Summary
珊瑚创造了对人类和海洋生物都重要的生物多样性生态系统。然而，我们仍然不明白许多珊瑚细胞的全部潜力和功能。在这里，我们提出了为石珊瑚细胞群的分离、标记和分离而开发的协议。
Abstract
由于人为压力因素，珊瑚礁受到威胁。珊瑚对这些压力器的生物反应可能发生在细胞水平上，但这些机制并不十分了解。为了研究珊瑚对压力器的反应，我们需要分析细胞反应的工具。特别是，我们需要有助于应用功能检测的工具，以更好地了解细胞群对压力的反应。在目前的研究中，我们使用荧光激活细胞分拣（FACS）来分离和分离石珊瑚中不同的细胞群。该协议包括：（1） 珊瑚组织与骨骼分离，（2） 创建单个细胞悬浮液，（3） 使用各种标记标记标记珊瑚细胞进行流细胞测定，以及 （4） 门控和细胞分拣策略。这种方法将使研究人员能够在细胞水平上研究珊瑚，以便对不同的细胞群进行分析、功能测定和基因表达研究。
Introduction
珊瑚礁是地球上最重要的生态系统之一。它们通过提供鱼类和无脊椎动物的关键栖息地促进生物多样性，并通过旅游业1提供粮食和经济生计，对维持人类社区至关重要。作为珊瑚礁的主要建设者，珊瑚动物（Phylum：Cnidaria）也通过创建大型碳酸钙框架来缓解海浪和风暴破坏2，帮助沿海社区。
珊瑚作为成人是分离动物，容纳广泛的内生生物伙伴，包括病毒，古生物，细菌，蛋白物，真菌，最值得注意的是，藻类二丁那胶酸盐家族共生体3的成员。环境的变化可能导致这个社区的不平衡，往往导致疾病爆发和珊瑚白化，其中共生共生共生体被逐出珊瑚群落，从而消除珊瑚的主要营养来源。这两种情况经常导致珊瑚宿主44、5、65,6的死亡。人为诱发的压力因素的影响，如快速的气候变化，正在加速大规模珊瑚死亡事件，导致全球珊瑚礁减少7。
最近，已经开发了许多不同的方法来帮助减轻珊瑚礁的损失。这些方法包括在现有珊瑚礁上种植珊瑚，使用耐热基因型进行基因交叉，以及对珊瑚88、99内托管的微生物和共生群落进行细胞操作。尽管作出了这些努力，关于珊瑚细胞多样性和细胞功能10、11、12、13,12,13仍不为人所知。10,要了解珊瑚生物在规范和紧张条件下行为的方式，必须全面了解珊瑚细胞类型的多样性和细胞功能。对细胞多样性和基因功能如何耦合的理解将得益于最大限度地提高恢复和保存效率的努力。
以前关于细胞多样性和功能的研究主要集中在组织学研究和全组织RNA取样14，15，16，17。14,15,16,17为了更详细地了解珊瑚中的特定细胞类型功能，需要有分离活珊瑚细胞特定种群的方法。这已经成功地在非经典模型生物体中，通过荧光活性细胞分选（FACS）流动细胞测量技术18。FACS 利用调谐到不同波长的激光组合来测量单个细胞级别的不同内源细胞特性，如相对细胞大小、细胞粒度和自荧光。此外，细胞可能用荧光标记的化合物标记，以测量特定的，所需的属性18，19。18,
到目前为止，流细胞学在珊瑚细胞中的应用主要是利用其强、天然自氟化20、21、22,22的共生共生共生生物和其他细菌种群进行分析。20,FACS也被用来估计珊瑚基因组的大小，通过使用荧光DNA标记信号比较参考模型有机体细胞23，24。23,FACS的有效应用提供了三种不同的工具，对细胞生物学研究有用：1） 单细胞的形态和功能描述;2） 识别、分离和分离下游研究的特定细胞群;和3）单细胞水平功能测定分析。
各种外源荧光标记物的开发和应用，用于研究珊瑚细胞，目前仍有待开发。此类标记可能包括标记的蛋白质、酶标记的基质或对其他化合物的荧光反应。这些标记可用于识别具有唯一属性的细胞类型，例如突出显示产生不同量特定细胞室特征（如隔离体）的单元格。另一个例子是使用荧光标记的珠子来功能识别能够进行噬菌体细胞的细胞，或吞没靶向病原体25。在免疫反应中活跃的细胞群，在吞没这些外源应用的珠子后，可以很容易地识别出。虽然传统的组织学方法需要保存的组织和几个小时来近似珠类吞没的阳性细胞的百分比，但基于FACS的病原体吞没功能测定可以在分离的活细胞上相对快速地进行。除了研究细胞对压力的特异性反应外，该技术还有可能阐明基因特异性表达，并阐明细胞类型的进化和发育历史，这些细胞类型完全为细胞类型所独有，这些细胞类型完全为细胞类型所独有，如卡利波和神经细胞。
最近，我们对30多个细胞标记进行了密集筛选，从而确定了24个能够标记珊瑚细胞的标记，其中16个可用于区分独特的种群18，使它们成为分化集群（CD）。在这里，我们描述了在波西洛波拉达米科尼斯的珊瑚细胞分离过程，从从碳酸钙骨架中取出细胞到用FACS识别和隔离特定细胞群（图1）。
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Protocol
1. 通过喷枪和压缩机从珊瑚骨架分离组织
注：在冰上执行步骤，用手套保护双手。
- 通过连接空气压缩机、软管和喷枪来组装喷枪套件（图2）。将压力表设置为 276×483 kPa 之间。
注： 本研究所用的推荐压缩机和空气软管预设为最大压力为 393 kPa。在此 276-483 kPa 范围之外使用可能会导致细胞从骨架中去除不足或细胞膜破裂。此范围可能因每个物种而异，可能需要进行可行性测试。可以使用简单的血细胞计和4+6二胺酰胺-2-苯胺酮（DAPI）染料排除测定，在复合显微镜上可视化的细胞浆料子集进行可行性测试。 - 在自排无菌玻璃容器中制备100 mL的细胞染色介质，加入33 mL的10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS;不含钙和镁），最终浓度为3.3倍，胎儿小牛血清2 mL（FCS;热在56°C下灭活30分钟），达到总体积的2%，最终浓度为20m的2 mL。然后用无菌水在100mL处顶出。
注：3.3倍PBS浓度被选择模仿海水的盐度，如罗森塔尔等人18所示。这种浓度需要针对在其他环境中发现的物种进行调整，以模仿它们的盐度。 - 将 10 mL 的细胞染色介质转移到喷枪瓶中（图 2中标有"F"），并连接喷枪连接器的适配器盖。
注：较大的片段和具有较厚组织层的物种可能需要更多的介质才能充分去除组织。 - 对于此处演示的分支珊瑚物种，使用骨刀夹住或切割长度约 3-5 厘米或面积为 4 厘米2的珊瑚碎片。
注：该片段必须清除大藻类和其他多细胞生物体，因为这些可能不是从下游样品中去除的，并且在FACS分析和分拣过程中会污染样品。经过过滤、染色和洗涤，P. damicornis的 1 厘米片段可产生大约 2×10 x 106 个细胞。 - 将珊瑚碎片放在塑料收集袋内，并使用喷枪将细胞染色介质喷洒到珊瑚上（图2）。继续此过程，直到大多数骨架公开。从收集袋中取出剩余的骨架。
2. 珊瑚组织细胞分离
注：在冰上执行所有步骤，用手套保护双手。
- 通过 40 μm 尼龙电池滤网将电池浆液过滤到 50 mL 离心机管中，以获得单个电池悬浮液。
注：不同的细胞滤网网格尺寸可能更适合不同的物种。然而，由于碎片和细胞团的通过，较大的尺寸可能导致组织分离不足。- 对于粘液层较厚的试样，请使用 1 mL 塑料注射器的消毒柱塞，并将其轻轻研磨到过滤器上，以分解块状，并帮助细胞通过滤网。将滤网和柱塞用细胞染色介质冲洗到离心管中。
- 在450 x g的4°C下离心将细胞中丸5分钟。去除上清液，在1 mL细胞染色介质中重新悬浮细胞。
3. 细胞染色
注：在冰上执行所有步骤，用手套保护双手。该协议中介绍的污渍用于表示目的。替代污渍需要不同的浓度和孵育时间。
- 将 500 μL 的重新悬浮电池转移到 5 mL 圆底管中，并作为控制样品放在一边。不要在此等位报价中添加污渍。
- 在剩余的细胞悬浮液中，加入0.42 μL的12 mM DAPI耐性染料（材料表），1 μL的5μM活性氧物种（ROS）染色（材料表），和0.1μL的0.2μM淋索虫染色（材料表）。移液器在黑暗中混合和孵育30分钟，以防止光漂白。
注：本例中 DAPI 用作 FACS 机器上死细胞差分浇注的 DNA 染色和生存能力染料。这假定DAPI穿透由于膜完整性而死亡的细胞。ROS 污渍在 520 nm 范围内发出光（绿色），而淋索体标记以大约 668 nm（红色）发出光。 - 在450 x g的4°C下离心500 μL，去除上清液，在500μL的细胞染色介质中重新悬浮。转移到一个新的5mL圆底管，并储存在冰上。
4. FACS 启动
注：由于激光和通道的差异，步数可能因细胞计的组成和型号而异。对于此协议，使用了具有 405、488、535 和 640 nm 波长激光器的细胞计。此协议中介绍的筛选器用于表示目的。替代细胞污渍可能需要一组不同的过滤器和激光。
- 开始在分拣器软件上创建新的项目模板，然后选择激光面板。对于污渍和自然荧光的表示组合，请选择所有四个激光器（405、488、535 和 640 nm）。
- 为实验中表示的每个预期颜色选择适当的滤镜。
- 要检测 DAPI 发射并帮助分离活细胞和死细胞，请使用带通 （BP） 450/50 （425×475 nm） 范围的滤波器，如 DAPI、Hoeschst 或太平洋蓝色滤波器。
- 对于检测绿色 ROS 信号发出的光，请使用 BP 为 530/30（波长范围为 515-545 nm）的滤光片，如氟黄素等质二元酸酯 （FITC） 或绿色荧光蛋白 （GFP） 过滤器。此过滤器将测量每个细胞中的 ROS 浓度。
- 添加具有 670/30 （655×685 nm 范围） 的 BP 的附加过滤器，如用于检测淋病污渍排放的均等化青霉素 （APC） 过滤器。
注：APC 通道将允许测量噬菌体活动。该通道还将检测来自共生共生藻的珊瑚共生藻类产生的自荧光。但是，可以使用波长比 APC 滤波器更长的附加通道来分离此信号。 - 包括具有 780/60（750-810 nm 范围）的 BP 的过滤器，例如最常用的植物素、氰素过滤器 （APC-Cy7），该过滤器可检测来自共生体远红色自氟化的发射，并有助于分离共生细胞。
5. FACS 门控设置
注：步骤可能因细胞仪的制作和型号以及采集程序以及细胞计而异。
- 在细胞测量软件的项目实验屏幕上，创建散点图并选择正向散点 （FCS） 作为 Y 轴的 X 轴和侧散点 （SSC） 的指标。
注： FCS 与单元格的大小相关，SSC 与粒度相关。这将允许清除大多数碎片，因为大多数碎片的大小将比完整的细胞小。 - 将轴设置为对数或双指数比例，因为细胞大小和粒度可能相差几个数量级（图 3A），尤其是在珊瑚中。
6. FACS分析和细胞隔离
注：步骤可能因细胞仪的组成和型号以及耦合采集程序而异。
- 将控件（即未染色的细胞子集）放在细胞仪的样品室中，然后开始读取过程。当计算机开始接收来自每个单元格或事件的数据时，点将开始出现在散点图上。要清除以前实验中留在细胞仪室中的任何碎片，在开始分析之前，允许大约 30 s 通过。
- 在散点图中，调整光电倍增管 （PMT） 电压以将点居中。
注：PMT电压用于放大被测光子的信号强度;如果 PMT 电压太弱，读取的单元将更少，如果 PMT 电压太强，则电池将测量接近最大值，并且不同的电池类型将彼此无法区分。适当的 PMT 电压可确保独立区分的事件将填充散点图。通过在 FSC 和 SSC 散点图上投影对数或双指数比例，事件分离更易于可视化。 - 开始记录事件。为了保存示例，在读取了大约 15，000 个事件后暂停数据采集。在大多数情况下，这足以可视化整个细胞填充模式。如果分析和隔离小型专用细胞群，则记录更多事件。
- 在 FSC 和 SSC 的第一个图形上，在 FSC X 轴上创建 102标记和更高标记周围的单元格的选择或门。任何低于这个阈值的东西都是细胞碎片。绘制矩形门，这是流式细胞测量软件程序的常规选项，适用于清晰、独特的细胞群。对于在散点图上具有更不规则形状的单元格群，请使用多边形浇注选项。
注：正向散射时应选择最小珊瑚细胞的最小截止量为 102，但可能会对碎屑进行污染。要修改这一点，增加门控的下限要更加保守。 - 创建新的散点图，在 X 轴上显示 DAPI 滤波器，在 Y 轴上使用 APC-Cy7 滤波器。为此，请选择步骤 6.4 中创建的完整单元格的门，然后右键单击，然后选择该选项创建新的散点图。将轴调整为对数或双指数刻度。
注： 创建新绘图所需的步骤可能因软件程序而异。 - 现在，从细胞仪腔中取出控制样品，然后更换为染色细胞。在开始分析和记录数据之前，请等待 30s 通过。暂停前记录大约 15，000 个单元格。
注：APC-Cy7 刻度高端的明显人群是来自共生体高红色自荧光的种群。无需污渍即可可视化这些群体断裂，也可以在控制样本记录上查看（图 3C）。为仅珊瑚种群（Y 轴上较低的种群）选择，以进一步区分。 - 创建同形细胞的新散射图，以可视化ROS浓度（FITC滤波器）和对溶质（APC滤波器）正的细胞，再次利用对数或双指数尺度。
注：如果有多个不同的细胞群是分众细胞，则可以在自己的散射图中进一步区分每个细胞群（图3C，D）。 - 使用控制样本的第一个记录或重新插入和重新运行控制组，将染色样本组与控件进行比较，将未染色的子集进行比较。为染色样本组所特有的事件进行门。
7. FACS 分类和收集
注：步骤可能因细胞仪的制作和型号以及采集程序以及细胞计而异。
- 选择收集细胞，将微离心管（包含250×500 μL的细胞培养基或基于收集的细胞数量和储存方法的集液缓冲液）放入细胞计收集室。
注：表示的流式细胞计能够一次分拣四个不同的组，机器可以配置为容纳各种收集设备，包括各种离心管和96个井板。 - 一旦细胞仪开始读取样本，并且有适当的时间来清除碎屑，开始对所需人群进行分类，并收集从 20，000 个细胞到数百万个细胞的任意位置。
- 对于超过 500，000 个单元格，调整细胞培养介质或水解决缓冲液的体积以及收集设备的体积。
- 对于体外研究，将细胞储存在冰上，直到放入培养箱或消毒环境中。
- 对于分子研究，要么立即开始DNA/RNA/蛋白质分离过程，要么立即冻结，储存在-80°C，直到提取。
- 每次使用新的染色、物种或分拣机时，通过将至少20，000个感兴趣的细胞分类为500μL的染色介质，然后重新分析分类的细胞，并确认在最初排序的闸门内读取细胞，对感兴趣的种群进行纯度检查（图4）。
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Representative Results
总体而言，该协议非常有用，因为它有助于识别和收集可用于功能分析的活珊瑚细胞种群。工作流程开始于珊瑚组织与底层碳酸钙骨架的机械分离（图1）。这是最重要的初始步骤之一，因为不当技术会导致高细胞死亡率，并会产生大量碎片。不建议进行酶分离，因为它可能导致组织剪切增加和细胞死亡率高。使用喷枪进行机械分离可减少这些挑战（图2），将平均细胞死亡率降低至±10%（未显示数据）。在喷枪介导的机械分离组织与骨骼后，通过细胞滤网过滤，将产生的泥浆过滤到细胞悬浮液中。细胞悬浮液随后被DNA（DAPI）、ROS和淋索体标记染色，并通过FACS细胞计读取。然后，开发了一种门控策略，用于根据所使用的细胞标记来隔离特定的细胞群。然后，封闭细胞群被分类到收集管中（图1）。
在分析FACS细胞仪上的样品时，采取了几个步骤，以清除样品中的碎屑和死细胞。共生细胞可以选择性地去除，如果需要，由于其自荧光。首先，通过在正向（大小）和侧面（粒度）散射上创建浇注选择（图3A），从分析中去除与珊瑚细胞没有相同形状或粒度的碎片和其他非细胞颗粒。接下来，通过将未染色对照细胞悬浮液与DAPI染色样品和远红通道进行比较，然后将活性细胞浸出在染色样品中高DAPI染色的正细胞（图3B，细胞群P6），排除了死细胞。同时，通过用远红色通道中信号高信号的细胞浇注，将承载自荧光共生的细胞移除（图3B，APC-Cy7）。B在此迭代浇注过程之后，剩余的细胞进行分析，代表缺乏共生的完整的活珊瑚细胞群。
然后，通过为ROS活性和/或淋索体含量等特征添加外源性染色，这些细胞可以被分类为不同的细胞亚群（图3CC）。例如，检查ROS和淋索体染色过滤器的数据后发现，珊瑚细胞有四个不同的亚种群。一个细胞群的分糖含量（APC滤波器）信号相对较低，其他三个细胞在分体糖含量和一系列ROS活性（FITC滤波器）中具有较高的信号（图3C）。这些子种群中的每一个都可以单独分类，以便下游分析，或者通过大小、粒度、自荧光和/或DNA含量的交集进一步分析和分析到更离散的子种群。在这项研究中，DNA、ROS活性和染色体含量被用来识别珊瑚细胞的广泛特征。重要的是，这种一般协议可以适应一系列荧光标记物以及特定的抗体探针，这些探针可以结合用于分离感兴趣的特殊细胞群，如干细胞。
图1：珊瑚细胞分拣过程的一般工作流程。特色协议允许从骨骼中去除珊瑚细胞进行染色，然后通过FACS细胞计运行，测量、分析和分离到细胞群中。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：从珊瑚骨架中取出组织和细胞。空气压缩机 （A） 迫使空气和细胞染色介质 （F） 从喷枪 （E） 中流出， 并努力将珊瑚骨架 （C） 上的组织爆炸， 并在袋子 （D） 中产生细胞浆料 .最大气压由空气压缩机（A） 上的压力表 （B） 控制。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：活珊瑚细胞的浇注选择。（A） 活细胞使用最小正向散射值 102从碎片中分离出来。（B） APC-Cy7过滤器用于识别红色自荧光，有效地分离出共生细胞，而DAPI用于识别对DNA染色高度阳性的细胞。那些对DAPI非常积极的细胞表明细胞死亡和死亡。（C，D）ROS活性和淋索体含量的其他标记被用于进一步区分不同的珊瑚细胞种群。所有数据随后在 FlowJo （v10） 上重新分析以生成这些图形。插入的填充标签和百分比对应于每个排序的填充（E） 拍摄的微观照片。每个绘图中显示的百分比是该图中的总单元格。右下角的尺标 = 20 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图4：自荧光共生相关细胞的纯度检查。（A） 从未染色对照样品中对APC-Cy7过滤器的荧光阳性的细胞进行了排序。（B） 然后，在细胞仪上重新运行这组分拣的细胞，并在相同条件下重新分析，显示 94% 的纯度。正向散射（X 轴、FSC）用于锚定轴，但可与任何其他参数互换。相同的过程可以对染色样品执行。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议改编自罗森塔尔等人18号，用于识别和隔离P.Damicornis细胞。该方法侧重于通过检查细胞内在因素（包括相对细胞大小、相对细胞粒度、细胞自荧）和完整细胞膜的存在，过滤样品以去除碎屑、非活细胞和共生细胞承载细胞的过程。这些技术可以应用于其他珊瑚物种。然而，FACS浇注策略可能因细胞种群特征的物种特异性差异而异。
FACS对了解珊瑚健康的效用在于它能够利用各种细胞内在因素来差异识别和分离细胞。此外，该协议描述了额外使用外源性细胞染色来区分珊瑚细胞基于可行性、活性氧物种浓度和淋索体含量。在罗森塔尔等人18号以前测试的30多个商业标记中，有24个标有P.damicornis细胞，其中16个产生差分信号，分化团允许选择细胞亚群。
该协议的关键步骤之一是适当的组织切除和过滤，以确保组织团块分离，并且不会阻止流动细胞仪的层流。正确调整PMT电压对于准确检测和分析独立电池检测事件至关重要。与以前的工作18相比，通过喷枪机械干扰从底层骨骼分离珊瑚细胞的过程通过减少碎片和最大化细胞生存能力（+90%、图2和图3A）显著改善了传统的刮削方法，从而通过减少噪声引起的误报来改进后续分析。
本文中描述的方法通过在形态和功能特征的交集上进行差异选择，促进珊瑚细胞种群的分离。随着珊瑚细胞FACS方法的发展，现在可以选择特定的细胞亚群来创建定义的细胞培养，以及探测与特定细胞亚群相关的转录和表观遗传特征。这种精细化信息的应用将提供对细胞类型、行为和功能的洞察，并可能揭示与特定细胞类型（如卡利波和细胞）进化相关的特征。此外，将FACS技术应用于改进的压力测定和生物标志物，可能证明有助于保护受到严重威胁的珊瑚礁。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
NTK希望表彰迈阿密大学自然科学和工程研究奖，以表彰他为这项研究提供资金。BR感谢亚历克斯和安·劳特巴赫为比较和进化免疫学实验室提供资金。BR的工作得到了以色列科学基金会（ISF）号码：1416/19和2841/19以及HFSP研究赠款RGY0085/2019的支持。我们要感谢詹娜·科热克巴耶娃和迈克·康纳利的技术援助。我们还要感谢迈阿密大学、米勒医学院在西尔维斯特综合癌症中心的流动细胞测量共享资源，感谢他们使用FACS细胞计和香农·赛格获得技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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