Summary
Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.
Abstract
Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.
Introduction
Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus1. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern2.
Korallen als Erwachsene sind sessile Tiere, die eine breite Palette von endosymbiotischen Partnern beherbergen, einschließlich Viren, Archaeen, Bakterien, Protisten, Pilze, und vor allem, Mitglieder der Algendinoflagellate Familie Symbiodiniaceae3. Veränderungen in der Umwelt können zu Ungleichgewichten in dieser Gemeinschaft führen, die oft zu Krankheitsausbrüchen und Korallenbleiche führen, bei denen die symbiotischen Symbiodiniaceae aus der Korallenkolonie vertrieben werden, wodurch die Hauptnahrungsquelle für die Korallen beseitigt wird. Beide Szenarien führen oft zum Tod des Korallenwirts4,5,6. Die Auswirkungen anthropogen-induzierter Stressoren, wie der schnelle Klimawandel, beschleunigen die Massensterben von Korallen, was zu einem globalen Rückgang der Korallenriffe führt7.
In jüngster Zeit wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, um den Verlust von Korallenriffen zu mildern. Diese Methoden umfassen die Auspflanzung von Korallen auf bestehenden Riffen, genetische Kreuzung enthäute Genotypen und zelluläre Manipulation der mikrobiellen und symbiotischen Gemeinschaften, die innerhalb derKorallen8,9gehostet werden. Trotz dieser Bemühungen, viel bleibt unbekannt über Korallenzellvielfalt und Zellfunktion10,11,12,13. Ein gründliches Verständnis der Vielfalt und Zellfunktion von Korallenzellen ist notwendig, um zu verstehen, wie sich der Korallenorganismus unter normativen und stressigen Bedingungen verhält. Die Bemühungen, die Wiederherstellungs- und Konservierungseffizienz zu maximieren, werden von einem verbesserten Verständnis der Kopplung von Zellvielfalt und Genfunktion profitieren.
Frühere Arbeiten über Zellvielfalt und Funktion konzentrierten sich in erster Linie auf histologische Studien und Ganzgewebe-RNA-Sampling14,15,16,17. Um mehr Details über die spezifische Zelltypfunktion in Korallen zu erhalten, muss es Methoden für die Isolierung bestimmter Populationen lebender Korallenzellen geben. Dies wurde bei nichtklassischen Modellorganismen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnologie (FACS) erfolgreich durchgeführt18. FACS verwendet eine Kombination von Lasern, die auf unterschiedliche Wellenlängen abgestimmt sind, um verschiedene endogene zelluläre Eigenschaften auf Einzelzellebene zu messen, wie z. B. relative Zellgröße, Zellgranularität und Autofluoreszenz. Zusätzlich können die Zellen durch fluoreszierend markierte Verbindungen gekennzeichnet werden, um spezifische, gewünschte Eigenschaften18,19zu messen.
Bisher war die Anwendung der Durchflusszytometrie auf Korallenzellen hauptsächlich für die Analyse symbiotischer Symbiodiniaceae und anderer Bakterienpopulationen unter Verwendung ihrer starken, natürlichen Autofluoreszenz20,21,22. FACS wurde auch verwendet, um die Größe des Korallengenoms zu schätzen, indem das fluoreszierende DNA-Markersignal im Vergleich zu den Zellen des Referenzmodellorganismus23,24verwendet wurde. Die effiziente Anwendung von FACS bietet drei verschiedene Werkzeuge, die für zellbiologische Studien nützlich sind: 1) morphologische und funktionelle Beschreibung einzelner Zellen; 2) Identifizierung, Trennung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen für nachgelagerte Studien; und 3) die Analyse von funktionellen Assays auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung und Anwendung verschiedener exogener Fluoreszenzmarker für die Untersuchung von Korallenzellen bleibt nahezu unerforscht. Solche Marker können markierte Proteine, markierte Substrate für Enzyme oder fluoreszierende Reaktionen auf andere Verbindungen umfassen. Diese Marker können verwendet werden, um Zelltypen zu identifizieren, die eindeutige Eigenschaften aufweisen, z. B. das Hervorheben von Zellen, die unterschiedliche Mengen eines bestimmten Zellkompartiment-Features erzeugen, z. B. Lysosomen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Perlen zur funktionellen Identifizierung von Zellen, die für die Phagozytose zuständig sind, oder die Verschleierung eines gezielten Erregers25. Populationen von Zellen, die in Immunitätsreaktionen aktiv sind, können von FACS leicht identifiziert werden, nachdem diese exogen aufgetragenen Perlen verschlungen wurden. Während traditionelle histologische Methoden konserviertes Gewebe und viele Stunden benötigen, um den Prozentsatz der Zellen, die positiv für die Perlenverschlangen sind, anzunähern, kann ein FACS-basierter funktioneller Test für die Pathogeneinschließung relativ schnell an isolierten lebenden Zellen durchgeführt werden. Neben der Untersuchung zellspezifischer Reaktionen auf Stress hat diese Technologie das Potenzial, die genspezifische Expression zu klären und die Evolutions- und Entwicklungsgeschichte von Zelltypen zu beleuchten, die für Cnidarier völlig einzigartig sind, wie Calicoblasten und Cnidozyten.
Kürzlich führten wir ein intensives Screening von über 30 zellulären Markern durch, das zur Identifizierung von 24, die Korallenzellen kennzeichnen können, führte, von denen 16 nützlich sind, um einzigartige Populationen18zu unterscheiden, was sie zu Differenzierungsclustern (CD) macht. Hier beschreiben wir den Prozess der Korallenzellisolierung in Pocillopora damicornis von der Entfernung von Zellen aus dem Calciumcarbonat-Skelett bis zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen mit FACS (Abbildung 1).
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Protocol
1. Trennung von Geweben vom Korallenskelett über Airbrush und Kompressor
HINWEIS: Führen Sie Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.
- Montieren Sie den Airbrush-Kit, indem Sie den Luftkompressor, den Schlauch und die Airbrush anschließen (Abbildung 2). Stellen Sie das Manometer zwischen 276-483 kPa ein.
HINWEIS: Der empfohlene Kompressor und Luftschlauch, der für diese Studie verwendet wurde, wurde auf einen maximalen Druck von 393 kPa voreingestellt. Die Verwendung außerhalb dieses 276-483 kPa-Bereichs kann entweder zu einer unzureichenden Zellentfernung aus dem Skelett oder zu einem Bruch der Zellmembranen führen. Dieser Bereich kann für jede Art unterschiedlich sein und kann einen Durchführbarkeitstest erfordern. Ein Durchführbarkeitstest kann mit einer Teilmenge der Zellschlämme mit einem einfachen Hämozytometer und einem 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Farbstoff-Ausschluss-Assay durchgeführt werden, der auf einem zusammengesetzten Mikroskop visualisiert wird. - Bereiten Sie 100 ml Zellfärbemittel in einem autoklavierten, steriler Glasbehälter durch Zugabe von 33 ml 10x phosphatgepufferter Saline (PBS; ohne Calcium und Magnesium) zu einer Endkonzentration von 3,3x, 2 ml fetalem Kalbsserum (FCS; bei 56 °C für 30 min inaktivierte Wärme) bis 2% des Gesamtvolumens und 2 ml 1 M HEPES Puffer bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. Dann auf 100 ml mit sterilem Wasser abtopieren.
HINWEIS: Die 3,3-fache PBS-Konzentration wurde gewählt, um den Salzgehalt von Meerwasser nachzuahmen, wie in Rosental et al.18gezeigt. Diese Konzentration muss für Arten, die in anderen Umgebungen gefunden werden, angepasst werden, um ihren Salzgehalt nachzuahmen. - 10 ml Zellfärbemittel in eine Airbrushflasche (in Abbildung 2mit "F" ) übertragen und den Adapterdeckel für den Airbrush-Anschluss befestigen.
HINWEIS: Größere Fragmente und Arten mit dickeren Gewebeschichten erfordern möglicherweise mehr Medien für eine angemessene Gewebeentfernung. - Für die hier gezeigten verzweigten Korallenarten verwenden Sie einen Knochenschneider, um ein Korallenfragment mit einer Länge von etwa 3 x 5 cm oder einer Fläche von 4cm2 zu beschneiden oder zu schneiden.
HINWEIS: Das Fragment muss frei von Makroalgen und anderen mehrzelligen Organismen sein, da diese nicht aus der nachgelagerten Probe entfernt werden dürfen und die Probe während der FACS-Analyse- und Sortierprozesse kontaminieren. Ein 1 cm großes Fragment von P. damicornis ergibt nach dem Filtern, Färben und Waschen ca. 2x10 x 106 Zellen. - Legen Sie das Korallenfragment in eine Plastiksammeltasche und sprühen Sie mit der Airbrush die Zellfärbungsmedien auf die Koralle (Abbildung 2). Setzen Sie diesen Prozess fort, bis der größte Teil des Skeletts freigelegt ist. Entfernen Sie das restliche Skelett aus der Sammeltasche.
2. Dissoziation von Zellen aus Korallengewebe
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.
- Filtern Sie die Zellschlämme durch ein 40 m langes Nylonzellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
HINWEIS: Verschiedene Zellsieb-Netzgrößen können für verschiedene Arten besser geeignet sein. Größere Größen können jedoch aufgrund von Schmutz und Zellklumpen zu einer unzureichenden Gewebedissoziation führen.- Für Proben mit dickeren Schleimschichten verwenden Sie den sterilisierten Kolben einer 1 ml Kunststoffspritze und schleifen Sie ihn vorsichtig gegen den Filter, um Klumpen aufzubrechen und den Zellen zu helfen, das Sieb zu passieren. Spülen Sie bäuern und kolben mit Zellfärbemedien in das Zentrifugenrohr.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml Zellfärbungsmedien wieder auf.
3. Zellfärbung
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen. Flecken, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Flecken erfordern unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeiten.
- Übertragen Sie 500 l resuspendierte Zellen in ein 5 ml Rundbodenrohr und legen Sie sie als Kontrollprobe beiseite. Fügen Sie diesem Aliquot keinen Fleck hinzu.
- Zur verbleibenden Zellsuspension 0,42 l 12 mM DAPI-Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle), 1 L mit 5 M reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)(Materialtabelle)und 0,1 l mit 0,2 m Lysosom-Färbung(Materialtabelle)hinzufügen. Pipette gut zu mischen und inkubieren auf Eis für 30 min im Dunkeln, um Photobleichmittel zu verhindern.
HINWEIS: DAPI wird in diesem Beispiel verwendet, um als DNA-Färbung und Lebensfähigkeitsfarbstoff für das Differentialgating abgestorbener Zellen auf der FACS-Maschine zu arbeiten. Dies setzt voraus, dass DAPI sterbende Zellen aufgrund der Membranintegrität durchdringt. Der ROS-Fleck strahlt Licht im Bereich von 520 nm (grün) aus, während der lysosomale Marker Licht bei ca. 668 nm (rot) aussendet. - Pellet 500 l der gefärbten Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l Zellfärbungsmedien wieder auf. Auf ein neues 5 ml Rundbodenrohr übertragen und auf Eis lagern.
4. FACS-Start
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers aufgrund von Unterschieden in den Lasern und Kanälen variieren. Für dieses Protokoll wurde ein Zytometer mit 405, 488, 535 und 640 nm Wellenlängenlasern verwendet. Filter, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Zellflecken können einen anderen Satz von Filtern und Lasern erfordern.
- Beginnen Sie mit dem Erstellen einer neuen Projektvorlage für die Sortiersoftware, und wählen Sie das Laserpanel aus. Wählen Sie für die dargestellte Kombination von Flecken und natürlicher Fluoreszenz alle vier Laser (405, 488, 535 und 640 nm) aus.
- Wählen Sie die entsprechenden Filter für jede erwartete Farbe aus, die im Experiment dargestellt wird.
- Um die DAPI-Emission zu erkennen und bei der Trennung von lebenden und abgestorbenen Zellen zu helfen, verwenden Sie einen Filter mit einem Bandpass (BP) von 450/50 (425-475 nm Bereich) wie z. B. einen DAPI-, Hoeschst- oder Pacific Blue-Filter.
- Verwenden Sie für die Detektion von Licht, das durch das grüne ROS-Signal emittiert wird, einen Filter mit einem BP von 530/30 (Wellenlängenbereich von 515-545 nm) wie z. B. einen Fluoresceinisothiocyanat(FITC) oder einen grünen Fluoreszenzproteinfilter (GFP). Dieser Filter misst die Konzentration von ROS in jeder Zelle.
- Fügen Sie einen zusätzlichen Filter mit einem BP von 670/30 (655-685 nm Bereich) wie einem Allophycocyanin (APC) Filter zur Detektion der lysosomalen Fleckenemission hinzu.
HINWEIS: Der APC-Kanal ermöglicht die Messung der phagozytischen Aktivität. Dieser Kanal wird auch die Autofluoreszenz erkennen, die von den Korallensymbiotischen Algen aus der Familie Symbiodiniaceae erzeugt wird. Dieses Signal kann jedoch über einen zusätzlichen Kanal getrennt werden, der eine längere Wellenlänge als der APC-Filter hat. - Schließen Sie einen Filter mit einem BP von 780/60 (750-810 nm Bereich) ein, wie z. B. den am häufigsten verwendeten Phycoerythrin, Cyaninfilter (APC-Cy7), der die Emission von weit-roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae erkennt und bei der Isolierung von aposymbiotischen Zellen hilft.
5. FACS-Gating-Setup
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.
- Erstellen Sie auf dem Projekt-Experimentalbildschirm der Zytometrie-Software ein Streudiagramm und wählen Sie Vorwärtsstreuung (FORWARD Scatter, FCS) als Metrik für die X-Achse und die Seitenstreuung (SSC) für die Y-Achse aus.
HINWEIS: FCS korreliert mit der Größe der Zelle und SSC korreliert mit Granularität. Dies ermöglicht die Entfernung der meisten Trümmer, da die meisten kleiner sein werden als intakte Zellen. - Legen Sie die Achsen auf logarithmische oder biexponentielle Skalen fest, da Die Zellgröße und Die Granularität um mehrere Größenordnungen variieren können(Abbildung 3A), insbesondere bei Korallen.
6. FACS-Analyse und Zellisolierung
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und dem gekoppelten Erfassungsprogramm variieren.
- Legen Sie die Steuerung (d. h. die unbefleckte Zelluntermenge) in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang. Wenn der Computer beginnt, Daten von jeder Zelle oder jedem Ereignis zu empfangen, werden Punkte im Streudiagramm angezeigt. Um die in den Zytometerkammern von früheren Experimenten zurückgelassenen Trümmer zu beseitigen, lassen Sie etwa 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen.
- Passen Sie im Streudiagramm die Photomultiplier-Rohrspannung (PMT) an, um die Punkte zu zentrieren.
HINWEIS: Die PMT-Spannung wird verwendet, um die Signalstärke der gemessenen Photonen zu verstärken; Wenn die PMT-Spannung zu schwach ist, werden weniger Zellen gelesen, und wenn die PMT-Spannung zu stark ist, werden Zellen in der Nähe des Maximalwerts gemessen und verschiedene Zelltypen sind nicht voneinander zu unterscheiden. Eine ausreichende PMT-Spannung stellt sicher, dass unabhängig voneinander unterscheidbare Ereignisse das Streudiagramm auffüllen. Die Ereignistrennung ist durch das Projizieren logarithmischer oder biexponentiver Skalen auf FSC- und SSC-Streudiagramme einfacher zu visualisieren. - Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Um das Beispiel zu erhalten, halten Sie die Datenerfassung an, nachdem etwa 15.000 Ereignisse gelesen wurden. In den meisten Fällen ist dies ausreichend, um die gesamten Zellpopulationsmuster zu visualisieren. Zeichnen Sie weitere Ereignisse auf, wenn kleine, spezialisierte Zellpopulationen analysiert und isoliert werden.
- Erstellen Sie im ersten Diagramm von FSC und SSC eine Auswahl oder ein Tor der Zellen um die 102-Markierung und höher auf der FSC-X-Achse. Alles, was unter dieser Schwelle liegt, ist wahrscheinlich zellulärer Schutt. Zeichnen Sie rechteckige Tore, was eine regelmäßige Option auf Durchflusszytometrie-Softwareprogramme und gut für klare, unterschiedliche Zellpopulationen ist. Verwenden Sie für Zellpopulationen, die eine unregelmäßigere Form in den Streudiagrammen annehmen, eine polygonale Gating-Option.
HINWEIS: Eine minimale Abschaltung von 102 auf der vorderen Streuung sollte für die kleinsten Korallenzellen ausgewählt werden, kann aber eine Kontamination von Schmutz ermöglichen. Um dies zu ändern, erhöhen Sie die untere Grenze der Gating, um konservativer zu sein. - Erstellen Sie ein neues Streudiagramm, das den DAPI-Filter auf der X-Achse und den APC-Cy7-Filter auf der Y-Achse ausdrückt. Wählen Sie dazu das Tor für intakte Zellen aus, die in Schritt 6.4 erstellt wurden, mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Option zum Erstellen eines neuen Streudiagramms aus. Passen Sie die Achsen entweder an logarithmische oder biexponentielle Skalen an.
HINWEIS: Die Schritte, die zum Erstellen eines neuen Plots erforderlich sind, können je nach Softwareprogramm variieren. - Entfernen Sie nun die Kontrollprobe aus der Zytometerkammer und ersetzen Sie sie durch die gebeizten Zellen. Lassen Sie 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen und die Daten aufzeichnen. Zeichnen Sie etwa 15.000 Zellen auf, bevor Sie anhalten.
HINWEIS: Die unterschiedlichen Populationen am oberen Ende der APC-Cy7-Skala sind solche mit hoher roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae. Es ist kein Fleck erforderlich, um diese Bevölkerungsbrüche zu visualisieren, und sie können auch auf der Kontrollstichprobenaufzeichnung angezeigt werden (Abbildung 3C). Wählen Sie für die Korallenpopulationen, die niedriger auf der Y-Achse, für eine weitere Differenzierung. - Erstellen Sie ein neues Streudiagramm der aposymbiotischen Zellen, um die ROS-Konzentrationen (FITC-Filter) und die Zellen positiv auf Lysosomen (APC-Filter) zu visualisieren, wobei wiederum logarithmische oder biexponentielle Skalen verwendet werden.
ANMERKUNG: Wenn es mehrere verschiedene Zellpopulationen gibt, die aposymbiotisch sind, kann jede in ihrem eigenen Streudiagramm weiter unterschieden werden (Abbildung 3C,D). - Vergleichen Sie die gebeizte Stichprobengruppe mit der steuerelemente, nicht befleckte Teilmenge, indem Sie entweder die erste Aufzeichnung der Kontrollprobe verwenden oder die Kontrollgruppe erneut einfügen und erneut ausführen. Gate die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind.
7. FACS Sortierung und Sammlung
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.
- Mit einer Auswahl von Zellen, die zum Sammeln ausgewählt wurden, legen Sie Mikrozentrifugenröhren (mit 250 bis 500 L Zellkulturmedien oder Lysepuffer basierend auf der Anzahl der gesammelten Zellen und der Methode der Lagerung) in die Zytometer-Sammlungskammer.
HINWEIS: Das dargestellte Durchflusszytometer ist in der Lage, vier verschiedene Populationen gleichzeitig zu sortieren, und die Maschine kann so konfiguriert werden, dass sie eine Vielzahl von Sammelgeräten, einschließlich verschiedener Zentrifugenrohre und 96 Brunnenplatten, aufnehmen kann. - Sobald das Zytometer beginnt, die Probe zu lesen und eine angemessene Zeit verstrichen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Populationen und sammeln sie überall von 20.000 Zellen bis zu mehreren Millionen.
- Passen Sie bei mehr als 500.000 Zellen die Lautstärke der Zellkulturmedien oder des Lysepuffers und die Lautstärke des Sammelgeräts an.
- Für In-vitro-Studien speichern Sie Zellen auf Eis, bis sie in einem Inkubator oder einer sterilisierten Umgebung platziert werden.
- Für molekulare Studien beginnen Sie entweder sofort den DNA/RNA/Protein-Isolationsprozess oder blitzen sie ein und lagern bei -80 °C bis zur Extraktion.
- Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, führen Sie eine Reinheitsprüfung der Interessenpopulation durch, indem sie mindestens 20.000 von Interesse bewarbige Zellen in 500 l Färbemedien sortieren, dann die sortierten Zellen erneut analysieren und bestätigen, dass die Zellen innerhalb des Tores gelesen werden, das zum ersten Sortieren verwendet wurde (Abbildung 4).
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Representative Results
Insgesamt ist dieses Protokoll nützlich, da es die Identifizierung und Sammlung von lebenden Korallenzellpopulationen erleichtert, die für funktionelle Analysen verwendet werden können. Der Arbeitsablauf begann mit der mechanischen Trennung von Korallengeweben vom darunter liegenden Calciumcarbonatskelett (Abbildung 1). Dies ist einer der wichtigsten ersten Schritte, da unsachgemäße Technik zu einer hohen Zellsterblichkeit führt und große Mengen an Schutt verursachen kann. Enzymatische Trennung wird nicht empfohlen, da sie zu einer erhöhten Gewebescherung und einer hohen Zellsterblichkeit führen kann. Die mechanische Trennung mit einer Airbrush reduziert diese Herausforderungen (Abbildung 2),wodurch die durchschnittliche Zellsterblichkeit auf 10 % reduziert wird (Daten werden nicht angezeigt). Nach der mit Airbrush vermittelten mechanischen Trennung von Geweben vom Skelett wurde die resultierende Gülle durch Filtration durch ein Zellsieb zu einer Zellsuspension gefiltert. Die Zellsuspension wurde dann mit DNA (DAPI), ROS und Lysosome-Markern gefärbt und vom FACS-Zytometer gelesen. Anschließend wurde eine Gating-Strategie entwickelt, um bestimmte Zellpopulationen basierend auf den verwendeten Zellmarkern zu isolieren. Gated Zellpopulationen wurden dann in Sammelrohre sortiert (Abbildung 1).
Bei der Analyse von Proben auf dem FACS-Zytometer wurden mehrere Schritte unternommen, um Trümmer und abgestorbene Zellen aus der Probe zu entfernen. Symbiodiniaceae-Zellen könnten aufgrund ihrer Autofluoreszenz selektiv entfernt werden, wenn dies gewünscht wird. Erstens wurden Trümmer und andere nichtzelluläre Partikel, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie Korallenzellen hatten, aus den Analysen entfernt, indem eine Gating-Auswahl auf der vorwärts gerichteten (Größe) und seitlichen (Granularität) Streuung erstellt wurde(Abbildung 3A). Als nächstes wurden abgestorbene Zellen ausgeschlossen, indem die ungefleckte Kontrollzellsuspension mit der DAPI-gefleckten Probe und dem weitroten Kanal verglichen und dann die positiven Zellen für eine hohe DAPI-Färbung in der gebeizten Probe ausgegoben wurden(Abbildung 3B, Zellpopulation P6). Parallel dazu wurden Zellen, die autofluoreszierende Symbiodiniaceae hosten, durch Gating gegen Zellen mit einem hohen Signal im fernroten Kanal entfernt(Abbildung 3B, APC-Cy7). Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen für Analysen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodiniaceae dar.
Diese Zellen könnten dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem die Kontroll- und gefärbten Proben verglichen werden, indem exogene Flecken für Merkmale wie ROS-Aktivität und/oder Lysomgehalt hinzugefügt werden (Abbildung 3C). Bei der Untersuchung der Daten zu den ROS- und Lysosome-Färbungsfiltern wurden beispielsweise vier unterschiedliche Subpopulationen von Korallenzellen aufgedeckt. Eine Zellpopulation hatte ein relativ niedriges Signal für den lysosomalen Gehalt (APC-Filter) und die anderen drei hatten ein hohes Signal im lysosomalen Gehalt und einen Bereich der ROS-Aktivität (FITC-Filter) (Abbildung 3C). Jede dieser Subpopulationen kann einzeln für nachgelagerte Analysen sortiert oder durch den Schnittpunkt von Größe, Granularität, Autofluoreszenz und/oder DNA-Gehalt weiter analysiert und in diskretere Subpopulationen analysiert und analysiert werden. In dieser Studie wurden DNA, ROS-Aktivität und lysosomale randalanischer Gehalt verwendet, um breite Eigenschaften von Korallenzellen zu identifizieren. Wichtig ist, dass dieses allgemeine Protokoll an eine Reihe von Fluoreszenzmarkern sowie an spezifische Antikörpersonden angepasst werden kann, die in Verbindung mit der Isolierung spezialisierter Zellpopulationen von Interesse wie Stammzellen verwendet werden können.
Abbildung 1: Der allgemeine Workflow des Korallenzellsortierprozesses. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Entfernung von Korallenzellen aus dem Skelett zur Färbung, die dann durch das FACS-Zytometer geführt, gemessen, analysiert und in Zellpopulationen isoliert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Entfernung von Gewebe und Zellen aus dem Korallenskelett. Der Luftkompressor (A) erzwingt Luft- und Zellfärbemedien (F) aus der Airbrush (E) und arbeitet daran, das Gewebe aus dem Korallenskelett (C) zu sprengen und erzeugt eine Zellschlämme im Beutel (D). Der maximale Luftdruck wird durch das Manometer (B) am Luftkompressor (A )gesteuert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gating-Auswahl von lebenden Korallenzellen. (A) Lebende Zellen wurden mit einem minimalen Vorwärtsstreuwert von 102von Schutt isoliert. (B) Der APC-Cy7-Filter wurde verwendet, um rote Autofluoreszenz zu identifizieren, wodurch die symbiont-gehosteten Zellen effektiv getrennt wurden, während DAPI verwendet wurde, um Zellen zu identifizieren, die sehr positiv für die DNA-Färbung sind. Die sehr positiven Für DAPI waren Anzeichen für tote und sterbende Zellen. (C,D) Zusätzliche Marker für die ROS-Aktivität und den Lysomgehalt wurden verwendet, um verschiedene Korallenzellpopulationen weiter zu unterscheiden. Alle Daten wurden später auf FlowJo (v10) neu analysiert, um diese Diagramme zu generieren. Das eingefügte Populationsetikett und Prozent entspricht den mikroskopischen Fotos jeder sortierten Population (E). Die in jedem Diagramm angezeigten Prozentsätze sind die Gesamtzellen innerhalb dieses Diagramms. Untere rechte Skala Bar = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Reinheitsprüfung der autofluoreszierenden Symbiodiniaceae-assoziierten Zellen. (A) Zellen, die für die Fluoreszenz am APC-Cy7-Filter aus der unbefleckten Kontrollprobe positiv sind, wurden sortiert. (B) Diese sortierte Gruppe von Zellen wurde dann auf dem Zytometer erneut ausgeführt und unter den gleichen Bedingungen neu analysiert, was eine Reinheit von 94 % zeigte. Vorwärtsstreuung (X-Achse, FSC) wurde für die Verankerungsachse verwendet, ist aber mit einem der anderen Parameter austauschbar. Derselbe Prozess kann an gefärbten Proben durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.18 adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen. Diese Techniken können auf andere Korallenarten angewendet werden. FACS-Gating-Strategien können jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede in den Zellpopulationsmerkmalen variieren.
Der Nutzen von FACS für das Verständnis der Korallengesundheit liegt in seiner Fähigkeit, verschiedene zellinsinelle Faktoren zu verwenden, um Zellen differenziell zu identifizieren und zu isolieren. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die zusätzliche Verwendung von exogenen zellulären Färbungen, um Korallenzellen basierend auf Lebensfähigkeit, reaktiver Sauerstoffspezies Konzentration und Lysomgehalt zu unterscheiden. Von den über 30 kommerziellen Markern, die früher in Rosental etal. 18getestet wurden, markierten 24 P. damicornis-Zellen, von denen 16 Differentialsignale erzeugten, Differenzierungscluster, die die Auswahl von Zellsubpopulationen ermöglichen würden.
Einer der entscheidenden Schritte dieses Protokolls ist die richtige Gewebeentfernung und -filterung, um sicherzustellen, dass Gewebeklumpen dissoziiert werden und den laminaren Fluss des Durchflusszytometers nicht blockieren. Die richtige Einstellung der PMT-Spannung ist entscheidend für die genaue Erkennung und Analyse unabhängiger Zelldetektionsereignisse. Im Vergleich zu früheren Arbeiten18verbessert der Prozess der Korallenzellisolierung vom zugrunde liegenden Skelett über die mechanische Störung der Airbrush die herkömmlichen Abkratzmethoden erheblich, indem es den Schmutz reduziert und die Zelllebensfähigkeit maximiert (90 %, Abbildung 2 und Abbildung 3A),wodurch nachfolgende Analysen verbessert werden, indem falsche Positive aufgrund von Rauschen reduziert werden.
Die in diesem Papier beschriebene Methodik erleichtert die Trennung von Korallenzellpopulationen durch Differentialauswahl auf einem Schnittpunkt morphologischer und funktioneller Merkmale auf einer zuvor nicht möglichen Ebene. Mit der Entwicklung von FACS-Methoden für Korallenzellen ist es nun möglich, spezifische Zellsubpopulationen für die Bildung definierter Zellkulturen sowie für die Untersuchung von transkriptomischen und epigenetischen Profilen auszuwählen, die mit bestimmten Zellsubpopulationen assoziiert sind. Die Anwendung dieser detaillierten Informationen wird Einblicke in Zelltyp, Verhalten und Funktion geben und Kann Merkmale aufdecken, die mit der Entwicklung von cnidarian-spezifischen Zelltypen wie Calicoblasten und Cnidozyten verbunden sind. Darüber hinaus kann sich die Anwendung der FACS-Technologie bei der Entwicklung verbesserter Stress-Assays und Biomarker als nützlich für den Schutz stark bedrohter Korallenriffe erweisen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
NTK möchte die University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering für die Finanzierung dieser Forschung würdigen. Der BR dankt Alex und Ann Lauterbach für die Finanzierung des Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Die Arbeit des BR wurde von der Israel Science Foundation (ISF) Unterstützt: 1416/19 und 2841/19, und HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Wir danken Zhanna Kozhekbaeva und Mike Connelly für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der University of Miami, der Flow Cytometry Shared Resource der Miller School of Medicine am Sylvester Comprehensive Cancer Center für den Zugang zum FACS-Zytometer und Shannon Saigh für technische Unterstützung bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
References
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