость кишечника у C. elegans, обработанных различными кишечными бактериями и химическими веществами, избегая при этом неспецифических липидных окрашивания.
C. elegans является типичной моделью в биологических областях из-за своей доступной цене, легкой манипуляции, ограниченных вопросов этики животных, и короткий срок службы, что выгодно для быстрых экспериментов7. В частности, после публикации всего генома C. elegans, почти 40% генов гена c. elegans были признаны ортологичными для генов, вызывающих заболевания человека8. Кроме того, прозрачный организм позволяет наблюдать внутри организма, что выгодно для исследования клеточных событий и для применения флуоресценции в клеточной биологии, например, окрашивания стволовых клеток с помощью DAPI или иммуногистохимии9. C. elegans часто используется в качестве экспериментального животного для изучения взаимодействия микрофлоры кишечника и хозяина; кроме того, C. elegans используется для проверки здоровья поощрения пробиотических бактерий10,11,12, а также диетические химические вещества содействия здоровья кишечника13,14.
Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis являются известными бактериями кишечника, которые негативно влияют на желудочно-кишечную систему, особенно на кишечные клетки кишечника15,16. Таким образом, измерение проницаемости кишечника, вызванного этими бактериями, необходимо для скрининга и разработки новых препаратов, которые могут восстановить и уменьшить ущерб, причиненный бактериальным воспалением и инфекцией. В этом протоколе мы проверили влияние этих кишечных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans.
Мы также сообщаем об оптимизированном протоколе для тестирования химических веществ на проницаемости кишечника C. elegans. Для этой цели мы использовали 3,3'-diindolylmethane (DIM) в качестве модели химического вещества, потому что DIM является биологически активным метаболитом соединение, полученное из индола-3-карбинол, который присутствует в Brassica пищевых растений, и, как сообщается, терапевтическое воздействие на IBD у мышей17,18. Кроме того, мы недавно обнаружили, что DIM улучшает дисфункцию проницаемости кишечника как в культивированных клеток кишечника человека, а также модель нематод C. elegans19.
В этом исследовании мы использовали три различных экспериментальных условия. Во-первых, мы измерили влияние различных бактерий, P. aeruginosa и E. faecalis, на проницаемость кишечника(рисунок 1). Во-вторых, мы измерили влияние живой и теплоинактивированной P. aeruginosa на проницаемость кишечника(рисунок 2). В-третьих, мы измерили влияние DIM (модель химического) на кишечной проницаемости C. elegans кормили с P. aeruginosa (Рисунок 3).
Целью данного исследования было разработать оптимизированные протоколы, которые измеряют проницаемость кишечника C. elegans, которая изменяется путем лечения различными кишечными бактериями, а также с химическими веществами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка P. aeruginosa PAO1 и Escherichia coli OP50 Культура
- Приготовьте 500 мл стерилизованной среды Лурия-Бертани (LB)(таблица 1)и привить одну колонию P. aeruginosa в среду. Инкубировать культуру от 14 до 15 ч при 37 градусах Цельсия со скоростью встряхивания 150 об/мин.
- Равномерно распределить бактериальную культуру на две центрифуги 500 мл и центрифуги труб при 3220 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
- Удалите супернатант до тех пор, пока объем не будет 50 мл (одна десятая от первоначального объема) и повторно бактериальных гранул.
- Храните концентрированную бактериальную культуру при 4 градусах Цельсия до использования. Период хранения культуры P. aeruginosa может составить до 1 месяца, но свежая культура лучше для индуцирования повреждения кишечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. В дополнение к целому живые бактерии, супернатант бактериальной культуры могут быть использованы для проверки воздействия кишечных бактерий19. - Для подготовки E. coli OP50, культура E. coli OP50 в среде DYT(таблица 1), а затем применить аналогичные шаги к описанным выше, но уменьшить объем до одной шестой от первоначального объема. Например, если начальный объем составляет 500 мл, после удаления супернатанта, оставшийся объем составляет примерно 83 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
2. Подготовка Enterococcus faecalis KCTC 3206 Культура
- Приготовьте 500 мл стерилизованного инфузии сердца головного мозга (BHI) бульона(таблица 1).
- Привить одну колонию в 500 мл бульона BHI и инкубировать культуру для 14-15 h в трясущемся инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 150 об/мин.
- Равномерно распределить бактериальную культуру на две центрифуги 500 мл и центрифуги труб при 3220 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
- Удалите супернатант до тех пор, пока объем не будет 50 мл (одна десятая от первоначального объема) и повторно йен.
- Храните концентрированную бактериальную культуру при 4 градусах Цельсия до использования. Свежая культура лучше подходит для тестирования воздействия на проницаемость кишечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
3. Подготовка теплоинактивированной кишечной палочки OP50 и тепло-инактивированной P. aeruginosa PAO1 Культуры
- Культура и урожай бактерий, как описано выше (шаги 1.1-1.3).
- Теплоинактивировать E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 культуры, как описано ранее20,21,22. Для тепловой инактивации инкубировать повторно ежеобиозные бактерии при температуре 65 градусов по Цельсию (водяная ванна) в течение 30 мин.
- Охладите концентрированную бактериальную культуру до комнатной температуры и храните ее при температуре 4 градусов до использования. Срок хранения может составить до 1 месяца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
4. Подготовка пластин роста нематод (NGM) для тестирования воздействия различных бактерий на кишечную проницаемость C. elegans
- Поместите 1,25 г пептона, 1,5 г NaCl, 8,5 г агара, магнитный мешалку и 487,5 мл дистиллированной воды в стеклянную бутылку 500 мл(таблица 1).
- Смешайте смесь хорошо, автоклав смесь в течение 15 минут при 121 градусов по Цельсию и охладить смесь до 55 градусов по Цельсию в водяной бане в течение 30 минут.
- Удалите среду из водяной ванны, добавьте компоненты (0,5 мл 1 М CaCl2, 0,5 мл холестерина, 0,5 мл MgSO4, 12,5 мл KPO4) (Таблица 1) в NGM, и хорошо перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все отдельные компоненты должны быть аутоклавизированы, за исключением холестерина (растворяется в абсолютном этаноле), и каждый экспериментальный шаг должен осуществляться на чистой скамейке. - Распределите 20 мл NGM на каждую тарелку Петри длиной 90 х 15 мм и дайте агару затвердеть на чистой скамейке при комнатной температуре (примерно 20 градусов по Цельсию). Пластины NGM могут храниться до одного месяца при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Пластины NGM, используемые для окрашивания FITC-dextran, были подготовлены по той же процедуре (со ступеней 4.1-4.3). 10 мл NGM был распространен на каждый 60 х 15 мм Петри блюдо и позволило затвердеть на чистой скамейке при комнатной температуре (примерно 20 градусов по Цельсию). - Удалите бактериальной культуры из холодильника 4 кВ и вихрь культуры тщательно, прежде чем распространять культуру на пластины NGM.
- Добавьте в общей сложности 800 кЛ бактериальной культуры к каждой свежей пластине NGM, и дайте пластинам высохнуть в инкубаторе 20 градусов на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для первого эксперимента(Рисунок 1), были подготовлены две пластины NGM с E. coli OP50, одна пластина NGM с P. aeruginosa PAO1 и одна пластина NGM с E. faecalis KCTC3206. Для второго эксперимента(рисунок 2),две пластины NGM с живой E. coli OP50, одна пластина NGM с живой P. aeruginosa PAO1, и одна пластина NGM с тепло-инактивированной P. aeruginosa PAO1.
5. Подготовка NGM пластин для тестирования воздействия химического (DIM) на кишечной проницаемости C. elegans Fed с P. aeruginosa
- Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды, магнитный мешалку и 6,8 г агара в стеклянную бутылку 500 мл (NGM agar).
- Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды и магнитный мешалку без агара еще к стеклянной бутылке 500 мл (бульон NGM).
- Автоклав две бутылки (от шагов 5,1-5,2), одна пустая стеклянная бутылка 100 мл, и одна пустая стеклянная бутылка 500 мл в течение 15 минут при 121 градусов по Цельсию. Затем позвольте среде, содержащей бутылки, остыть до 55 градусов по Цельсию в водяной бане в течение 30 мин. Держите агар-среду в водяной бане и удалите бутылку, содержащую бульон (от шага 5.2) для следующего шага.
- Добавьте аддитивные химические вещества в бульон NGM: 0,4 мл 1 М CaCl2, 0,4 мл холестерина в этаноле (мл), 0,4 мл 1 М MgSO4 и 10 мл 1 M KPO4 (все эти компоненты должны быть стерилизованы отдельно от холестерина в этаноле). Затем тщательно перемешать смесь с помощью магнитного мешалки при 55 градусах Цельсия.
- Этикетка autoclaved пустой 500 мл стеклянная бутылка с диметилсульфод (DMSO) и autoclaved пустой 100 мл стеклянная бутылка с DIM.
- Передача 50 мл бульона NGM в бутылку DIM-маркированной 100 мл. Добавьте 500 кл. 20 мМ DIM бульон в бутылку и хорошо перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: DIM растворяется в DMSO (20 мМ DIM запас). - Быстро удалите NGM агар среды из водяной ванны, добавить 50 мл NGM агар среды в DIM-маркированной бутылки и тщательно перемешать.
- Поместите 20 мл аликот DIM-содержащих NGM среды в каждом 90 мм х 15 мм Петри блюдо. Приблизительно пять DIM-содержащих NGM пластин ы может быть сделано из этого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация DIM в каждой пластине NGM составит 100 мкм. - Для приготовления пластины NGM, содержащей DMSO, перенесите 150 мл бульона NGM в бутылку dMSO с маркировкой 500 мл. Добавьте 1,5 мл DMSO в бутылку и хорошо перемешайте.
- Добавьте 150 мл агар-среды NGM в бутылку с маркировкой DMSO и тщательно перемешайте.
- Поместите 20 мл аликот DMSO-содержащих NGM среды в каждом 90 мм х 15 мм Петри блюдо. Приблизительно пятнадцать Пластин NGM, содержащих DMSO, могут быть сделаны с этого шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация ДМСО в каждой пластине NGM составит 0,5%. - Утвердите пластины при комнатной температуре, по крайней мере 3 ч и хранить их при температуре 4 градусов по Цельсию до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Удалите E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 культуры из 4 кв кк холодильник (от шага 1.4) и вихрь культуры должным образом, прежде чем распространиться на пластины NGM.
- Положите 800 зл E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 бактериальной культуры на каждой свежей пластине агар NGM и дайте пластины высохнуть в инкубаторе 20 градусов по Цельсию в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Для третьего эксперимента(рисунок 3), были подготовлены две пластины DMSO-содержащих NGM, покрытые живой E. coli OP50, одна пластина DMSO-содержащая NGM, покрытая живым P. aeruginosa PAO1, и одна DIM-содержащая пластину NGM, покрытую живой P. aeruginosa PAO1.
6. Подготовка синхронизированных с возрастом C. elegans
- Выращивайте червей на твердой пластине NGM и кормите их кишечной палочкой OP50 до тех пор, пока не будет достигнута желаемая популяция.
- Синхронизация яиц с помощью либо приурочен метод откладки яйцеклетки или отбеливания решение лечения, как описано ранее20,23,24.
7. Лечение бактерий или DIM и FITC-dextran Кормления
- Инкубировать возрастно-синхронизированные яйца при 20 градусах по Цельсию на 64 ч на пластинах NGM, дополненных живой e. coli OP50 в качестве пищи.
- Вымойте возрастно-синхронизированную личинку L4 с S-буфером и перенесите их (более 500 червей) на обработку NGM пластин, содержащих различные бактерии и химические вещества (описанные в NOTE следующий шаг 4.6 и 5.14,). Инкубировать их при 20 градусах по Цельсию в течение 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время лечения может варьироваться от 24 до 72 ч, в зависимости от бактерий и химических веществ, используемых. Терапевтический или профилактический эффект DIM также может быть оценен путем предварительного лечения червей с патогенами, а затем лечение червей с DIM (терапевтический эффект) или предварительной обработки червей с DIM, а затем лечение с патогенами (профилактический эффект)19. - Для приготовления пластин FITC-dextran-дополненных, смешайте 2 мл теплоинактивированной кишечной палочки OP50 с 4 мг FITC-dextran. Затем разделите 100 л смеси FITC-dextran и E. coli OP50 на двадцать свежих агарных пластин NGM (60 мм х 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 ч на чистой скамейке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация FITC-dextran в каждой пластине NGM составит 20 мкг/мл. - Подготовьте пять пластин NGM, содержащих E. coli OP50, без FITC-dextran для лечения управления транспортным средством. Для этого разделите 100 л тепло-инактивированных E. coli OP50 на каждую свежую агар-пластину NGM (60 мм х 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 ч на чистой скамейке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется пятнадцать пластин NGM FITC-dextran и пять пластин NGM без FITC-dextran. - После 48 ч лечения (от шага 7.2), мыть червей с S-буфер, передать червей FITC-dextran дополненные пластины и NGM пластины без FITC-dextran, и инкубировать пластины на ночь (14-15 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой группы лечения требуется 5 повторений окрашивания FITC-dextran (или кормления для управления транспортнымсредством). - Вымойте червей с S-буферик и дайте им ползать в свежей пластине NGM агар в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется в общей сложности 20 свежих пластин NGM. На этом этапе вы можете использовать пластину NGM, дополненную без или с E. coli OP50. - Добавьте 50 qL 4% раствора формальдегида к каждому колодцу черной пластины с плоским дном 96-наилучшим образом. Перенесите около 50 червей с каждой пластины NGM в каждую скважину для измерений флуоресценции. После 1 до 2 мин, тщательно удалить все формальдегид из каждой скважины и добавить 100 злител монтажа среды, чтобы покрыть скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегидный раствор (4%) используется для обездвиживания и фиксации червей. Для каждой группы обработки для анализа изображений используется 5 скважин (5 репликаток).
8. Изображение C. elegans с системой визуализации оперетты и определение кишечной проницаемости путем измерения FITC-декрен флуоресценции uptake
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная стереомикроскопия может быть использована для анализа изображений вместо системы Operetta.
- Захват флуоресценции изображения и измерения интенсивности флуоресценции с помощью системы высокой содержания изображений оперетты и анализировать изображения с помощью программного обеспечения Гармония.
- В программном обеспечении Harmony нажмите на иконку Open, чтобы открыть крышку и поместить пластину в машину.
- Настройка параметров.
- Нажмите Настройте,выберите тип пластины (96-ну хорошо кукурузы плоским дном) и добавить каналы (ярко-поле и EGFP каналов).
- Отрегулируйте макет. Перейдите к выбору Layout,а затем выберите Трек и отрегулируйте параметры (первое изображение на 1 мкм, количество плоскостей 10, расстояние 1 мкм).
- Выберите одну из лечебных скважин и одно поле захвата и пресс-тест, чтобы проверить, являются ли фотографии удовлетворительными в разделе эксперимента Run.
- Если изображения являются удовлетворительными, вернитесь в раздел Настройка и нажмите значок сбросить в конце экрана. Затем выберите все целевые скважины и подходящее количество месторождений.
- Перейти к запуску эксперимент снова и введите имя пластины, а затем нажмите Начало, чтобы начать обработку.
- Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел анализа изображений и введем изображение. Найдите ячейку, выбрав канал EGFP и метод B. Отрегулируйте общий порог до 0,5, площадь до йgt;200 мкм2, разделенный фактор до 3,0, индивидуальный порог до 0,18 и контраст с более чем 0,18. Затем вычислите свойства интенсивности и выберите среднее в качестве вывода. Нажмите значок Применить, чтобы сохранить установку.
- Перейдите в раздел Оценка для измерения интенсивности путем получения тепловой карты и таблицы данных. Установите параметр чтения для клеток - Интенсивность ячейки EGFP Среднее - Среднее в Ну и начать оценку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Чтобы извлечь данные из Operetta, нажмите кнопку Настройка и выберите управление данными.
- Выберите Архив Write,а затем откройте просмотр и выберите файл.
- Чтобы выбрать файл, щелкните маленький сигнал в левом углу, а затем нажмите Измерение и выберите имя плиты.
- Выберите файл и нажмите OK.
- Выберите путь для сохранения файла, нажав на сигнал Просмотра на активном пути.
- Нажмите "Начать", чтобы сохранить файл данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
9. Статистический анализ фуоресценции FITC-dextran C. elegans
- Импортируйте данные и вычисляем среднее и стандартное отклонение (SD) с помощью программного обеспечения статистики.
- Проанализируйте существенную разницу с односторонним анализом дисперсии (ANOVA), за которым следует многократный сравнительный тест Туки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После инкубации с P. aeruginosa PAO1, C. elegans показал значительное увеличение FITC-декрен флуоресценции в организме червя по сравнению с флуоресценцией, показанной после инкубации с другими двумя бактериальными штаммами (Рисунок 1). Интенсивность флуоресценции червей, питаемых кишечной палочкой OP50, P. aeruginosa PAO1 и E. faecalis KCTC3206, составила 100,0 и 6,6, 369,7 и 38,9 и 105,6 и 10,6%, соответственно. Данные подчеркивают, что P. aeruginosa причинил более жизненно важный ущерб эпителиального барьера кишки, и, следовательно, черви продемонстрировали резкое увеличение их кишечной проницаемости. Основываясь на этом результате, FITC-dextran может легко проникать через кишечный слой, поэтому P. aeruginosa был выбран в качестве потенциального репететора кандидата для скрининга эффектов DIM. Хотя E. faecalis является кишечным патогеном, который может производить внеклеточный супероксид и перекись водорода, которые повреждают гентовые эпителиальные клетки ДНК15, в некоторых случаях, E. faecalis также известен как потенциальный пробиотические бактерии из-за его способности производить бактериоцины против некоторых патогенов25,26. Функции пробиотика включают соблюдение эпителиальных поверхностей, стойкость в желудочно-кишечном тракте человека, иммунную стимуляцию и антагонистическую активность против кишечных патогенов26. Таким образом, проницаемость кишечника червей, инкубированных E. фекалиями, осталась неизменной по сравнению с червями управления транспортнымсредством. Этот результат показывает, что количество инфекции может быть изучено увеличением интенсивности флуоресценции, и P. aeruginosa вызывает больше кишечной проницаемости, чем другие штаммы.
На рисунке 2 показана разница между живой и теплоинактивированной P. aeruginosa PAO1 на основе интенсивности флуоресценции FITC-dextran в теле червя. Как флуоресценция изображения и статистические данные показывают, что патоген не может вызвать какой-либо токсичности нематод после тепловой инактивации. P. aeruginosa может производить экзотоксин А - мощный внеклеточный цитотоксин, который является смертельным для многих животных27. Экзотоксин А может быть быстро отменен при нагревании при 45-C до 60 c28. Поэтому теплоинактивированная P. aeruginosa не смогла повредить проницаемость кишечной эпителии червей. Супернатант культуры P. aeruginosa PAO1 значительно повредил проницаемость кишечника, и, следовательно, культурный супернатант вместо целых клеток P. aeruginosa может быть использован для индуцирования дисфункции проницаемости кишечника19. Супернатант содержит эндотоксины, экзотоксин а и липополисахариды29,и эти компоненты, как известно, вызывают токсичность клеток30,31. Таким образом, эти компоненты супернатанта могут повлиять на проницаемость кишечника, хотя мы не проверяли прямое влияние экзотоксинов и липополисахаридов на проницаемость кишечника у C. elegans.
DIM колечение для 48 ч значительно снизилось FITC-декрен флуоресценции интенсивности внутри кишки червей по сравнению с P. aeruginosa одного лечения(Рисунок 3C,D). Статистический анализ с помощью одностороннего теста ANOVA и Tukey's multiple comparison показал, что после лечения DIM, средняя интенсивность флуоресценции была значительно снижена по сравнению с интенсивностью флуоресценции P. aeruginosa-только лечение. Интенсивность флуоресценции червей, обработанных P. aeruginosa-только и P. aeruginosa плюс DIM были 486,3 и 41,7 и 414,2 и 25,0%, соответственно(Рисунок 3E). Основываясь на этом результате, DIM можно считать хорошим природным продуктом для лечения дисфункции проницаемости кишечника, вызванной бактериальными инфекциями. Этот результат показал, что DIM может утихать воспаление клеток в клетках кишечника, что снижает проницаемость кишечника19. Этот результат аналогичен результатам, полученным в мышиной модели, в которой DIM показал значительное снижение воспаления в толстой кишке32.
Рисунок 1: Влияние различных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans. Микроскопия изображений червей, включая яркое поле, fluorescence FITC (зеленый канал), и слитые изображения. Микроскопия изображения червей из (A) E. coli OP50 без FITC-dextran кормления, (B) E. coli с FITC-dextran кормления, (C) P. aeruginosa PAO1 с FITC-dextran кормления, и (( D) E. faecalis KCTC3206 с FITC-dextran кормления. Шкала бар 1 мм (белый), и 200 мкм (черный). Возраст-синхронизированные личинки L4 были инкубированы для 48 h в пластинах NGM посеянных с E. coli (A, B), P. aeruginosa (C), и E. faecalis (D). Затем черви были переведены на пластины, содержащие FITC-dextran (B-D), за исключением управления транспортным средством(A). (E) интенсивность флуоресценции FITC различных бактериальных методов лечения. Более высокий процент флуоресценции FITC указывает на более высокую проницаемость кишечника. Столбцы и бары ошибок указывают на среднее значение SD. П Злт; 0,001 для существенного отличия от FITC-dextran-обработанных червей, питаемых P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n No 5). Этот график является репрезентативным для двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние живой и теплоинактивированной P. aeruginosa PAO1 на проницаемость кишечника C. elegans. Микроскопия изображения червей из (A) жить E. coli OP50 без FITC-dextran кормления, (B) жить E. coli с FITC-dextran кормления, (C) жить P. aeruginosa PAO1 с FITC-dextran кормления, и (( D) тепло-инактивированных P. aeruginosa с FITC-dextran кормления. Шкала бар 1 мм (белый), и 200 мкм (черный). Возраст-синхронизированные личинки L4 были инкубированы для 48 h в пластинах NGM посеянных с живыми E. coli (A, B), жить P. aeruginosa (C), и тепло-инактивированных P. aeruginosa (D). Затем черви были переведены на пластины, содержащие FITC-dextran (B-D), за исключением управления транспортным средством(A). (E) ИНТЕНСИВНОСТЬ флуоресценции FITC, сравнивая живую и теплоинактивированную P. aeruginosa PAO1. Столбцы и бары ошибок указывают на среднее значение SD. P qlt; 0,001 иP lt; 0,01 для существенного отличия от управления транспортным средством. П Злт; 0,001 для существенного отличия от FITC-dextran-обработанных червей, питаемых живыми P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n No 5). Этот график является репрезентативным для двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние DIM на проницаемость кишечника C. elegans кормили P. aeruginosa. Микроскопия изображения червей из (A) E. coli OP50 без FITC-dextran кормления, (B) E. coli с FITC-dextran кормления, (C) P. aeruginosa PAO1 с FITC-dextran кормления, и (( D) P. aeruginosa и DIM (100 мкм) cotreatment. Шкала бар 1 мм (белый), и 200 мкм (черный). Возраст-синхронизированные личинки L4 были инкубированы для 48 h в пластинах NGM посеянных с живыми E. coli (A, B), в реальном маштабе времени P. aeruginosa (C), в реальном маштабе времени P. aeruginosa и DIM (D). Затем черви были переведены на пластины, содержащие FITC-dextran (B-D), за исключением управления транспортным средством(A). (E) Интенсивность флуоресценции FITC указывает на то, что проницаемость кишечника C. elegans была затронута DIM. Столбцы и бары ошибок указывают на среднее значение SD. П Злт; 0,001 и Пзлт; 0,01 для существенного отличия от FITC-dextran-обработанных червей, подаваемых P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n No 5). Этот график является репрезентативным для двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя этот новый метод определения проницаемости кишечника в C. elegans, который сочетает в себе автоматизированную флуоресцентную микроскопию и количественный анализ изображений, различия, вызванные кишечными микроорганизмами или химическими веществами, могут быть определены в vivo, в частности, в кишечнике C. elegans. Этот протокол полезен для исследований проницаемости кишечника и применим ко многим задачам, таким как определение реактивных видов кислорода (ROS) в стрессовых условиях и морфологические исследования, благодаря его удобству и легкой манипуляции. Кроме того, этот метод может быть использован для определения воздействия терапевтических и профилактических методов против нескольких патогенов в C. elegans. В частности, это может быть эффективный протокол для исследования механизмов различных бактериальных штаммов, в том числе как вредных, так и полезных бактерий. Некоторые патогенные микроорганизмы и пробиотические бактерии с аналогичными структурами оказывают различное воздействие на хозяина33,34. Эта процедура может помочь в оценке того, какой механизм используют бактерии и где целевые субстраты могут быть выделены внеклеточные или внутриклеточные. Кроме того, этот метод может также помочь укрепить гипотезу о том, что тепловая обработка играет жизненно важную роль в инактивации патогенов.
Однако, Есть также некоторые трудности во время этой процедуры. Во-первых, количество червей в каждой пластине имеет важное значение для статистически значимых результатов и надежного обнаружения червей, поэтому рекомендуется 70-90% выпуклости (не менее 50 червей на скважину). Соответственно, для получения подходящих червей следует проводить пробные эксперименты. Во-вторых, свойства пластинявляются одним из важных факторов, влияющих на качество изображения и определение интенсивности, особенно для нижнего материала. В некоторых передовых экспериментах, стеклянное дно является лучшим вариантом для измерения флуоресценции из-за его отличное оптическое качество. Однако, из-за высокой цены, полистирол дно часто используется, хотя качество не так высока, как у стекла дно. Наконец, методы покрытия пластин для C. elegans требуют оптимизации. В этом эксперименте была применена флуоресцентная монтирующая среда, поскольку она может сохранять и улучшать маркировку секций тканей, но она не в состоянии правильно зафиксировать червей на дне пластины.
Этот протокол имеет ограничения; как C. elegans является нематод, дальнейшие эксперименты, такие как оценка в человеческих кишечных клеток монослоев и у млекопитающих, должны быть выполнены. В этом методе были определены фенотипические изменения в C. elegans кормили патогенных бактерий и химических веществ. Таким образом, молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе патогенных или пробиотических эффектов кишечных бактерий, а также терапевтическое воздействие химических веществ должны быть дополнительно выяснены. Специфические сигнальные пути, оказываемые патогенной бактериальной инфекцией и терапевтическим исправным воздействием химических веществ, могут быть оценены с помощью различных бактерий-мутантов и мутантных червей. Кроме того, дальнейшие углубленные исследования выявления химических компонентов, ответственных за патогенные и пробиотические эффекты кишечных бактерий будет полезным.
Здесь мы сообщаем экспериментальный протокол для измерения проницаемости кишечника в C. elegans, обработанных различными бактериями и химическими веществами с помощью FITC-dextran кормления. Мы считаем, что эти протоколы будут полезны для фундаментальных биологических исследований, таких как изучение взаимодействия кишечной микробиоты и здоровья кишечника, а также для развития пробиотиков и нутрицевтики для профилактики и лечения проблем со здоровьем кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Корейским институтом науки и техники в интрамуральных исследований грант (2E29563).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
