Fluorescensaktivert cellesortering for isolering av sklerractiniske cellepopulasjoner
Summary
Koraller skaper biomangfoldige økosystemer som er viktige for både mennesker og marine organismer. Men vi forstår fortsatt ikke det fulle potensialet og funksjonen til mange korallceller. Her presenterer vi en protokoll utviklet for isolasjon, merking og separasjon av steinete korallcellepopulasjoner.
Abstract
Korallrev er truet på grunn av antropogene stressfaktorer. Den biologiske responsen av koraller på disse stressorer kan oppstå på cellenivå, men mekanismene er ikke godt forstått. For å undersøke korallrespons på stressfaktorer trenger vi verktøy for å analysere cellulære responser. Spesielt trenger vi verktøy som letter anvendelsen av funksjonelle analyser for å bedre forstå hvordan cellepopulasjoner reagerer på stress. I den nåværende studien bruker vi fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere og skille forskjellige cellepopulasjoner i steinete koraller. Denne protokollen inkluderer: (1) separasjon av korallvev fra skjelettet, (2) opprettelse av en enkelt celle suspensjon, (3) merking av korallceller ved hjelp av ulike markører for strømning cytometri, og (4) gating og celle sortering strategier. Denne metoden vil gjøre det mulig for forskere å arbeide med koraller på cellenivå for analyse, funksjonelle analyser og genuttrykksstudier av forskjellige cellepopulasjoner.
Introduction
Korallrev er et av de viktigste økosystemene på jorden. De legger til rette for biologisk mangfold ved å tilby kritiske habitater for fisk og virvelløse dyr, og er avgjørende for å opprettholde menneskeskapte samfunn ved å gi mat og økonomisk levebrød gjennom turisme1. Som den viktigste byggeren av korallrev, koralldyret (Phylum: Cnidaria) også hjelpemidler kystsamfunn ved å skape store kalsiumkarbonatrammer som reduserer bølge og stormskader2.
Koraller som voksne er sessile dyr som er vert for et bredt spekter av endosymbiotiske partnere, inkludert virus, arkaea, bakterier, protists, sopp, og spesielt, medlemmer av algal dinoflagellate familien Symbiodiniaceae3. Endringer i miljøet kan forårsake ubalanser i dette samfunnet, ofte fører til sykdomsutbrudd og korallbleking der symbiotiske Symbiodiniaceae blir utvist fra korallkolonien, og dermed eliminerer den viktigste kilden til ernæring for korallene. Begge disse scenariene forårsaker ofte død av korallverten4,5,6. Effekter av antropogene-induserte stressorer, som raske klimaendringer, akselererer masse koralldød hendelser, noe som fører til en global nedgang av korallrev7.
Nylig har mange forskjellige metoder blitt utviklet for å bidra til å redusere korallrevtap. Disse metodene inkludererutplanting av koraller på eksisterende rev, genetisk kryssing ved hjelp av termisk tolerante genotyper, og cellulær manipulering av mikrobielle og symbiotiske samfunn som ligger i korallene8,9. Til tross for dette arbeidet, mye er fortsatt ukjent om korallcelle mangfold og cellefunksjon10,11,12,13. En grundig forståelse av korallcelletype mangfold og cellefunksjon er nødvendig for å forstå hvordan korallorganismen oppfører seg under normative og stressende forhold. Arbeidet med å maksimere restaurerings- og bevaringseffektiviteten vil dra nytte av en forbedret forståelse av hvordan cellemangfold og genfunksjon er koblet sammen.
Tidligere arbeid med cellemangfold og funksjon har primært fokusert på histologiske studier og helvev RNA prøvetaking14,15,16,17. For å få større detaljer om spesifikk celletypefunksjon i koraller, må det være metoder for isolering av spesifikke populasjoner av levende korallceller. Dette har blitt gjort med hell i ikke-klassiske modellorganismer ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) flow cytometriteknologi18. FACS benytter en kombinasjon av lasere innstilt til varierende bølgelengder for å måle forskjellige endogene cellulære egenskaper på enkeltcellenivå som relativ cellestørrelse, cellegranularitet og autofluorescens. I tillegg kan cellene være merket av fluorescerende merkede forbindelser for å måle spesifikke, ønskede egenskaper18,19.
Så langt har anvendelsen av strømningscytometri til korallceller hovedsakelig vært for analyse av symbiotiske Symbiodiniaceae og andre bakterielle populasjoner ved å utnytte deres sterke, naturlige autofluorescens20,21,22. FACS har også blitt brukt til å estimere korallgenomstørrelse ved hjelp av fluorescerende DNA-markørsignal sammenlignet med referansemodell organismeceller23,24. Effektiv bruk av FACS gir tre forskjellige verktøy som er nyttige for cellebiologistudier: 1) morfologisk og funksjonell beskrivelse av enkeltceller; 2) identifisering, separasjon og isolering av spesifikke cellepopulasjoner for nedstrøms studier; og 3) analysen av funksjonelle analyser på enkeltcellenivå.
Utvikling og anvendelse av ulike eksogene fluorescerende markører for studiet av korallceller forblir nesten uutforsket. Slike markører kan inkludere merkede proteiner, merkede substrater for enzymer, eller fluorescerende responser til andre forbindelser. Disse markørene kan brukes til å identifisere celletyper som har unike egenskaper, for eksempel utheving av celler som produserer varierende mengder av en bestemt mobilromsfunksjon, for eksempel lysosomer. Et annet eksempel er bruken av fluorescerende merkede perler for å funksjonelt identifisere celler som er kompetente for fagocytose, eller oppslukning av et målrettet patogen25. Populasjoner av celler som er aktive i immunitetsresponser, kan lett identifiseres av FACS etter oppslukning av disse eksogene påførede perlene. Mens tradisjonelle histologiske metoder krever bevart vev og mange timer for å tilnærme seg prosentandelen av celler som er positive for perleoppslukelse, kan en FACS-basert funksjonell analyse for patogenoppslukning utføres relativt raskt på isolerte levende celler. I tillegg til å studere cellespesifikke reaksjoner på stress, har denne teknologien potensial til å klargjøre genspesifikke uttrykk og belyse den evolusjonære og utviklingsmessige historien til celletyper som er helt unike for cnidarianere, som calicoblasts og cnidocytes.
Nylig utførte vi en intensiv screening av over 30 cellulære markører som resulterte i å identifisere 24 som er i stand til å merke korallceller, hvorav 16 er nyttige for å skille unikepopulasjoner 18, noe som gjør dem klynger av differensiering (CD). Her beskriver vi prosessen med korallcelleisolasjon i Pocillopora damicornis fra å fjerne celler fra kalsiumkarbonatskjelettet til identifisering og isolering av spesifikke cellepopulasjoner med FACS (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen ble tilpasset fra Rosental et al.18 og utviklet for identifisering og isolering av P. damicornis celler. Metodikken fokuserer på prosessen med filtreringsprøver for å fjerne rusk, ikke-levedyktige celler og Symbiodiniaceae-vertsbaserte celler gjennom undersøkelse av celleintrinsiske faktorer, inkludert relativ cellestørrelse, relativ cellegranularitet, celleautofluorescens og tilstedeværelsen av intakte cellulære membraner. Disse teknikkene kan brukes på andre ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK ønsker å anerkjenne University of Miami Research Awards i naturvitenskap og engineering for finansiering av denne forskningen. BR vil gjerne takke Alex og Ann Lauterbach for finansieringen av Komparativ og evolusjonær immunologilaboratorium. Arbeidet til BR ble støttet av Israelsk Science Foundation (ISF) tall: 1416/19 og 2841/19, og HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vil gjerne takke Zhanna Kozhekbaeva og Mike Connelly for teknisk assistanse. Vi vil også takke University of Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource ved Sylvester Comprehensive Cancer Center for tilgang til FACS cytometer og til Shannon Saigh for teknisk støtte.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
