Summary
介绍了飞秒近红外刺激拉曼光谱仪的信号生成和优化、测量、数据采集和数据处理的详细信息。近红外刺激拉曼研究β-胡萝卜素在苯的兴奋状态动力学作为代表性的应用。
Abstract
Femtos2 时间解刺激拉曼光谱是一种有希望的方法，用于观察近红外（近 IR） 过渡的短寿命瞬变的结构动力学，因为它可以克服近红外区域自发拉曼光谱仪的低灵敏度。在这里，我们描述了我们最近开发的一个飞秒时间解析近红外多路复用刺激拉曼光谱仪的技术细节。还提供了信号生成和优化、测量、数据采集以及记录数据的校准和校正的描述。我们介绍了光谱仪的应用，以分析环胡萝卜素在苯溶液中的兴奋状态动力学。在第二低兴奋单一 （S2）状态和最低兴奋单一 （S1）状态中清楚地观察到在记录的时间解析刺激拉曼光谱中，β-C 拉伸带的 β-胡萝卜素。飞秒时间解析近红外刺激拉曼光谱仪适用于从简单分子到复杂材料的α-偶联系统的结构动力学。
Introduction
拉曼光谱是一种强大而通用的工具，用于研究从简单气体、液体和固体到功能材料和生物系统的各种样品中的分子结构。当激发光的光子能量与分子的电子过渡能量重合时，拉曼散射会显著增强。共振拉曼效应使我们能够有选择地观察由多种分子组成的样本中的一个物种的拉曼光谱。近红外电子转换作为研究具有大型-共结结构的分子的兴奋状态动力学的探索，引起了人们的广泛关注。最低兴奋单态的能量和寿命已经确定为几种类胡萝卜素，它们具有一维多烯链1，2，3。中性和带电激发动力学已被广泛研究为薄膜4，5，6，7，纳米粒子8和溶液9，10，11的各种光导聚合物。如果对这些系统应用时间解析的近红外拉曼光谱，则可获得有关瞬变结构的详细信息。然而，只有少数研究被报道在时间解析的近红外拉曼光谱12，13，14，15，16，因为近红外拉曼光谱仪的灵敏度极低。低灵敏度主要源于近红外拉曼散射的低概率。自发拉曼散射的概率与 αi=s3成正比，其中 αi和 αs分别是激发光和拉曼散射光的频率。此外，市售的近红外探测器的灵敏度远低于在紫外线和可见区域运行的 CCD 探测器。
飞秒时间解析刺激拉曼光谱已成为一种新的方法来观察拉曼主动振动带的时间依赖性变化，超越激光脉冲17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28的明显傅立叶变换极限 ，29，30，31，32，33.刺激的拉曼散射是由两个激光脉冲的辐照产生的：拉曼泵和探针脉冲。这里假定拉曼泵脉冲的频率大于探头脉冲。当拉曼泵和探针脉冲的频率差与拉曼有源分子振动的频率一致时，辐照体积中大量分子的振动是相干激发的。相干分子振动引起的非线性偏振增强了探针脉冲的电场。该技术对于近红外拉曼光谱学特别强大，因为刺激拉曼散射可以解决时间解析的近红外自发拉曼光谱仪的灵敏度问题。刺激的拉曼散射被检测为探头脉冲的强度变化。即使近红外探测器具有低灵敏度，当探头强度充分增加时，也会检测到刺激的拉曼散射。激发拉曼散射的概率与 ±RP=SRS成正比，其中 ±RP和 +SRS是拉曼泵脉冲和刺激拉曼散射的频率，分别为20。刺激拉曼散射、αRP和 +SRS的频率分别相当于自发拉曼散射的 αi和 αs。我们最近开发了一个飞秒时间解析近红外拉曼光谱仪，使用刺激拉曼散射来研究在α-conju系统2、3、7、10中产生的短寿命瞬变光的结构和动力学。在本文中，我们将介绍我们第二次时间解析近红外多路复用刺激拉曼光谱仪的技术细节。介绍了光学对齐、时间解析刺激拉曼光谱的采集以及记录光谱的校准和校正。作为光谱仪的代表性应用，研究了β-胡萝卜素在环苯溶液中的兴奋状态动力学。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 电气设备的启动
- 根据其操作手册打开飞秒 Ti：蓝宝石激光系统。等待 2 小时，让激光系统预热。
- 在系统预热时打开光学斩波器、平移级控制器、光谱仪、InGaAs 阵列探测器和计算机的电源开关。在探测器的德瓦尔中注入液氮。
2. 光谱仪的光学对准
- 镜像调整（图 1B）
- 检查后视镜支座上的支架位置。
- 如果支架位于支座的下部，则顺时针和逆时针转动支座的上部旋钮，使反射的激光束沿垂直方向向下和向上移动。如果支架位于支座的上部，则向相反方向转动旋钮。
- 如果支架位于支座的右侧，则顺时针方向转动支座左侧的旋钮，让反射的激光束分别沿水平方向左右移动。如果支架位于支座的左侧，则向相反方向转动旋钮。
- 镜头对齐
- 将带有网格的名片作为屏幕放置在镜头后面。
- 拆下镜头。引入事件光束，让它击中屏幕。用笔标记屏幕上光束点的位置。
- 挡住光束并放置镜头。引入光束并确认它完全击中屏幕上的标记。如果没有，请调整镜头的垂直和水平位置。
- 准备一张带孔的名片。让射化光束穿过镜头前面的孔，并确认透镜的光束镜面反射沿与射向光束完全相反的方向移动。如果没有，请调整镜头的角度。
- 激光束对准（图1C）
- 将名片放在虹膜 2 （i2） 后面作为屏幕。
- 通过根据第 2.1 节调整镜 1 （m1）， 让光束通过 i1 的中心。通过根据第 2.1 节调整 m2，让光束通过 i2 的中心。
- 确认光束同时穿过 i1 和 i2 的中心。如果光束未通过 i1 中心，请重复步骤 2.3.2，直到光束穿过两个虹膜的中心。
- 光学延迟线对齐（图1D）
- 拆下光延时线 （ODL） 上的 m3 和 m4。将 i1 置于 m3 中心高度的 m3 位置。
- 通过放置舞台控制器的方向按钮，尽可能将舞台移向 m2。通过根据第 2.1 节调整 m1，让光束通过 i1 的中心。
- 通过放置舞台控制器的方向按钮，尽可能将舞台与 m2 分开。通过根据第 2.1 节调整 m2，让光束通过 i1 的中心。
- 尽可能将舞台向光束输入移动，并确认光束通过 i1 的中心。如果光束在步骤 2.4.3 后未通过 i1 中心，请重复步骤 2.4.2~2.4.3，直到光束在舞台两端穿过 i1 的中心。
- 将 i1 从 m3 位置移开。将 m3 和 m4 放在 ODL 上。通过根据步骤 2.4.2_2.4.4 调整 m3 和 m4，让光束通过 i2 的中心。
- 步骤 2.4.1–2.4.5 完成后，通过根据步骤 2.4.2 和 2.4.5 调整 m1 和 m2，让光束通过 i2 中心。
- 白光连续生成（图1A）
- 将可变中性密度滤波器 （VND） VND1 置于事件光束路径中。将名片与 VND1 分开放置 200 mm 作为屏幕。
- 转动 VND1，直到事件光束达到 VND1 的最高光密度位置，其中传输的光束具有最低的功率。
- 将镜头 （L） L1（焦距 = 100 mm）放在 VND1 后面。将 3 mm 厚的蓝宝石板 （SP） 与 L1 相距 105 mm，其中 SP 稍稍位于梁对焦的后面，让光束通过靠近边缘的 SP。
- 将 I6 的直径设置为 ±5 mm。
- 转动 VND1 可逐渐增加传输光束的功率，直到在屏幕上观察到黄白色斑点。非常小心地向同一方向转动 VND1，直到屏幕上的黄白色斑点周围有紫色环。
- 探头光束对准（图1A）
- 根据第 2.3 节调整两对后视镜 （M4、M5） 和 （M7、 M8）。根据第 2.4 节调整 ODL2。根据第 2.3 节调整 M12 和 M13。
- 根据第 2.5 节生成白光连续体。
- 拆下彩色玻璃滤镜 （F） F1 和 F2 以及偏振器 （P） P1。
- 用凹面镜 （CM） 反射白光连续体。让反射光束在 SP 旁边通过。
- 根据第 2.1 节，通过分别调整 M14 和 M15，让光束击中 M15 和 M16 的中心。拆下 L2、L3 和 L4。通过调整 M16，让光束击中光谱仪入口狭缝的中心。
- 使用网格纸测量 CM 处白光连续光束和入口狭缝的直径。如果两个位置之间的直径显著改变，则使用 CM 底板上的千分尺调整 CM 与梁平行的位置，直到直径几乎相同。调整后执行步骤 2.6.4~2.6.5。
- 根据第 2.2 节放置 L2、L3 和 L4，然后放置 F1、F2 和 P1。
- 拉曼泵梁对准（图1A）
- 将光栅反射带通滤波器 （BPF） 放在光学参数放大器 （OPA） OPA1 的输出光束路径中。根据第 2.3 节调整 BPF 和 M17。使用近红外传感器卡观察光束点。
- 将半波板 （HWP） HWP2 的角度设置为 45°，以便将拉曼泵极化设置为垂直。拆下 L5、L6 和 L7。
- 根据第 2.1 节，通过分别调整 M18、M19 和 M20，让光束击中 M19、M20 和 M21 的中心。使用近红外传感器卡观察光束点。
- 根据第 2.2 节放置 L5、L6 和 L7，使用近红外传感器卡作为屏幕。
- 活动泵梁对准（图1A）
- 拆下 L8 和 L9。通过根据第 2.1 节调整 M22，让 OPA2 的输出光束穿过虹膜 （I） I12 的中心。
- 根据第 2.3 节调整 M24 和 M25。根据第 2.2 节放置 L8 和 L9。根据第 2.4 节调整 ODL1。
- 使用格纸测量 M24 和 M32 处的驱动泵梁的直径。如果两个位置之间的直径明显不同，则使用 L9 底板上的千分尺调整 L9 与梁平行的位置，直到直径几乎相同。
- 拆下 L10 和 M32。根据第 2.3 节调整 M30 和 M31。
- 将 P2 放在 M32 的位置。将名片放在 P2 后面作为屏幕。
- 将 P2 设置为允许脉冲在 35.3° 处极化的角度，使垂直轴通过 P2。旋转 HWP3，直到屏幕上的光束点完全消失。执行此协议以消除分子调整方向对时间解析测量的影响。
- 删除 P2。放置 M32 并将光束反射到流单元 （FC） 上。根据第 2.2 节放置 L10。
- 流单元启动（图 1E）
- 将 2 mm 石英流单元连接到支座上。将流单元的每一端连接到聚氟乙酸酯 （PFA） 管（长度 = ±500 mm;外径 = 1/8 英寸），并连接弹性体管（长度 = ±10 mm）。
- 将管从流动单元底部插入充满样品溶液的储液罐。将管从流量单元顶部连接到磁齿轮泵的进气器。
- 将 PFA 管（长度 = ±500 mm;外径 = 1/8 英寸）连接到磁齿轮泵的出口，并将另一端插入储液罐。
- 将流动单元安装放在探头梁的焦点处。
- 打开磁齿轮泵。使用泵的电压控制将流量调整到 ±20 mL/min，以便在每个活动泵脉冲到达 FC 之前更换照明体积中的样品。
3. 软件操作
- 探测器设置
- 打开探测器窗格。单击"初始化"按钮。等待探测器初始化指示灯亮起。
- 在"曝光时间 （ms）"框中输入 40。
- 分别从A/D 增益和A/D 速率下拉菜单中选择IGA Lo 增益和IGA 280 kHz。IGA 和 A/D 分别代表 InGaA 和模拟到数字转换器。
- 单击探测器设置指示器下方的"设置"按钮。确认指示灯亮起。
- 从"触发事件"下拉菜单将"触发器"开关设置为"外部"。从"触发边缘"下拉菜单中选择每个 = 每个 Aq和TTL 上升边。TTL 代表晶体管-晶体管逻辑。
- 单击"触发设置"指示灯下方的"设置"按钮。确认指示灯亮起。
- 单击窗格底部的"读取"按钮。确认探测器温度 （K）框显示的值低于 170 K。否则，请等待温度降至 170 K 以下。
- 光谱设置
- 打开光谱学窗格。单击"初始化"按钮。等待，直到光谱仪初始化指示灯亮起。
- 选择1。沟槽 300 g/mm，火焰波长 2000 nm从光栅下拉菜单。单击"光栅下拉菜单"右侧的"设置"按钮。
- 在"移动到"框中输入光谱仪的中心波长，然后单击"转到"按钮。当光谱仪覆盖受刺激的拉曼光谱的指纹区域时，中心波长通常位于 1，380 到 1，430 nm 之间。
- 在"设置入口"框中输入入口狭缝宽度，然后单击框右侧的"设置"按钮。入口狭缝宽度通常设置为 0.3 mm。
- 舞台位置控制
- 打开"预览"窗格。在SK 级位置 （μm）框中输入以微米为单位的 ODL1 位置值。该框接受 0 到 200，000 （μm） 的值。单击框右侧的"转到"按钮。
- 在FA 级位置 （1/10 μm）框中输入 0.1 μm 中的 ODL2 位置值。该框接受 -250，000 到 250，000 （x 1/10 μm） 的值。单击框右侧的"转到"按钮。
- 单次测量
- 在"累积"框中输入频谱单次测量的累积数。该框接受 1 到 999 的值。
- 将隔膜杆向右推至可以移动的右侧，关闭光谱仪的入口。单击"商店变暗"按钮。将隔膜杆向左拉至可以移动的极远，打开光谱仪的入口。
- 选中"平均"框仅预览平均结果。
- 从操作模式下拉列表中选择"获取光谱并检查瞬态吸收"，分别测量探头强度和测量刺激拉曼或瞬态吸收光谱。
- 单击"获取"按钮。
- 要自动重复测量，请选中"连续"框，然后单击"获取"按钮。取消选中"连续"框以停止连续测量。
- 通过单击文件夹图标打开文件对话框。双击用于保存数据的文件夹。输入一个文件名，其扩展名为".txt"，然后单击OK。单击"保存"按钮。
- 时间解析测量
- 打开实验窗格。在"实验名称"框中输入 20 个字符内简要描述实验（例如，示例名称、条件）的名称。
- 通过单击文件夹图标打开文件对话框。双击用于保存数据的文件夹，然后单击OK。
- 在"扫描次数"框中输入平移阶段扫描的数量。
- 在"扫描"下拉菜单的阶段中选择实验中扫描的转换阶段。
- 输入扫描在范围 A的"开始"框中开始的阶段位置。可接受值的单位和范围取决于阶段（参见第 3.3 节）。
- 在范围 A的"步进"框中输入两个连续阶段位置之间的间隔。台位位置的 1 μm 间隔对应于活动（或拉曼）泵和探头脉冲之间的时间延迟 6.7 fs 的间隔。
- 在范围 A的"点"框中输入扫描中的阶段位置数。
- 如果在单个扫描中需要多个间隔，请检查范围 B框，并重复步骤 3.5.5*3.5.7 的范围B。可以使用范围 A、B和C设置三个间隔。
- 单击"运行"按钮启动扫描。实验运行指示灯将亮起。等待，直到指示灯熄火。
4. 探头频谱优化
- 将光束转储放置在活动和拉曼泵梁的路径中。将 P1 设置为允许垂直极化脉冲通过 P1 的角度。
- 根据步骤 3.4.1 将累积数设置为 10。根据步骤 3.4.2 存储暗信号。根据步骤 3.4.4 选择获取光谱。
- 根据步骤 3.4.6 运行连续测量以预览数据。通过逐渐旋转 HWP1，最大化探测器在显示屏上的计数。
- 通过旋转 VND1 逐渐增加事件脉冲的强度，直到最大和最小探测器计数分别达到约 30，000 和 4，000。如果开始观察到较大的振荡形态，则以相反方向旋转 VND1，直到型板消失。
- 根据步骤 3.4.6 停止连续测量。
5. 固定刺激拉曼光谱的测量
- 拉曼泵和探头脉冲的空间重叠
- 拆下拉曼泵梁路径中的梁转储。将光学斩波器 （OC） 放在拉曼泵光束路径中。
- 将近红外传感器卡放在采样位置。通过根据第 2.1 节调整 M21 来调整拉曼泵梁的方向，直到拉曼泵和探头梁的点彼此完全重叠。拆下传感器卡。
- 拉曼泵和探头脉冲的时态重叠
- 将 InGaAs PIN 光电二极管放置在采样位置，其中拉曼泵和探头光束在空间上相互重叠，因为第 5.1 节的结果。
- 将光电二极管的信号输出连接到 500 MHz、5 GS/s 数字示波器，以监控拉曼泵和探头脉冲何时到达采样位置。
- 将示波器的水平刻度设置为 1 ns/div。
- 读取拉曼泵的信号强度的峰值时间，并读取阻塞其他脉冲的探头脉冲。
- 如果观察到两个脉冲的峰值时间差，则根据第 3.3 节调整 ODL2 的位置，直到差值小于 200 ps。
- 光学斩波器旋转相位的调整
- 向储液罐中加入40 mL的环己己油。根据步骤 2.9.5 开始流动环己己。
- 根据步骤 3.2.3，将光谱仪的中心波长设置为 1，190 nm，以观察拉曼泵脉冲的 Rayleigh 散射。
- 根据步骤 3.4.1 将累积数设置为 10。根据步骤 3.4.2 存储暗信号。
- 根据步骤 3.4.4 选择"检查瞬态吸收"。
- 根据步骤 3.4.6 运行连续测量。
- 通过调整 OC 的旋转相位（从 -180 起）来最大化拉曼泵波长处的负号，该信号源自由于切碎而存在和不存在分散的拉曼泵脉冲的表观瞬态吸收信号的振幅控制器前面板上的 ±170°。
- 根据步骤 3.4.6 停止连续测量。
- 信号最大化
- 根据步骤 3.2.3，将光谱仪的中心波长设置为 1，410 nm，用于观察刺激的拉曼光谱。
- 根据步骤 3.4.6 运行连续测量，并检查显示屏中是否观察到受刺激的拉曼环己沙。当中心波长设置为 1，410 nm 时，最强的环己二甲苯甲氧西环出现在第 55-58 像素处。
- 如果未观察到受刺激的拉曼带，请尝试根据第 3.3 节以 150 μm 的间隔将 ODL2 的位置更改为 ±15，000 μm，并查看是否观察到受刺激的拉曼带。
- 如果在执行步骤 5.4.3 后未观察到刺激的拉曼带，请重试步骤 5.1.2 以获取拉曼泵和探头梁之间的空间重叠，并再次执行步骤 5.4.2。
- 一旦检测到刺激的拉曼波段，通过迭代重新调整 M21、OC 的旋转相位和 ODL2 的位置，使显示屏中的波段强度最大化。
- 根据步骤 3.4.6 停止连续测量。
- 测量
- 根据步骤 3.4.1 将累积数设置为 500。根据步骤 3.4.2 存储暗信号。
- 根据步骤 3.4.5 运行单个测量。根据步骤 3.4.7 保存频谱。重复测量至少 4 倍。
- 从储液罐中取出 FC 入口管，并等待流量被空气中断。最小化磁齿轮泵的电压。
- 将储液罐中的内容替换为填充 100 mL 的新鲜丙酮。
- 分别将入口和出口管放入储液罐和空烧瓶中。根据步骤 2.9.5 启动磁齿轮泵，让铁氟油流通过 FC。
- 等待，直到气流被空气中断。最小化磁齿轮泵的电压。
- 重复步骤 5.5.4~5.5.6 至少 2 次。
- 向储液罐中加入 40 mL 的丙酮。根据步骤 2.9.5 开始流动丙酮。
- 根据步骤 5.5.2 记录刺激的拉曼丙酮光谱。
- 根据步骤 5.5.3 从 FC 中取出丙酮。
- 使用甲苯代替丙酮重复步骤 5.5.4~5.5.10。
6. 时间解析吸收光谱的测量
- 清空储液罐，加入25 mL的β-胡萝卜素溶液，浓度为1 x10-4摩尔dm-3。根据步骤 2.9.5 开始流动示例解决方案。
- 将 OC 置于活动泵梁路径中。
- 将光束转储从活动泵梁的路径移动到拉曼泵梁的路径。
- 根据步骤 5.1.2，使用名片而不是近红外传感器卡在空间上重叠采样位置的驱动泵和探头光束。
- 根据第 5.2 节，使用 Si PIN 光电二极管（而不是 InGaAs PIN 光电二极管）在采样位置的两个光束暂时重叠。
- 根据步骤 3.4.1 将累积数设置为 10。根据步骤 3.4.2 存储暗信号。
- 根据步骤 3.4.4 选择"检查瞬态吸收"。
- 根据步骤 3.4.6 运行连续测量，并检查显示屏中是否观察到 β-胡萝卜素的瞬态吸收。吸收带以一个形状单调地递减，以较长的波长（第二低的激发单状态，S2）或两个最大值在第0和511像素（最低激发单状态，S1）附近出现。
- 如果未观察到瞬态吸收，请尝试根据第 3.3 节以 150 μm 的间隔将 ODL1 的位置改变 ±15，000 μm。
- 如果在执行步骤 6.9 后未观察到吸收带，请重试步骤 6.4 以获取活动泵和探头光束之间的空间重叠。
- 检测到瞬态吸收带后，通过重新调整 M32 来最大化吸收强度。
- 根据步骤 3.4.6 停止连续测量。
- 根据第 3.3 节降低 ODL1 的位置，直到瞬态吸收完全消失。
7. 测量时间解析刺激拉曼光谱
- 将 OC 放在拉曼泵梁路径中。从拉曼泵梁路径上拆下光束转储。
- 根据步骤 3.4.1 将累积数设置为 200。根据步骤 3.4.2 存储暗信号。
- 根据第 3.5 节运行时间解析的实验。在步骤 3.5.4 中，选择SK 阶段。将范围 A的起始值设置为比步骤 6.13 中瞬态吸收信号消失的位置小约 50 μm。
8. 拉曼换档校准
- 使用您选择的数据分析软件，计算第 5 节中记录的四个刺激拉曼光谱的平均值。
- 根据 InGaAs 阵列探测器的像素数绘制溶剂的平均刺激拉曼光谱。
- 通过使用洛伦齐函数的最小二乘拟合分析，估计溶剂受刺激的拉曼带的峰值位置。如果洛伦兹函数不可用，则改用多项式函数。
- 在参考书中（例如，滨口和岩田34）中，将溶剂的拉曼波段的峰值波数与像素数中的估计峰值位置绘制。
- 通过具有二度或三度多项式函数的最小二乘比形分析，获取拉曼移位和像素数之间的校准函数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在肌胶溶液中应用了邻IR刺激拉曼光谱法。样品的浓度为1 x10-4摩尔dm-3。样品在480nm的正射泵脉冲下光激发，脉冲能量为1μJ。图2A显示了在图2A中β-胡萝卜素的及时解刺激拉曼光谱。原始光谱含有强拉曼带的溶剂苯和弱拉曼带的β-胡萝卜素在地面状态，以及拉曼带的光兴奋β-胡萝卜素。在光射前1ps处，使用同一溶液的刺激拉曼光谱减去它们。减法后的光谱（图2B）显示由吸收光兴奋β-胡萝卜素和/或其他非线性光学过程引起的扭曲基线。基线在用多项式函数校正后变得平坦（图2C）。
时间解析的拉曼光谱β-胡萝卜素显示两个强带在1，400-1，800厘米-1区域（图2C）。以0 ps为宽刺激的拉曼带被分配到S2 β-胡萝卜素的相内C+C拉伸振动。其峰值位置估计为1，556厘米-1。随着S2 C+C拉伸带衰变，S1 β-胡萝卜素的相内C+C拉伸带出现。S1 C+C 拉伸带的峰值位置从 0.12 到 5 ps 上升 8 厘米-1（图 2D）。上移的时间常数估计为0.9 ps。上升源于S1+-胡萝卜素2，3中的振动能量再分配。
图1：仪器图。（A） 一个飞秒时间解析近红外的框图刺激了拉曼光谱仪。Ti：S = 模式锁定 Ti：蓝宝石激光系统;BS = 分束器;OPA = 光学参数放大器;BBO = β-硼酸晶体;OC = 光学斩波器;ODL = 光延时线;BPF = 体积光栅反射带通滤波器;SP = 蓝宝石板;FC = 流量单元;M = 镜像;CM = 凹面镜;L = 镜头;I = 虹膜;P = 偏振器;HWP = 半波板;F = 彩色玻璃滤光片;VND = 可变光密度滤波器。该图改编自高亚11，并经PCCP业主协会许可。（B） 镜像安装的四种配置。V、H 和 S 分别表示垂直调节旋钮、水平调节旋钮和支撑。有关详细信息，请参阅第 2.1 节。（C） 激光束对准的示意图.m = 镜像;i = 虹膜。有关详细信息，请参阅第 2.3 节。（D） 光学延迟线对齐的示意图.m = 镜像;i = 虹膜。有关详细信息，请参阅第 2.4 节。（E） 流动单元安装的结构.有关详细信息，请参阅第 2.9 节。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：倍秒时间解析近红外刺激拉曼光谱。（A） 飞度时间解析近IR刺激拉曼光谱的β-胡萝卜素在苯在肌油油泵波长在480nm。在接地状态下，拉曼带的苯醚和β-胡萝卜素分别用圆圈和三角形表示。（B） 在减去接地状态中的拉曼带的苯和β-胡萝卜素后，在苯的拉曼带中，飞度第二次近IR刺激拉曼光谱的β-胡萝卜素在苯。光谱的基线都装有多项式函数（断裂的痕迹）。（C） 在基线校正后，双秒时间解析近IR刺激肌酸中的β-胡萝卜素的拉曼光谱。（D） S1状态中相内 C+C 拉伸带的峰值位置针对时间延迟绘制。C_C拉伸带装有高斯函数，用于估计其峰值位置。S1 C+C 拉伸带（实心轨迹）偏移的最佳拟合曲线是通过具有指数函数的最小二乘拟合分析获得的。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
飞秒时间解析近红外多路复用中的关键因素刺激了拉曼测量
为了获得具有高信噪比的近IR刺激拉曼光谱，探头光谱最好在整个波长范围内具有均匀的强度。因此，白光连续生成（第2.5节）是时间解析近IR刺激拉曼实验最关键的部分之一。通常，随着射化光束强度的增加，探头光谱变得广泛而平坦。然而，高光束强度很容易产生不需要的非线性光学效应，而不是白光连续生成。在最坏的情况下，非线性效应为探头频谱提供较大的强度波动和振荡模式，从而显著降低受刺激拉曼光谱的信号噪声比。图 2C显示了振荡模式如何影响光谱。它显示从-0.30到4 ps的振荡形态，但模式只出现弱，峰值到峰值振幅为1 x10-4，因为白光生成经过仔细优化。空气2、11中的水蒸气对探针光谱的另一个不良影响。如果光谱仪的一部分（包括白光生成光学器件、样品和光谱仪）设置在充满干氮的腔室中，则水蒸气的影响是可以避免的。
拉曼移位校准的精度
如第 8 节所述，我们通过对拉曼溶剂带的峰值位置的最小二乘拟合分析，对具有多项式函数的探测器像素数中的峰值位置进行最小平方拟合分析，从而校准拉曼移轴。我们认为，只要不能高精度地确定拉曼泵的波长，该协议就行得通。我们的光谱仪就是这种情况，因为我们探测器的每个像素覆盖在拉曼泵脉冲波数周围高达 3.5 厘米-1。但是，必须选择溶剂，以便样品的所有瞬态刺激拉曼带出现在溶剂带的最高波数和最低波数之间（第 8 节）。拉曼移位校准曲线的精度超出溶剂带的范围。在图2中，在1，785厘米-1的1，785厘米-1，一个拉曼带的S1 β-胡萝卜素，出现在溶剂带的最高波数，1，710厘米-1。我们已经确认，峰值位置与苯在苯确定由皮秒时间解决自发拉曼光谱35，36。
飞秒时间解析近红外多路复用激发拉曼光谱仪的有效性和透视
已经证明，飞秒时间解析近红外多倍刺激拉曼光谱仪可以观察到刺激拉曼光谱，它提供了几乎相当于短寿命物种的自发拉曼光谱的信息与近IR转换。光谱仪具有足够的灵敏度，因此可以通过光谱仪检测到波段峰值位置的微小差异。光谱仪将适用于从简单的芳烃分子到光导聚合物的各种α-结合系统。固定近红外多路刺激拉曼光谱也是一个强大的工具，用于观察分子振动，没有荧光干扰从样品，因为近红外光子的能量通常比电子分子从最低兴奋单状态到接地状态的过渡能量。光谱仪将适用于生物系统中结构动力学的体内观察。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了JSPS KAKENHI授权编号JP24750023、JP24350012、MEXT KAKENHI授权编号JP26104534、JP16H00850、JP26102541、JP16H00782和MEXT支持的私立大学战略研究基金会计划的支持，2015-2019年。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Axis Translational Stage | OptSigma | TSD-401S | Products equivalent to this are used as well; for M22, L9, and CM in Figure 1A |
| 20-cm Optical Delay Line | OptSigma | SGSP26-200 | ODL1 in Figure 1A |
| 3-Axis Translational Stage | OptSigma | TSD-405SL | For L8 in Figure 1A |
| 3-Axis Translational Stage | Suruga Seiki | B72-40C | For FC in Figure 1A |
| 5-cm Optical Delay Line | PMT | HRS-0050 | ODL2 in Figure 1A |
| Al Concave Mirror | Thorlabs | CM254-050-G01 | Focal length: 50 mm; CM in Figure 1A |
| Base Plate | Suruga Seiki | A21-6 | Products equivalent to this are used as well; for M1-M32, BS1-BS3, L1-L10, I1-I17, P1-P2, HWP1-3, F1-F3, VND1-VND2, OC, BPF, HS, BBO, SP, CM, and FC in Figure 1A |
| BBO Crystal | EKSMA Optics | - | Type 1, θ = 23.2 deg; BBO in Figure 1A |
| BK7 Plano-Concave Lens | OptSigma | SLB-25.4-50NIR2 | Focal length: 50 mm; IR anti-reflection coating; L6 in Figure 1A |
| BK7 Plano-Convex Lens | OptSigma | SLB-25.4-150PIR2 | Focal length: 150 mm; IR anti-reflection coating; L2, L3, L5 in Figure 1A |
| BK7 Plano-Convex Lens | OptSigma | SLB-25.4-100PIR2 | Focal length: 100 mm; IR anti-reflection coating; L4 in Figure 1A |
| BK7 Plano-Convex Lens | OptSigma | SLB-25.4-200PIR2 | Focal length: 200 mm; IR anti-reflection coating; L7 in Figure 1A |
| Broadband Dielectric Mirror | OptSigma | TFMS-25.4C05-2/7 | M22-M25, M28, M29 in Figure 1A |
| Broadband Dielectric Mirror | Precision Photonics (Advanced Thin Films) | - | M26, M27, M30-M32 in Figure 1A |
| Broadband Half-Wave Plate | CryLight | - | HWP3 in Figure 1A |
| Color Glass Filter | HOYA | IR85 | F1 in Figure 1A |
| Color Glass Filter | HOYA | RM100 | F2 in Figure 1A |
| Color Glass Filter | Schott | BG39 | F3 in Figure 1A |
| Computer | Dell | Vostro 200 Mini Tower | OS: Windows XP |
| Cyclohexane | Kanto Kagaku | 07547-1B | HPLC grade |
| Data Analysis Software | Wavemetrics | Igor Pro 8 | |
| Dielectric Beamsplitter | LAYERTEC | - | Reflection : Transmission = 2 : 1; BS1 in Figure 1A |
| Dielectric Beamsplitter | LAYERTEC | - | Reflection : Transmission = 1 : 1; BS2, BS3 in Figure 1A |
| Dielectric Mirror | Precision Photonics (Advanced Thin Films) |
- | M1-M8 in Figure 1A |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | TDS3054B | 500 MHz, 5 GS/s |
| Elastomer Tube | - | - | Figure 1E |
| Femtosecond Ti:sapphire Oscillator | Coherent | Vitesse 800-2 | Wavelength: 800 nm, pulse duration: 100 fs, average power: 280 mW, repetition rate: 80 MHz; included in Ti:S in Figure 1A |
| Femtosecond Ti:sapphire Regenerative Amplifier | Coherent | Legend-Elite-F-HE | Wavelength: 800 nm, pulse duration: 100 fs, pulse energy: 3.5 mJ, repetition rate: 1 kHz; included in Ti:S in Figure 1A |
| Film Polarizer | OptSigma | SPFN-30C-26 | P1 in Figure 1A |
| Glan-Taylor Prism | OptSigma | GYPB-10-10SN-3/7 | P2 in Figure 1A |
| Gold Mirror | OptSigma | TFG-25C05-10 | M9-M21 in Figure 1A |
| Half-Wave Plate | OptSigma | WPQ-7800-2M | HWP1 in Figure 1A |
| Harmonic Separator | Coherent | TOPAS-C HRs 410-540 nm | HS in Figure 1A |
| InGaAs Array Detector | Horiba | Symphony-IGA-512X1-50-1700-1LS | 512 ch, Liquid nitrogen cooled |
| InGaAs PIN Photodiode | Hamamatsu Photonics | G10899-01K | |
| IR Half-Wave Plate | OptiSource | - | HWP2 in Figure 1A |
| Iris | Suruga Seiki | F74-3N | Products equivalent to this are used as well; I1-I17 in Figure 1A |
| Lens Holder | OptSigma | LHF-25.4S | Products equivalent to this are used as well; for L1-L10 in Figure 1A |
| Magnetic Gear Pump | Micropump | 184-415 | |
| Mirror Mount | Siskiyou | IM100.C2M6R | Products equivalent to this are used as well; for M1-M32, BS1-BS3, BBO, CM in Figure 1A |
| near-IR phosphor card | Thorlabs | VRC2 | |
| Nut | - | - | Figure 1E, M4; purchased from a DIY store |
| Optical Chopper | New Focus | 3501 | OC in Figure 1A |
| Optical Parametric Amplifier | Coherent | OPerA-F | OPA1 in Figure 1A |
| Optical Parametric Amplifier | Coherent | TOPAS-C | OPA2 in Figure 1A |
| Polarizer Holder | OptSigma | PH-30-ARS | Products equivalent to this are used as well; for P1-P2 and HWP1-3 In Figure 1A |
| Polyfluoroacetate Tube | - | - | Figure 1E |
| Post Holder | OptSigma | BRS-12-80 | Products equivalent to this are used as well; for M1-M32, BS1-BS3, L1-L10, I1-I17, P1-P2, HWP1-3, F1-F3, VND1-VND2, OC, BPF, HS, BBO, SP, CM, and FC in Figure 1A |
| Quartz Flow Cell | Tosoh Quartz | T-70-UV-2 | FC in Figure 1A |
| Quartz Plano-Concave Lens | OptSigma | SLSQ-25-50N | Focal length: 50 mm; L8 in Figure 1A |
| Quartz Plano-Convex Lens | OptSigma | SLSQ-25-100P | Focal length: 100 mm; L1, L9 in Figure 1A |
| Quartz Plano-Convex Lens | OptSigma | SLSQ-25-220P | Focal length: 220 mm; L10 in Figure 1A |
| Sapphire Plate | Pier Optics | - | 3 mm thick; SP in Figure 1A |
| Si PIN Photodiode | Hamamatsu Photonics | S3883 | |
| Single Spectrograph | Horiba Jobin Yvon | iHR320 | Focal length: 32 cm |
| Stainless Steel Rod | Suruga Seiki | A41-100 | Products equivalent to this are used as well; for M1-M32, BS1-BS3, L1-L10, I1-I17, P1-P2, HWP1-3, F1-F3, VND1-VND2, OC, BPF, HS, BBO, SP, CM, and FC in Figure 1A |
| Stainless Steel Rod | Newport | J-SP-2 | Figure 1E |
| Toluene | Kanto Kagaku | 40180-1B | HPLC grade |
| U-Shaped Steel Plate | - | - | Figure 1E; purchased from a DIY store |
| Variable Neutral Density Filter (with a holder) | OptSigma | NDHN-100 | VND1 in Figure 1A |
| Variable Neutral Density Filter (with a holder) | OptSigma | NDHN-U100 | VND2 in Figure 1A |
| Visual Programming Language | National Instruments | LabVIEW 2009 | The control software in this study is programmed in LabVIEW 2009 |
| Volume-Grating Bandpass Filter | OptiGrate | BPF-1190 | BPF in Figure 1A |
| β-Carotene | Wako Pure Chemical Industries | 035-05531 |
References
- Polívka, T., Herek, J. L., Zigmantas, D., Åkerlund, H. -E., Sundström, V. Direct Observation of the (Forbidden) S1 State in Carotenoids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (9), 4914-4917 (1999).
- Takaya, T., Iwata, K. Relaxation Mechanism of β-Carotene from S2 (1Bu+) State to S1 (2Ag-) State: Femtosecond Time-Resolved Near-IR Absorption and Stimulated Resonance Raman Studies in 900-1550 nm Region. Journal of Physical Chemistry A. 118 (23), 4071-4078 (2014).
- Takaya, T., Anan, M., Iwata, K. Vibrational Relaxation Dynamics of β-Carotene and Its Derivatives with Substituents on Terminal Rings in Electronically Excited States as Studied by Femtosecond Time-Resolved Stimulated Raman Spectroscopy in the Near-IR Region. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (5), 3320-3327 (2017).
- Guo, J., Ohkita, H., Benten, H., Ito, S. Near-IR Femtosecond Transient Absorption Spectroscopy of Ultrafast Polaron and Triplet Exciton Formation in Polythiophene Films with Different Regioregularities. Journal of the American Chemical Society. 131 (46), (2009).
- Hwang, I. -W., et al. Carrier Generation and Transport in Bulk Heterojunction Films Processed with 1,8-Octanedithiol as a Processing Additive. Journal of Applied Physics. 104 (3), 033706 (2008).
- Yonezawa, K., Kamioka, H., Yasuda, T., Han, L., Moritomo, Y. Fast Carrier Formation from Acceptor Exciton in Low-Gap Organic Photovoltaic. Applied Physics Express. 5 (4), 042302 (2012).
- Takaya, T., Enokida, I., Furukawa, Y., Iwata, K. Direct Observation of Structure and Dynamics of Photogenerated Charge Carriers in Poly(3-hexylthiophene) Films by Femtosecond Time-Resolved Near-IR Inverse Raman Spectroscopy. Molecules. 24 (3), 431 (2019).
- Clafton, S. N., Huang, D. M., Massey, W. R., Kee, T. W. Femtosecond Dynamics of Excitons and Hole-Polarons in Composite P3HT/PCBM Nanoparticles. Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4626-4633 (2013).
- Cook, S., Furube, A., Katoh, R. Analysis of the Excited States of Regioregular Polythiophene P3HT. Energy & Environmental Science. 1 (2), 294-299 (2008).
- Okino, S., Takaya, T., Iwata, K. Femtosecond Time-Resolved Near-Infrared Spectroscopy of Oligothiophenes and Polythiophene: Energy Location and Effective Conjugation Length of Their Low-Lying Excited States. Chemistry Letters. 44 (8), 1059-1061 (2015).
- Takaya, T., Iwata, K. Development of a Femtosecond Time-Resolved Near-IR Multiplex Stimulated Raman Spectrometer in Resonance with Transitions in the 900-1550 nm Region. Analyst. 141 (14), 4283-4292 (2016).
- Jas, G. S., Wan, C., Johnson, C. K. Picosecond Time-Resolved Fourier Transform Raman Spectroscopy of 9,10-Diphenylanthracene in the Excited Singlet State. Applied Spectroscopy. 49 (5), 645-649 (1995).
- Jas, G. S., Wan, C., Kuczera, K., Johnson, C. K. Picosecond Time-Resolved Fourier-Transform Raman Spectroscopy and Normal-Mode Analysis of the Ground State and Singlet Excited State of Anthracene. Journal of Physical Chemistry. 100 (29), 11857-11862 (1996).
- Sakamoto, A., Okamoto, H., Tasumi, M. Observation of Picosecond Transient Raman Spectra by Asynchronous Fourier Transform Raman Spectroscopy. Applied Spectroscopy. 52 (1), 76-81 (1998).
- Sakamoto, A., Matsuno, S., Tasumi, M. Construction of Picosecond Time-Resolved Raman Spectrometers with Near-Infrared Excitation. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (1-3), 429-435 (2006).
- Sakamoto, A., Matsuno, S., Tasumi, M. Picosecond Near-Infrared Excited Transient Raman Spectra of β-Carotene in the Excited S2 State: Solvent Effects on the in-Phase C=C Stretching Band and Vibronic Coupling. Journal of Molecular Structure. 976 (1-3), 310-313 (2010).
- Yoshizawa, M., Kurosawa, M. Femtosecond Time-Resolved Raman Spectroscopy Using Stimulated Raman Scattering. Physical Review A. 61 (1), 013808 (2000).
- Yoshizawa, M., Kubo, M., Kurosawa, M. Ultrafast Photoisomerization in DCM Dye Observed by New Femtosecond Raman Spectroscopy. Journal of Luminescence. 87-89, 739-741 (2000).
- Yoshizawa, M., Aoki, H., Hashimoto, H. Vibrational Relaxation of the 2Ag– Excited State in All-Trans-β-Carotene Obtained by Femtosecond Time-Resolved Raman Spectroscopy. Physical Review B. 63 (18), 180301 (2001).
- McCamant, D. W., Kukura, P., Mathies, R. A. Femtosecond Broadband Stimulated Raman: A New Approach for High-Performance Vibrational Spectroscopy. Applied Spectroscopy. 57 (11), 1317-1323 (2003).
- McCamant, D. W., Kukura, P., Yoon, S., Mathies, R. A. Femtosecond Broadband Stimulated Raman Spectroscopy: Apparatus and Methods. Review of Scientific Instruments. 75 (11), 4971-4980 (2004).
- Kukura, P., McCamant, D. W., Mathies, R. A. Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 461-488 (2007).
- Laimgruber, S., Schachenmayr, H., Schmidt, B., Zinth, W., Gilch, P. A Femtosecond Stimulated Raman Spectrograph for the Near Ultraviolet. Applied Physics B. 85 (4), 557-564 (2006).
- Umapathy, S., Lakshmanna, A., Mallick, B. Ultrafast Raman Loss Spectroscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 40 (3), 235-237 (2009).
- Mallick, B., Lakshmanna, A., Umapathy, S. Ultrafast Raman Loss Spectroscopy (URLS): Instrumentation and Principle. Journal of Raman Spectroscopy. 42 (10), 1883-1890 (2011).
- Kloz, M., van Grondelle, R., Kennis, J. T. M. Wavelength-Modulated Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy-Approach towards Automatic Data Processing. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (40), 18123-18133 (2011).
- Kloz, M., Weißenborn, J., Polívka, T., Frank, H. A., Kennis, J. T. M. Spectral Watermarking in Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy: Resolving the Nature of the Carotenoid S* State. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (21), 14619-14628 (2016).
- Kuramochi, H., Takeuchi, S., Tahara, T. Ultrafast Structural Evolution of Photoactive Yellow Protein Chromophore Revealed by Ultraviolet Resonance Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (15), 2025-2029 (2012).
- Wang, S., et al. Dynamic High Pressure Induced Strong and Weak Hydrogen Bonds Enhanced by Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering in Liquid Water. Optics Express. 25 (25), 31670-31677 (2017).
- Ashner, M. N., Tisdale, W. A. High Repetition-Rate Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy with Fast Acquisition. Optics Express. 26 (14), 18331-18340 (2018).
- Quincy, T. J., Barclay, M. S., Caricato, M., Elles, C. G. Probing Dynamics in Higher-Lying Electronic States with Resonance-Enhanced Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 122 (42), 8308-8319 (2018).
- Taylor, M. A., et al. Delayed Vibrational Modulation of the Solvated GFP Chromophore into a Conical Intersection. Physical Chemistry Chemical Physics. 21 (19), 9728-9739 (2019).
- Cassabaum, A. A., Silva, W. R., Rich, C. C., Frontiera, R. R. Orientation and Polarization Dependence of Ground- and Excited-State FSRS in Crystalline Betaine-30. Journal of Physical Chemistry C. 123 (20), 12563-12572 (2019).
- Raman Spectroscopy (The Spectroscopical Society of Japan, Spectroscopy Series 1). Hamaguchi, H., Iwata, K. , Kodansha. Tokyo, Japan. (2015).
- Hashimoto, H., Koyama, Y. The C=C Stretching Raman Lines of β-Carotene Isomers in the S1 State as Detected by Pump-Probe Resonance Raman Spectroscopy. Chemical Physics Letters. 154 (4), 321-325 (1989).
- Noguchi, T., Hayashi, H., Tasumi, M., Atkinson, G. H. Solvent Effects on the ag C=C Stretching Mode in the 21Ag- Excited State of β-Carotene and Two Derivatives: Picosecond Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry. 95 (8), 3167-3172 (1991).
