Summary
サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。
Abstract
サンゴ礁は、人類起源のストレッサーによって脅威にさらされています。これらのストレッサーに対するサンゴの生物学的応答は細胞レベルで起こり得るが、メカニズムはよく理解されていない。ストレッサーに対するサンゴの反応を調べるには、細胞応答を分析するためのツールが必要です。特に、細胞集団がストレスにどのように反応しているかを理解するために、機能アッセイの適用を容易にするツールが必要です。今回の研究では、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、石のサンゴの異なる細胞集団を分離します。このプロトコルには、(1)骨格からのサンゴ組織の分離、(2)単一細胞懸濁液の作成、フローサイトメトリー用の各種マーカーを用いたサンゴ細胞の標識、および(4)ゲーティングおよび細胞選別戦略が含まれる。この方法により、研究者は、さまざまな細胞集団の分析、機能アッセイ、遺伝子発現研究のために、細胞レベルでサンゴに取り組む。
Introduction
サンゴ礁は地球上で最も重要な生態系の一つです。彼らは、魚や無脊椎動物に重要な生息地を提供することによって生物多様性を促進し、観光を通じて食料と経済的生活を提供することによって人類起源のコミュニティを維持するために重要です1.サンゴ礁のキービルダーとして、サンゴの動物(Phylum:Cnidaria)はまた、波と嵐の被害を軽減する大きな炭酸カルシウムフレームワークを作成することにより、沿岸のコミュニティを支援します 2.
大人としてのサンゴは、ウイルス、アルカエア、細菌、プロティスト、真菌、そして最も顕著に、藻類ジノフラゲラートファミリーシンビオダニア科シンビオダニア科のメンバーを含む幅広いendosymbioticパートナーをホストするセシル動物である。環境の変化は、このコミュニティの不均衡を引き起こす可能性があり、多くの場合、共生シンビオジニア科がサンゴのコロニーから追放される病気の流行やサンゴの漂白につながり、サンゴの主要な栄養源を排除します。これらのシナリオの両方は、多くの場合、サンゴのホスト44、5、65の死を6引き起こします。急速な気候変動のような人為的ストレス源の影響は、大量のサンゴの死のイベントを加速し、サンゴ礁の世界的な減少につながっている7.
最近、サンゴ礁の損失を軽減するために、さまざまな方法が開発されています。これらの方法には、既存のサンゴ礁へのサンゴの植え付け、熱的に耐性な遺伝子型を用いた遺伝的交差、およびサンゴ内でホストされる微生物および共生群の細胞操作が,含まれる。これらの努力にもかかわらず、サンゴ細胞の多様性と細胞機能10、11、12、13,12,については、まだまだまだ不明です。10,13サンゴ細胞の多様性と細胞機能を十分に理解することは、サンゴの生物が規範的でストレスの多い条件下でどのように振る舞うかを理解する必要があります。復元と保存の効率を最大化する取り組みは、細胞の多様性と遺伝子機能がどのように結合されているかを理解する上で役立ちます。
細胞の多様性と機能に関する以前の研究は、主に組織学的研究と組織全体RNAサンプリング1414、15、16、1715,16に焦点を17当てていました。サンゴの特定の細胞型機能に関するより詳細な情報を得るためには、生きたサンゴ細胞の特定の集団を単離する方法が必要です。これは、蛍光活性化細胞選別(FACS)フローサイトメトリー技術18によって非古典モデル生物において正常に行われている。FACSは、さまざまな波長に合わせたレーザーの組み合わせを利用して、相対細胞サイズ、細胞粒度、自己蛍光などの単一細胞レベルで異なる内因性細胞特性を測定します。さらに、細胞は、特定の、所望の特性18、19,19を測定するために蛍光標識された化合物によってマークされてもよい。
これまで、サンゴ細胞へのフローサイトメトリーの適用は、主にそれらの強い、自然自家蛍光20、21、22,21,22を利用して共生共生共生共生および他の細菌集団の分析のためであった。FACSはまた、参照モデル生物細胞23,24に対して蛍光DNAマーカーシグナルを用いてサンゴゲノムサイズを24推定するためにも用いられている。FACSの効率的な適用は細胞生物学の研究のために有用である3つの異なったツールを提供する:1)単一細胞の形態学的および機能的記述;2) 下流の研究のための特定の細胞集団の同定、分離および分離;3)単一細胞レベルでの機能アッセイの分析。
サンゴ細胞の研究のための様々な外因性蛍光マーカーの開発と応用はほとんど未踏のままです。そのようなマーカーは、タグ付きタンパク質、酵素のタグ付き基質、または他の化合物に対する蛍光応答を含むことができる。これらのマーカーは、リソソームのような特定の細胞コンパートメント機能の様々な量を生成する細胞を強調するなど、ユニークな特性を持つ細胞タイプを識別するために使用できます。その他の例としては、蛍光標識ビーズを使用して、貪食に適した細胞を機能的に同定すること、または標的病原体25の巻き込みである。免疫応答で活性な細胞の集団は、これらの外因性に適用されたビーズの巻き込み後にFACSによって容易に同定することができる。従来の組織学的方法では、保存された組織とビーズ巻き込みのための細胞陽性の割合を近似するために何時間も必要ですが、病原体の巻き込みのためのFACSベースの機能アッセイは、単離された生きた細胞に比較的迅速に実行することができます。ストレスに対する細胞特異的な反応を研究することに加えて、この技術は、遺伝子特異的発現を解明し、カリコ芽細胞やクニドサイトのような細胞型に完全に特有の細胞型の進化的および発達的歴史を明らかにする可能性を秘めています。
最近では、30以上の細胞マーカーを集中的にスクリーニングし、サンゴ細胞に標識が可能な24個を同定し、そのうち16個はユニークな集団18を区別するのに有用であり、分化クラスター(CD)を作った。ここでは、ポシロポラダミコーンスにおけるサンゴ細胞単離法が炭酸カルシウム骨格から細胞を除去することから、FACSを用いた特定の細胞集団の同定および単離に及ぶ過程について説明する(図1)。
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Protocol
1. エアーブラシとコンプレッサーによるサンゴ骨格からの組織の解離
注:氷の上でステップを実行し、手袋で手を保護します。
- 空気圧縮機、ホース、エアブラシを接続してエアブラシキットを組み立てます(図2)。圧力計を276-483 kPaの間にセットします。
注:この研究に使用される推奨コンプレッサーとエアホースは、393 kPaの最高圧力にプリセットされました。この276-483 kPaの範囲外での使用は、骨格からの不十分な細胞除去または細胞膜の破裂をもたらす可能性がある。この範囲は、種ごとに異なる場合があり、生存率テストを必要とする可能性があります。生存率試験は、単純なヘモサイトメーターと4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染料排除アッセイを用いて、化合物顕微鏡で可視化された細胞スラリーのサブセットで行うことができる。 - オートクレーブで100mLの細胞染色培地を用意し、 滅菌ガラス容器は、3.3倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS;カルシウムおよびマグネシウムなし)の33mLを最終濃度3.3倍、2mLの胎児子牛血清(FCS;30分間56°Cで不活性化)を総体積の2%に、2mLの1M HEPESバッファーを最終濃度20mMに加えた。その後、滅菌水で100 mLでトップオフ。
注:3.3倍のPBS濃度は、Rosental et al.18で示されるように、海水の含量を模倣するために選ばれました。この濃度は、その他の環境で見つかった種が彼らの動物性を模倣するために調整する必要があります。 - 10 mLのセル染色媒体をエアブラシボトル(図2の「F」と表示)に移し、エアブラシコネクタ用のアダプター蓋を取り付けます。
注:より大きな断片や組織層が厚い種は、適切な組織除去のためにより多くの媒体を必要とするかもしれません。 - ここで示す分岐サンゴ種については、ボーンカッターを使用して、約3〜5cmの長さまたは4cm2の面積でサンゴの破片をクリップまたはカットします。
注: サンプルダウンストリームから除去されず、FACS 解析および並べ替えプロセス中にサンプルが汚染されるため、このフラグメントはマクロ藻類やその他の多細胞生物から離れていなければなりません。1 cmのP.ダミコーンの断片は、濾過、染色、洗浄後に約2〜10 x 106個の細胞を与えます。 - サンゴの破片をプラスチック製のコレクションバッグの中に入れ、エアブラシを使って細胞染色媒体をサンゴにスプレーします(図2)。ほとんどのスケルトンが公開されるまで、このプロセスを続行します。コレクション バッグから残りのスケルトンを取り出します。
2. サンゴ組織からの細胞の解離
注:氷の上のすべてのステップを実行し、手袋で手を保護します。
- 40 μm ナイロンセルストレーナーを通してセルスラリーを 50 mL 遠心管にフィルターし、単一のセル懸濁液を得ます。
注:異なる細胞ストレーナーメッシュサイズは、異なる種に適している可能性があります。しかし、サイズが大きいと、破片や細胞塊の通過により、組織解離が不十分になる可能性があります。- 粘液層が厚い検体の場合は、1 mLプラスチックシリンジの殺菌されたプランジャーを使用し、フィルターに対してそっと粉砕して塊を分解し、細胞がストレーナーを通過するのを助けます。ストレーナーとプランジャーを細胞染色媒体で遠心分離管にリンスします。
- 450 x gで4°Cで5分間遠心分離して細胞をペレットにし、上清を取り除き、細胞染色媒体の1 mLで細胞を再懸濁します。
3. 細胞染色
注:氷の上のすべてのステップを実行し、手袋で手を保護します。このプロトコルで紹介されている汚れは表現目的です。代替染色は、異なる濃度およびインキュベーション時間を必要とする。
- 500 μL の再懸濁セルを 5 mL ラウンドボトムチューブに移し、コントロールサンプルとして取っておきます。このアリコートに汚れを加えないで下ろしてください。
- 残りの細胞懸濁液に、0.42 μLの12 mM DAPI生存率染料(材料表)、5μM活性酸素種(ROS)染色の1μL(材料表)、0.2μMリソソーム染色の0.1μL(材料表)を加える。ピペットはよく混合し、光の漂白を防ぐために暗闇の中で30分間氷の上でインキュベートします。
注: DAPI は、FACS マシン上の死んだ細胞の微分格分の DNA 染色と生存性染料として動作するためにこの例で使用されます。これは、DAPIが膜の完全性のために死にかけている細胞に浸透することを前提としています。ROS染色体は520nmの範囲(緑色)で発光し、リソソームマーカーは約668nm(赤色)で発光する。 - 450 x gで4°Cで5分間遠心分離することにより染色した細胞のペレット500 μLを5分間除去し、500 μLの細胞染色媒体でペレットを再懸濁します。新しい5 mLラウンドボトムチューブに移し、氷の上に保管します。
4. FACS の起動
注: レーザーとチャンネルの違いにより、サイトメーターの作成とモデルによって手順が異なる場合があります。このプロトコルでは、405、488、535、および640 nm波長レーザーを有するサイトメーターが使用された。このプロトコルで取り上げたフィルタは、表現用です。代替細胞染色は、異なるフィルタおよびレーザーのセットを必要としてもよい。
- ソーターソフトウェアで新しいプロジェクトテンプレートの作成を開始し、レーザーパネルを選択します。表される染色と自然蛍光の組み合わせについては、4つのレーザー(405、488、535、および640 nm)をすべて選択します。
- 実験で表される各予想色に適したフィルタを選択します。
- DAPI 放出を検出し、生細胞と死んだ細胞の分離を支援するには、DAPI、Hoeschst、パシフィック ブルー フィルターなど、バンドパス (BP) が 450/50 (425-475 nm 範囲) のフィルターを使用します。
- 緑色のROS信号によって放出される光の検出には、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)または緑色蛍光タンパク質(GFP)フィルターなどのBP530/30(波長範囲515-545 nm)のフィルタを使用します。このフィルターは、各セル内のROSの濃度を測定します。
- リソソーム染色発光を検出するために、670/30(655-685 nm範囲)のBPを追加して、アロフィコシアニン(APC)フィルタを追加します。
注:APCチャンネルは、貪食活動の測定を可能にします。このチャネルはまた、家族共生藻科からサンゴ共生藻類によって生成された自己蛍光を検出します。ただし、この信号は、APCフィルタよりも長い波長を持つ追加のチャンネルを使用して分離することができます。 - 最も一般的に使用されるフィコエリセリン、シアニンフィルター(APC-Cy7)など、780/60(750-810 nm範囲)のBPを有するフィルターを含め、共生生物細胞からの極赤色自家蛍光の放出を検出し、アポシンバイオティクス細胞の単離を助ける。
5. FACS の格言のセットアップ
注:ステップは、サイトメーターの作成とモデル、およびサイトメーターと組み合わせた取得プログラムによって異なる場合があります。
- サイトメトリーソフトウェアのプロジェクト実験画面で、散布図を作成し、Y 軸の X 軸と側面散布 (SSC) のメトリックとして前方散布 (FCS) を選択します。
メモ: FCSはセルのサイズと相関し、SSCは粒度と相関します。ほとんどの場合、無傷の細胞よりもサイズが小さいため、ほとんどの破片の除去が可能になります。 - セルサイズと粒度は、特にサンゴでは数桁異なる場合があるため、軸を対数スケールまたは二重指数スケールに設定します(図 3A) 。
6. FACS分析と細胞分離
注: ステップは、サイトメーターの作成とモデルと結合取得プログラムによって異なる場合があります。
- 細胞計のサンプルチャンバーにコントロール(すなわち、未染色細胞サブセット)を配置し、読み取りプロセスを開始する。コンピュータが各セルまたはイベントからデータを受信し始めると、散布図にドットが表示され始めます。以前の実験からサイトメーター室に残っている破片を取り除くために、分析を開始する前に約30 sを通過させる。
- 散布図では、ポイントを中央に配置するために、フォトマルチプライヤ管(PMT)電圧を調整します。
注:PMT電圧は、測定される光子の信号強度を増幅するために使用されます。PMT電圧が弱すぎると、読み取られるセルが少なくなり、PMT電圧が強すぎると、セルは最大値に近い値で測定され、異なるセルタイプは互いに区別できなくなります。適切な PMT 電圧により、独立して識別可能なイベントが散布図に取り込まれます。FSC および SSC 散布図に対数スケールまたは二重指数スケールを投影することで、イベントの分離を視覚化しやすくなります。 - イベントの記録を開始します。サンプルを節約するために、約 15,000 のイベントが読み取られた後でデータ取得を一時停止します。ほとんどの場合、これは、全体的な細胞の母集団パターンを視覚化するのに十分です。小さな特殊な細胞集団を分析し、隔離する場合は、より多くのイベントを記録します。
- FSC および SSC の最初のグラフで、FSC X 軸上の 102マーク以上のセルの選択(ゲート)を作成します。この閾値を下回るものは、細胞の破片である可能性が高い。矩形のゲートを描画します, フローサイトメトリーソフトウェアプログラムの定期的なオプションであり、明確な、明確な細胞集団のために良いです.散布図で不規則な形状を取るセルの母集団の場合は、ポリゴン ゲーティング オプションを使用します。
注:前方散乱の102の最小カットオフは、最小のサンゴ細胞のために選択する必要がありますが、破片の汚染を可能にする可能性があります。これを修正するには、より保守的となるように格言の下限を増やします。 - X 軸に DAPI フィルターを表し、Y 軸に APC-Cy7 フィルターを表す新しい散布図を作成します。これを行うには、手順 6.4 で作成した無傷のセルのゲートを選択し、右クリックして、新しい散布図を作成するオプションを選択します。軸を対数スケールまたは二重指数スケールに調整します。
注: 新しいプロットを作成するために必要な手順は、ソフトウェア プログラムによって異なる場合があります。 - サイトメーターチャンバーからコントロールサンプルを取り出し、染色した細胞と交換します。分析を開始してデータを記録する前に、30 s を渡します。一時停止する前に約 15,000 個のセルを記録します。
注:APC-Cy7スケールの上端の明確な集団は、シンビオジニア科からの高い赤色の自己蛍光を有するものである。これらの集団の中断を視覚化するためにシミは必要なく、コントロールサンプル記録でも見ることができます(図3C)。さらに分化するために、Y軸の低いサンゴのみの集団を選択します。 - アポシンビオティック細胞の新しい散布図を作成してROS濃度(FITCフィルタ)とリソソームに陽性の細胞(APCフィルタ)を視覚化し、対数スケールまたは二重指数スケールを再び利用します。
注: アポシムビオティックである複数の異なる細胞集団がある場合、それぞれが独自の散布図でさらに区別することができます (図 3C,D)。 - コントロールの最初の記録を使用するか、コントロール グループを再挿入して再実行することにより、スタイズされていないサブセットのコントロールと、染色されたサンプル グループを比較します。染色されたサンプルグループに固有のイベントをゲートします。
7. FACS の並べ替えと収集
注:ステップは、サイトメーターの作成とモデル、およびサイトメーターと組み合わせた取得プログラムによって異なる場合があります。
- 収集対象として選ばれた細胞の選択により、細胞の採取チャンバーにマイクロ遠心チューブ(250-500 μLの細胞培養培地またはリシスバッファーを含む)をサイトメーター採取チャンバーに配置します。
注:表現されたフローサイトメーターは、一度に4つの異なる集団を選別することができ、機械は様々な遠心管および96の井戸板を含むさまざまな収集装置を、収容するように構成することができる。 - 細胞メーターがサンプルを読み始め、残骸を洗い流すために適切な時間が経過したら、所望の集団を選別し、20,000個の細胞から数百万個の細胞を収集します。
- 50万個を超える細胞について、細胞培養培地またはリシスバッファーの体積、および収集装置の体積を調整する。
- インビトロ研究では、インキュベーターまたは滅菌環境に入れるまで氷の上に細胞を保管します。
- 分子研究のために、すぐにDNA/RNA/タンパク質の分離プロセスを開始するか、またはフラッシュフリーズし、抽出するまで-80°Cで保存します。
- 新しい染色、種、またはソーターを使用するたびに、少なくとも20,000個の細胞を500μLの染色媒体に選別し、ソートされた細胞を再分析し、最初にソートするために使用されるゲート内で細胞が読み取られていることを確認することによって、関心のある集団の純度チェックを行う(図4)。
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Representative Results
全体的に見て、このプロトコルは機能分析に使用できる生きたサンゴ細胞集団の同定および収集を容易にするので有用である。このワークフローは、サンゴ組織を基になる炭酸カルシウム骨格から機械的に分離することから始まった(図1)。不適切な技術は細胞死亡率が高く、大量の破片を生み出す可能性があるため、これは最も重要な初期ステップの1つです。酵素分離は、組織せん断の増加と高い細胞死亡率をもたらす可能性があるため、推奨されません。エアブラシを用いた機械的分離は、これらの課題を軽減し(図2)、平均細胞死亡率を〜10%に減少させる(データは示さない)。スケルトンからの組織のエアブラシ媒介機械的分離に続いて、得られたスラリーを、細胞ストレーナーを濾過して細胞懸濁液に濾過した。次いで、細胞懸濁液をDNA(DAPI)、ROS、およびリソソームマーカーで染色し、FACSサイトメーターによって読み取った。その後、使用されている細胞マーカーに基づいて特定の細胞集団を単離するための格言戦略が開発されました。ゲート付き細胞集団をコレクションチューブに分類した(図1)。
FACSサイトメーター上のサンプルを分析する際には、サンプルから破片や死んだ細胞を除去するためにいくつかのステップを踏んだ。シンビオジニア科細胞は、自家蛍光のために必要に応じて選択的に除去することができる。まず、サンゴ細胞と同じ形状や粒度を共有していない破片やその他の非細胞粒子を、前方(サイズ)および側面(粒度)散乱にゲーティング選択を作成して解析から除去した(図3A)。次に、死細胞をDAPI染色サンプルと遠赤色チャネルと対比して非染色対照細胞懸濁液を比較し、染色試料中の高DAPI染色用の陽性細胞を格引出した(図3B、細胞集団P6)。並行して、自己蛍光シンビオジニア科をホストする細胞は、遠赤色チャネルにおいて高いシグナルを有する細胞に対して格言することによって除去された(図3B、APC-Cy7)。Bこの反復ゲーティングプロセスの後、分析のための残りの細胞は、シンビオジニア科を欠いている無傷の生きたサンゴ細胞集団を表す。
これらの細胞は、ROS活性および/またはリソソーム含有量などの特徴に外因性染色を加えることによって、コントロールおよび染色サンプルを比較することによって、異なる細胞部分集団に分類することができる(図3C)。例えば、ROS染色フィルターとリソソーム染色フィルターのデータを調べると、サンゴ細胞の4つの異なる亜集団が明らかになった。一方の細胞集団はリソソーム含量(APCフィルタ)に対して比較的低いシグナルを有し、他の3つの細胞集団はリソソーム含量およびROS活性の範囲(FITCフィルタ)の範囲において高いシグナルを有していた(図3C)。これらの各サブ集団は、下流解析のために個別にソートすることも、サイズ、粒度、自己蛍光、DNA含有量の交差によってさらに分析され、より離散的なサブ集団に解析することもできます。本研究では、DNA、ROS活性、リソソーム含量を用いて、サンゴ細胞の広範な特性を同定した。重要なことに、この一般的なプロトコルは、幹細胞などの目的とする特殊な細胞集団の単離に使用できる蛍光マーカーの範囲および特定の抗体プローブに適応することができる。
図1:サンゴ細胞のソートプロセスの一般的なワークフロー。注目のプロトコルは、染色のための骨格からサンゴ細胞を除去することを可能にし、その後、FACSサイトメーターを介して実行され、測定され、分析され、細胞集団に隔離される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:サンゴ骨格からの組織と細胞の除去。空気圧縮機(A)は空気と細胞染色媒体(F)をエアブラシ(E)から強制し、サンゴ骨格(C)から組織を爆破し、袋(D)に細胞スラリーを作り出す。最大空気圧は、空気圧縮機の圧力計(B)によって制御される(A)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生きたサンゴ細胞のゲーティング選択。(A)生細胞は、最小の前方散乱値10 2を用いて、破片から分離した。(B) APC-Cy7フィルターは赤い自己蛍光を同定するために使用され、共生細胞を効果的に分離し、DAPIはDNA染色に対して高陽性の細胞を同定するために使用された。DAPIに対して非常に陽性なものは、死んだ細胞と死んでいる細胞を示すものでした。(C,D)ROS活性およびリソソーム含有量の追加マーカーは、異なるサンゴ細胞集団をさらに区別するために使用された。すべてのデータは、これらのグラフを生成するためにFlowJo(v10)上で再分析されました。挿入された母集団ラベルとパーセントは、ソートされた各母集団の顕微鏡写真(E)に対応する。各プロットに表示されるパーセンテージは、そのプロット内のセルの合計です。右下のスケールバー= 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:自己蛍光シンビジニア科関連細胞の純度チェック(A)未染色対照試料からAPC-Cy7フィルター上の蛍光に陽性の細胞を選別した。(B) この選別された細胞群を細胞計上で再実行し、同じ条件で再分析し、純度94%を示した。前方散布図 (X 軸、FSC) はアンカー軸に使用されましたが、他のパラメータと交換可能です。染色したサンプルにも同じプロセスを行うことができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、ローゼンタールら18から適応され、P.ダミコーンの細胞の同定および単離のために開発された。この方法論は、相対細胞サイズ、相対細胞粒度、細胞自家蛍光、無傷の細胞膜の存在を含む細胞固有因子の検査を通じて、破片、生存不可能な細胞、および共生細胞を除去するためにサンプルをフィルタリングするプロセスに焦点を当てています。これらの技術は、他のサンゴ種に適用することができます。しかし、FACSの格言戦略は、細胞集団特性における種特異的な違いによって異なる可能性がある。
サンゴの健康を理解するためのFACSの有用性は、細胞を差別的に識別し、単離するために多様な細胞固有の要因を使用する能力にあります。また、このプロトコルは、生存率、活性酸素種濃度、およびリソソーム含有量に基づいてサンゴ細胞を分化するための外因性細胞染色の追加使用について説明する。ローゼンタールら18で以前に試験された30+の市販マーカーのうち、24個の標識P.ダミコルニス細胞のうち、16個が微分信号を産生し、細胞亜集団の選択を可能にする分化のクラスターである。
このプロトコルの重要なステップの1つは、組織の塊が解光され、フローサイトメーターの層流を妨げないようにするために、適切な組織除去とフィルタリングです。PMT電圧の適切な調整は、独立した細胞検出イベントの正確な検出と分析に不可欠です。以前の研究18と比較して、エアブラシ機械破壊による基礎骨格からのサンゴ細胞分離のプロセスは、破片を減らし、細胞の生存率を最大にすることによって従来の擦り傷方法(〜90%、図2および図3A)で大幅に改善し、騒音による偽陽性を減らすことによって、その後の分析を改善する。
本論文で述べられた方法論は、これまで不可能なレベルでの形態学的および機能的特性の交差における微分選択を通じて、サンゴ細胞集団の分離を促進する。サンゴ細胞のFACS方法論の開発により、定義された細胞培養の作成や、特定の細胞亜集団に関連するトランスクリプトとエピジェネティックなプロファイルの調査のために、特定の細胞亜集団を選択することが可能になりました。この微細スケール情報の応用により、細胞の種類、挙動、機能に関する洞察が得られ、カリコ芽細胞やcnidocytesなどのクニダリアン特異的な細胞型の進化に関連する特性が明らかになる可能性がある。さらに、FACS技術を改善されたストレスアッセイおよびバイオマーカーの開発に適用することは、深刻な脅威を受けたサンゴ礁の保護に有用であることが証明される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
NTKは、この研究に資金を提供するための自然科学と工学のマイアミ大学研究賞を認めたいと思います.BRは、比較進化免疫学研究所に資金を提供してくれたアレックスとアン・ラウターバッハに感謝したいと思います。BRの研究は、イスラエル科学財団(ISF)番号によって支援されました: 1416/19 と 2841/19, HFSP研究助成金, RGY0085/2019.ザンナ・コゼクバエワとマイク・コネリーの技術支援に感謝します。また、マイアミ大学、ミラー医学部のフローサイトメトリー共有リソースに、シルベスター総合がんセンターのFACSサイトメーターへのアクセスとシャノン・サイグの技術サポートに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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